Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Структура и свойства фосфатидных кислот 8
1.2. Метаболизм фосфатидных кислот в растительной клетке 10
1.2.1 .Синтез фосфатидных кислот в клетке 10
1.2.1.1. Синтез фосфатидных кислот путем ацилирования 10
1.2.1.2. Фосфолипаза D зависимый путь синтеза фосфатидных кислот 17
1.2.1.3. Синтез фосфатидных кислот при участии диацилглицеринкиназы 24
1.2.1.4. Синтез фосфатидных кислот при участии диацилглицеринпирофосфатазы 26
1.2.2. Деградация фосфатидных кислот в растительной клетке 28
1.2.2.1. Деградация фосфатидных кислот при участии фосфатидатфосфатазы 28
1.2.2.2. Фосфорилирование фосфатидных кислот при участии фосф атид аткиназы 29
1.2.2.3. Деацилирование фосфатидных кислот при участии фосфолипаз А 30
1.3. Участие фосфатидных кислот в клеточных процессах 31
1.3.1. Вовлечение фосфатидных кислот в сигнальные процессы 31
1.3.2. Формирование мембранных везикул с участием фосфатидных кислот 35
1.3.3. Участие фосфатидных кислот в синтезе липидных молекул 38
1.4. Механизмы участия фосфатидных кислот в процессах сигнальной трансдукции в растительной клетке 40
1.5. Ионофоры 44
Глава 2. Экспериментальная часть 50
2.1. Растительный материал и его подготовка 50
2.2. Получение препарата микросомальной фракции корней и колеоптилей кукурузы 50
2.3.1. Очистка плазмалеммы в двухфазной системе 51
2.3.2. Выделение эндомембран в градиенте плотности сахарозы 51
2.4. Подготовка препаратов фосфатидных кислот 52
2.5. Регистрация транспорта ионов через везикулярные мембраны 52
2.5.1. Регистрация транспорта ионов Са с использованием зонда индо-1 53
2.5.2. Анализ транспорта ионов Са2+ и Mg2+ с использованием зонда ХТЦ 53
2.6. Анализ протонофорных свойств фосфатидных кислот 54
2.7. Определение количества ионов кальция 54
2.8. Анализ состава и содержания фосфолипидов, экстрагированных из микросомальной фракции корней и колеоптилей кукурузы 54
2.8.1. Экстракция липидов 55
2.8.2. Разделение липидов на колонке с силикагелем 55
2.8.3. Разделение фосфолипидов методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии 56
2.8.4. Денситометрическое определение фосфолипидов 56
2.8.5. Анализ жирных кислот 56
2.8.5.1. Получение метиловых эфиров жирных кислот 56
2.8.5.2. Разделение метиловых эфиров жирных кислот методом капиллярной газовой хроматографии 57
2.9. Предобработка колеоптилей и корней БАП и КС1 58
2.10. Определение содержания белка методом Bradford 58
2.11. Статистическая обработка результатов 58
2.12. Реактивы 59
Глава 3. Результаты и их обсуждение 60
3.1. Изучение проницаемости везикул плазмалеммы и эндомембран 60
3.2. Влияние фосфатидной кислоты на кальциевую проницаемость плазмалеммы и эндомембран 64
3.3. Влияние фосфатидной кислоты на транспорт протонов 71
3.4. Анализ жирнокислотного состава фосфатидных кислот, фосфатидилхолинов и фосфатидилэтаноламинов микросомальной фракции корней и колеоптилей проростков кукурузы 73
3.5. Анализ ионофорных свойств фосфатидной кислоты 76
3.6. Влияние БАП на соотношения фосфатидных кислот, фосфатидилхолинов и фосфатидилэтаноламинов в микросомальной фракции корней и колеоптилей кукурузы 88
3.7. Влияние БАП на жирнокислотный состав фосфатидных кислот, фосфатидилхолинов и фосфатидилэтаноламинов в микросомальной фракции корней и колеоптилей кукурузы 92
3.8. Влияние КС1 на соотношение фосфатидных кислот, фосфатидилхолинов и фосфатидилэтаноламинов в микросомальной фракции корней и колеоптилей кукурузы 97
3.9. Влияние КС1 на жирнокислотный состав фосфатидных кислот, фосфатидилхолинов и фосфатидилэтаноламинов в микросомальной фракции корней и колеоптилей кукурузы 101
Заключение 106
Выводы
Список литературы 112
- Синтез фосфатидных кислот путем ацилирования
- Вовлечение фосфатидных кислот в сигнальные процессы
- Получение препарата микросомальной фракции корней и колеоптилей кукурузы
- Влияние фосфатидной кислоты на кальциевую проницаемость плазмалеммы и эндомембран
Введение к работе
Фосфатидные кислоты (ФК) являются простейшими фосфолипидами мембран. Именно они служат ключевыми метаболитами глицеролипидов (Athenstaedt, Daum, 1999; Somerville et al., 2000). В различных сигнальных путях фосфатидные кислоты могут выполнять функции вторичных посредников липидной природы. Показано участие ФК в гормональной регуляции (АБК и этилена) роста и развития растений, в реакциях на биотические и абиотические стрессы, такие как: механические повреждения, водный, солевой и окислительный стресс, действие патогенов, элиситоров. Механизмы действия фосфатидных кислот разнообразны. Несмотря на это, участие ФК в клеточных процессах изучено слабо. Известно, что фосфатидаты способствуют связыванию с плазмалеммой и повышение активности ферментов таких, как: НАДФН-оксидаза, киназ МАРК-каскада, участвующих в трансдукции этиленового сигнала, кальций-зависимых протеинкиназ (McPhail et al., 1999; Lee et al., 2001; Sang et al., 2001). Изменение уровня фосфатидных кислот может приводить к изменению физических свойств мембран и их способности образовывать везикулы. Тем самым фосфатидаты могут участвовать в везикулярном транспорте, в процессах экзо- и эндоцитоза.
В работах Putney et al (1980) и Salmon et al (1980) было показано, что фосфатидные кислоты обладают способностью транспортировать ионы Са2+ через мембраны мышечных и нервных клеток. Можно предположить, что и в клетках растений фосфатидные кислоты также обладают ионофорными свойствами. А транспорт ионов через мембраны клеточных органелл является одним из механизмов действия фосфатидных кислот в сигнальных каскадах и различных клеточных процессах.
Большое внимание уделяется исследованию роли фосфолипаз и ФК как ключевых звеньев в реализации действия фитогормонов в растительной клетке. Известно, что фосфолипаза D и ФИ-фосфолипаза С являются основными семействами ферментов, генерирующих ФК. В работах Wang и др. (2006), Munnik (2001) и других представлены различные модели механизмов участия фосфолипаз и
фосфатидных кислот в реакциях клеток на стрессы и гормоны. Однако особый интерес представляют работы проведенные группой Романова (2003) и группой Kravets (2004) по изучению передачи цитокининового сигнала от рецептора до гена. Их результаты косвенно указывают на возможное участие фосфолипазы D в трансдукции цитокининового сигнала. В связи с этим изучение роли фосфатидных кислот в данном сигнальном пути представляется актуальным.
Таким образом, изучение ионофорных функций ФК, как одного из возможных механизмов участия в клеточных процессах и участие фосфатидатов в гормональной регуляции в растительной клетке являются необходимыми и важными в понимании различных этапов сигнальных каскадов в клетках растений.
В связи с этим, целью исследования было изучить сигнальные функции фосфатидных кислот в растительной клетке.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
1. Исследовать способность фосфатидных кислот транспортировать ионы
кальция через мембраны везикул растительных клеток;
Изучить протонофорные свойства фосфатидных кислот на везикулах эндомембран, выделенных из колеоптилей проростков кукурузы;
Определить жирнокислотный состав и содержание фосфолипидов в микросомальной фракции корней и колеоптилей кукурузы;
Выявить роль фосфатидных кислот в передаче цитокининового сигнала;
Исследовать роль фосфатидных кислот в трансдукции осмотического сигнала.
Синтез фосфатидных кислот путем ацилирования
Глицерин-3-фосфатный путь - это универсальный путь формирования ФК, представлен у всех живых организмов от бактерий до млекопитающих, включая растения и грибы. Ферменты, необходимые для дигидроксиацетонфосфатного пути присутствуют только у грибов и животных (Athenstaedt, Daum, 1999; Athenstaedt et al., 1999). Субстратом в глицерин-3-фосфатном пути является глицерин-3-фосфат. Первый шаг синтеза ФК по данному пути - это ацилирование глицерин-3-фосфата при участии глицерин-3-фосфатацилтрансферазы с образованием 1-ацил-глицеринфосфата, который так же известен как лизофосфатидная кислота (лизоФК). Последующее ацилирование лизоФК ведет к образованию ФК (Andrews et al., 1985; Athenstaedt, Daum, 1999).
В дигидроксиацетонфосфатном пути основными являются также реакции ацилирования. Предшественником в пути выступает - дигидроксиацетонфосфат. Первый интермедиат преобразуется в 1-ацилдигидроксиацетонфосфат. Данная реакция осуществляется при активации фермента дигидроксиацетонфосфатацилтрансферазы. Далее 1 -ацил-дигидроксиацетонфосфат преобразуется в лизоФК в результате НАДФН-зависимой реакции, при активации фермента 1-ацил-дигидроксиацетонфосфат редуктазы (Agranoff, Hajra, 1971). Следующим шагом и конечным этапом синтеза ФК является ацилирование. Реакция катализируется 1-ацил-глицерин-З-фосфатацилтрансферазой (Athenstaedt, Daum, 1999; Athenstaedt et al., 1999; Neal, 2006). Таким образом, каждый из двух путей синтеза ФК, это двухэтапное ацилирование sn-глицерин-З-фосфата или дигидроксиацетонфосфата (Athenstaedt, Daum, 1997; Athenstaedt et al., 1999).
Лимитирующей реакцией в синтезе ФК является первое ацилирование, которое катализируется глицерин-3 -фосфатацилтрансферазой или дигидроксиацетонфосфатацилтрансферазой. Продукты этих реакций (лизоФК или 1-ацил-дигидроксиацетонфосфат) не накапливаются в стандартных условиях в клетке. Физиологической причиной этой регуляции является то, что большое количество этих веществ ведет к разрушению мембраны (Athenstaedt, Daum, 1999). В клетках растений предшественником в синтезе ФК выступает глицерин-3-фосфат (Gurr, 1980), который образуется в результате двух процессов. Во-первых, в ходе гликолиза при восстановлении дигидроксиацетонфосфата под действием цитоплазматического НАДФ-зависимого фермента глицеринфосфатдегидрогеназы. И, в меньшей степени, путем фосфорилирования глицерина при активации глицеринкиназы (Страйер, 1984; Andrews et al., 1985; Lehninger et al., 2004). Другими предшественниками в синтезе ФК являются жирные кислоты, синтез которых будет рассмотрен отдельно.
В растительных клетках ферменты ацилирования (глицерин-3 фосфатацилтрансфераза и 1-ацил-глицерин-З-фосфатацилтрансфераза)
локализованы в трех компартментах. Известны растворимая ацилирующая система, присутствующая в хлоропластах и две мембранно-связанные, локализованные в ЭР и митохондриях (Athenstaedt, Daum, 1999).
Три фермента глицерин-3-фосфатацилтрансфераз растительных клеток - это три различных белка. Митохондриальная глицерин-3-фосфатацилтрансфераза расположена на внешней мембране митохондрий. Ацилирование в ЭР связано с цитозольным участком мембраны, где соответственно находится фермент. Микросомальный фермент существует в 3 изоформах с молекулярными массами 70 кДа, 60 кДа и 54 кДа. Фермент глицерин-3-фосфатацилтрансфераза, выделенный из хлоропластов имеет молекулярную массу около 50 кДа и локализован в строме (Andrews etal., 1985).
Фермент глицерин-3-фосфатацилтрансфераза проявляет специфичность к субстрату. Показано, что фермент глицерин-3-фосфатацилтрансфераза выделенный из хлоропластов арабидопсиса играет важную роль в определении степени насыщенности фосфолипидов, с предпочтением ненасыщенных ЖК (Athenstaedt, Daum, 1999).
Для ферментов 1-ацил-глицерин-З-фосфатацилтрансфераз характерна локализация в трех компартментах, что и для глицерин-3-фосфатацилтрансфераз. Однако все 1-ацил-глицерин-З-фосфатацилтрансферазы являются мембранно-связанными ферментами (Andrews et al., 1985). Ферменты катализируют реакцию присоединения ЖК в sn-2 позиции глицерин-3-фосфата. 1-ацилглицерин-З-фосфатацилтрансфераза проявляет специфичность к ЖК субстратам. Хлоропластный фермент использует в качестве субстрата только (ненасыщенные) С16 ЖК, тогда как 1-ацил-глицерин-З-фосфатацилтрансферазы, связанные с мембранами ЭР или митохондрий, утилизируют С18 ЖК. Мембранно-связанная 1-ацил-глицерин-3-фосфатацилтрансфераза, выделенная из микросом имеет молекулярную массу около 32 кДа. Это полипептид, характеризуется наличием 4 трансмембранных доменов. Остальные 1-ацил-глицерин-З-фосфатацилтрансферазы не определены (Athenstaedt, Daum, 1999). В результате того, что в растительных клетках ферменты синтеза ФК локализованы в трех компартментах, дисфункция одного из них не будет являться причиной остановки синтеза, что характерно для животных клеток. Однако возникающие дефекты ацилтрансфераз могут служить причиной изменений молекулярного вида ФК. Такой эффект может привести к формированию фосфолипидов с иными молекулярными свойствами, которые отличаются от синтезируемых при стандартных условиях (Athenstaedt, Daum, 1999).
В животных клетках протекают два пути синтеза ФК. Ферменты синтеза локализованы в митохондриях, микросомах и пероксисомах (рис. 2). В митохондриях в качестве субстрата присутствует глицерин-3-фосфат, поэтому возможно протекание только глицерин-3-фосфатного пути. Митохондриальная глицерин-3-фосфатацилтрансфераза имеет молекулярную массу 85 кДа. Фермент использует как субстрат ЖК пальмитоил-КоА.
В пероксисомах в качестве предшественника синтеза ФК выступает дигидроацетонфосфат. В микросомах оба предшественника синтеза ФК -дигидроацетонфосфат и глицерин-3-фосфат могут вовлекаться в синтез. Известно, что в ЭР активность 1-ацил-глицерин-З-фосфатацилтрансферазы в 10 раз выше, чем в митохондриях (Athenstaedt, Daum, 1997). Дигидроксиацетонфосфатный путь синтеза ФК у животных служит источником синтеза липидных эфиров.
У грибов, также как и у животных протекают два пути синтеза ФК (рис. 2.). Ферменты, вовлеченные в синтез, располагаются в ЭР, митохондриях и липидных частицах (компартменты, сформированные из нейтральных липидов, которые окружены фосфолипидным монослоем с небольшим количеством белков). Наиболее высокая активность ферментов ацилирования глицерин-3-фосфата у грибов была найдена во фракции липидных частиц. Известно, что в клетках грибов ФК, синтезируемая через дигидроацетонфосфатный путь, является предшественником для синтеза триацилглицеринов (Athenstaedt, Daum, 1997; Athenstaedt et al., 1999).
Существование нескольких путей, а также мест локализаций синтеза ФК в клетках растений, животных и грибов объясняется функциями ФК. Она является предшественником всех глицеролипидов, включая триацилглицерины, фосфолипиды и галактолипиды.
Вовлечение фосфатидных кислот в сигнальные процессы
Сигнальные пути, в которые вовлекаются ФК, относятся к фосфолипазным (Munnik, 2001; Testerink, Munnik, 2005). При активации мембранных рецепторов, реагирующих на химические или физические воздействия (гормоны, патогены, механическое воздействие) напрямую или через G-белок активируется ФЛО и ФЛС. В этом пути фосфолипазы функционируют как эффекторные ферменты, передавая внеклеточную информацию через ФК. Фосфатидат в данном случае выступает как вторичный мессенджер (рис. 10). Увеличение уровня ФК в клетках наблюдается в течение нескольких минут после появления сигнала. Синтезируемые молекулы ФК химически различны, т.к. субстратами для них служат фосфолипиды, имеющие различный набор жирных кислот. С этим связано разнообразие процессов, в которых участвуют ФК. Кроме того, различные виды ФК имеют различные места локализации и мишени, что также обеспечивает разнообразие выполняемых ими функций.
Особо интересно влияние абсцизовой кислоты (АБК) на растительную клетку. Показано, что АБК вовлекается в различные метаболические процессы, протекающие в клетках растений, такие как: открывание - закрывание устьиц, поддержание гомеостаза при стрессовых ситуациях (обезвоживание, солевой стресс, низкотемпературный стресс). При изучении механизмов действия АБК исследуются различные сигнальные системы. Показано, что одной из таких систем принимающей участие в трансдукции сигнала АБК является ФЛБ сигнальная система. Показано, что в клетках бобов АБК вызывает экспрессию генов, кодирующих ФІЮ (Ryu, Wang, 1995). В листовых дисках табака, обработанных АБК, повышается активность ФЛБ. Увеличение уровня ФЛБ возможно коррелирует с переходом ее из растворимой фракции в микросомальные мембраны (Munnik, 2001).
Движение устьиц. ФЛЕ) и ее продукт ФК играют важную роль в регуляции АБК движений устьиц. На протопластах замыкающих клеток устьиц Viciafaba показано, что первичные спирты (ингибиторы ФЛБ) ингибировали действие АБК, тогда как добавление ФК имитировало ответ клетки на АБК (Jacob et al., 1999). В работе Zhang и др. (2004) было показано, что ФЛЛЗа и ее продукт ФК регулируют активность протеинфосфатазы АВП, которая является негативным регулятором ответной реакции устьиц на АБК .
С использованием мутантов арабидопсиса нечувствительных к ФЛБа (теряют больше воды, чем растения дикого типа) показано, что закрывание устьиц после обработки АБК не происходило. При этом ФЛЭа не активировалась, и синтеза ФК не наблюдалось. Отсутствие АБК-индуцированного синтеза ФК приводило к снижению ассоциации АВП с плазмалеммой и не вызывала ингибирования фосфатазы. В результате клетки не реагировали на действие АБК. Обработка АБК растений дикого типа приводила к закрыванию устьиц. При этом наблюдалась активация ФІПЗа и увеличение уровня ФК. Образующаяся ФК связывала АВП, тем самым, вызывая ее ассоциацию с плазмалеммой, что приводило к снижению активности фосфатазы. Это взаимодействие препятствовало транспорту фосфатазы из цитозоля в ядро. Синтеза транскрипционного фактора АТНВ6 (отрицательно влияющего на проведения АБК сигнала) не происходило, поэтому клетки реагировали на действие АБК. Таким образом, ФК стимулировала проявление действия АБК за счет подавления отрицательного эффекта АВІ. Показано, что данная фосфатаза является мишенью для ФК (Zang et al., 2004). Рост пыльцевой трубки. Рост пыльцевой трубки является хорошей моделью для изучения верхушечного роста у растений. Известно, что важную роль в регуляции роста играют ионы кальция (Медведев, 2005). С другой стороны в опытах Potocky и др. (2003) на пыльцевой культуре табака (Nicotiana tabacwn L.) было показано, что ФК принимают участие в процессах формирования пыльцы и в росте пыльцевой трубки. Действие ингибитора фосфолипазного D пути синтеза ФК - первичного спирта (1-бутанола), тормозило рост и приводило к большим изменениям в морфологии трубки и компонентов секреторного аппарата. Добавление экзогенной ФК снимало ингибирование и стимулировало рост пыльцевой трубки. Таким образом, показано, что ФК участвуют в регуляции верхушечного роста, контролируя процессы везикулярного транспорта и экзоцитоза (Wang, 2005).
Биотический стресс. Показано, что в ответ на действие патогенов (Xanthomonas oryzae) происходит активация ФЖ) и быстрое освобождение ФК. Активация ФЖ) происходит в месте соприкосновения бактерии с клеткой (Laxalt et al., 2002). Влияние ряда элиситоров (флагеллин, хитотетраоза и грибов (Cladosporium fidvum) приводит к образованию ФК через активацию ФЛС/ДАГ-киназого пути. Предполагается, что, появляющаяся, ФК вызывает образование АФК, активацию МАР-киназ, вызывает защелачивание среды, вовлекается в защитные ответы в клетке (Van der Luit et al, 2000; de Jong et al, 2004).
При механическом повреждении в растительных клетках также происходит быстрая генерация ФК. Появление ФК наблюдается и в месте поранения и в отдаленных от него участках различных тканей растений. Синтез ФК осуществляется при активации ФЖ)а1, которая транспортируется из цитоплазмы к мембране и активируется при увеличении концентрации ионов Са2+ в цитоплазме (Ryu, Wang, 1996). Появление ФК может активировать липолитические пути, затрагивающие ацил-гидролизующие ферменты, ФК-фосфатазу. В этих процессах фосфолипиды преобразуются в ФК, ДАГ и ЖК, которые включают субстрат (линолевая кислота) синтеза жасмоновой кислоты (Ryu, Wang, 1998). Осмотический стресс. Увеличение уровня ФК в клетках вызывает как гипер-, так и гипо-осмотический стрессы, при которых происходит быстрая активация ФЖ) и/или ФЛС сигнальных систем (Munnik et al., 1998; Zonia, Munnik, 2004). В работе Munnik и др. (2000) на Chlamydomonas moewusii показано, что действие малых (до ЮОмМ) концентраций солей вызывает активацию ФІГО сигнальной системы и как результат повышение концентрации ФК. На различных растительных объектах показано действие гиперосмотического стресса (влияние солей - КС1, КВг, КІ, NaCl, LiCl, and RbCl, в концентрациях от 200 мМ до 500 мМ), которое проводило к быстрому накоплению ФК через активацию ФІГО и ФЛС (Frank et al., 2000; Munnik et al., 2000; Katagiri et al., 2001; Meijer et al., 2001; Meijer et al., 2002). Аналогичный эффект также вызывали такие осмотики, как сахароза и маннит (Munnik et al., 2000).
Получение препарата микросомальной фракции корней и колеоптилей кукурузы
Навеска (6 г) декапитированных на 4 мм отрезков корней или колеоптилей этиолированных проростков кукурузы гомогенизировали в фарфоровой ступке в среде (12 мл) гомогенизации, следующего состава: 0,25 М сахароза (для корней) (0,4 М сахароза (для колеоптилей)), 5 мМ ЭДТА, 15 мМ аскорбиновая кислота, 2 мМ трис-НС1 буфер (рН 7,8). Гомогенат фильтровали через капрон. Фильтрат центрифугировали на рефрижераторной центрифуге (К24 (Janetzki)) 5 минут при 4000g, а затем 15 мин при 13000g для осаждения неразрушенных клеток, клеточных стенок, ядер, пластид, митохондрий. Полученный супернатант подвергали следующему этапу осаждения при 98000g в течение 30 минут на центрифуге VAC 601 (Janetzki) и SORVALL Discovery 90SE (Hitachi) (ротор - SORVALL Т-1250), для получения микросомальной фракции. Полученный осадок ресуспендировали в 1 - 2 мл среды следующего состава: 0,25 М сахароза, 2 мМ трис-мес буфер (рН 7,2), 1 мМ дитиотрейтол в стеклянном гомогенизаторе и подвергался дальнейшему разделению на отдельные фракции. Все операции проводили при температуре 4С и при слабом освещении, чтобы избежать усиления окислительных процессов (Методы изучения мембран растительных клеток, 1986; Медведев и др., 1996). 2.3.1. Очистка плазмалеммы в двухфазной системе
Разделение мембран в водной двухфазной полимерной системе декстран -полиэтиленгликоль (ПЭГ) проводили согласно методу Ларсона (Larsson et al., 1994). Метод основан на использовании ряда свойств мембран, включая электрический заряд, плотность, массу и гидрофобность. Различия в этих свойствах обуславливают разное распределение компонентов смеси мембран между верхней и нижней фазами и границей раздела фаз.
Микросомальную фракцию ресуспендированную в среде, содержащей: 3 мМ КО, 5 мМ КН2Р04/КОН буфер (рН 7,8), 330 мМ сахарозу, смешивали с двухфазной системой, состоящей из: 6% декстрана Т 500, 6% полиэтиленгликоля Т 3350, 2 мМ KCI, 0,2 М сахарозы, 3 мМ КН2Р04/КОН буфера (рН 7,8). Тщательно перемешивали и оставляли уравновешиваться до разделения фаз или центрифугировали 5 минут при 1000g. Плазматическая мембрана обладает сродством к верхней (ПЭГ) фазе системы, поэтому везикулы плазмалеммы переходили в верхнюю фазу. После разделения верхнюю фазу, содержащую ПЭГ и плазмалемму, снимали и переносили на новую нижнюю фазу. Такую очистку проводили 2 раза. Затем верхнюю фазу разбавляли в 3 раза средой, состоящей из: 0,3 М сахарозы, 10 мМ трис-мес буфера (рН 7,2), и центрифугировали при 96000g в течение 1 ч. Полученный осадок ресуспендировали в небольшом объеме той же среде и использовали в ходе дальнейшего анализа. Все операции проводились при 4С.
Фракцию эндомембран, обогащенную фрагментами тонопласта и эндоплазматического ретикулума (ЭР), получали из общей микросомальной фракции путем очистки в ступенчатом градиенте плотности сахарозы. Очистку в градиенте плотности сахарозы проводили по методу Ходжеса и Леонарда (Hodges, Leonard, 1974). Градиент состоял из растворов сахарозы (плотностью 1,055 г/см3 и 1,12 г/см ), приготовленных на 2 мМ трис-мес буфере (рН 7,2) в центрифужных нитроцеллюлозных пробирках. На градиент наслаивали ресуспендированную микросомальную фракцию и центрифугировали при lOlOOOg в течение 2 часов. Мембранный препарат собирали на границе двух слоев сахарозы. Сбор фракции, обогащенной фрагментами тонопласта и ЭР, проводили с помощью пастеровской пипетки. К собранной фракции добавляли среду: 0,25 М сахарозы, 2 мМ трис-мес буфер (рН 7,2), 1 мМ дитиотрйтол и переосаждали центрифугированием при 96000g 1 ч для концентрирования полученных везикул эндомембран. Осадок ресуспендировали в небольшом объеме той же среды и использовали в ходе дальнейшего анализа. Все операции проводились при 4С.
Препараты фосфатидных кислот (1,2-диацилглицеро-З-фосфат Na-соль (Sigma); 1,2-дипальмитоилглицеро-З-фосфат Na-соль (Fluka); 1,2-диолеоилглицеро-З-фосфат Na-соль (Fluka)) растворяли в смеси хлороформ/метанол (2:1 по объему) и выпаривали под струей азота. К остатку добавляли бидистиллированную воду и проводили обработку ультразвуком (44 кГц) с применением ультразвукового диспергатора УЗДН 2Т (Россия) или Bioblock 72442 Scientific Vibra Cell (USA) до образования прозрачной эмульсии (Potocky et al., 2003). В ходе анализа действие ФК сравнивали с известными ионофорами - А23187 (для ионов кальция) и FCCP (для протонов).
Транспорт ионов изучали спектрофлуориметрическим и спектрофотометрическим методом с использованием везикулярных фракций плазмалеммы и эндомембран и специфических флуоресцентных зондов (индо-1, ХТЦ, АО) (Владимиров, Добрецов, 1980). 2.5.1. Регистрация транспорта ионов Са с использованием зонда индо-1
Индо-1 — это Са-чувствительный зонд, который характеризуется длиной волны возбуждения - 334 нм, длиной волны флуоресценции - 405 нм (Haugland, 2001). В ходе эксперимента зонд индо-1 загружали во внутреннее пространство везикул при помощи осмотического шока (Батов и др., 1995). Загрузку зонда осуществляли следующим образом. Полученные мембранные фракции (обогащенные эндомембранами или плазмалеммой) ресуспендировали в среде следующего состава: 35 мкМ EGTA, 8,3 мкМ индо-1, 150 мМ K2S04, 150 мМ сахарозы, 2 мМ трис-мес буфер (рН 8,0), 1 мМ дитиотрейтол. Затем осаждали центрифугированием при 96000g 1 час. Полученный осадок ресуспендировали в 200 мкл вышеуказанной среды без зонда и ЭГТА. Изменение флуоресценции зонда, загруженного в мембранные везикулы (10-20 мкг белка) определяли до и после внесении в среду анализа фосфатидных кислот. Среда анализа содержала: 150 мМ Na2S04, 150 мМ сахарозы, 2 мМ трис-мес буфер (рН 7,2), 200 мкМ ЭГТА. Измерения проводились на флуоресцентном спектрофотометре (Varian, Varian, Inc., USA) с использованием программы Сагу Eclipse (Австралия, 2000 г.).
Влияние фосфатидной кислоты на кальциевую проницаемость плазмалеммы и эндомембран
Имеются сведения о том, что фосфатидные кислоты (ФК) обладают способностью транспортировать ионы Са через мембраны мышечных, нервных, сердечных и других клеток животных организмов (Putney et al., 1980; Salmon, Honeyman, 1980; Ohsako, Deguchi, 1981). Однако на растительных объектах данное свойство ФК экспериментально доказано не было. Поэтому в следующей серии экспериментов анализировали способность ФК (Na-соль фосфатидной кислоты из лецитина яичного желтка), полученной при гидролизе L-a-фосфатидилхолина с помощью ФЛЕ) (из капусты), функционировать, как кальциевый ионофор. В работе использовали два флуоресцентных зонда: индо-1 и ХТЦ. С помощью зонда индо-1 регистрировали транспорт ионов кальция внутрь везикул (Haugland, 2001).
Влияние фосфатидной кислоты (из лецитина яичного желтка) на кальциевую проницаемость везикул плазмалеммы (ПМ) и эндомембран (ЭМ) корней проростков кукурузы, загруженных зондом индо-1. (А, Б) - в инкубационную среду, содержащую везикулы, вносили ионы Са2+, а затем ФК; (В, Г) - вносили ФК, а затем ионы Са2+.
При изменении порядка обработки везикул: вначале в среду вносили ионы кальция, а после этого добавляли ФК (рис. 20, рис. 21) также наблюдалось увеличение флуоресценции зонда индо-1, загруженного внутрь везикул, что свидетельствовало об обеспечении ФК потоков кальция в везикулы. Са2+.100 мкМ Влияние фосфатидной кислоты (из лецитина яичного желтка) на кальциевую проницаемость везикул плазмалеммы (ПМ) и эндомембран (ЭМ) колеоптилей проростков кукурузы, загруженных зондом индо-1. (А, Б) - в инкубационную среду, содержащую везикулы, вносили ионы Са2+, а затем ФК; (В, Г) - вносили ФК, а затем ионы Са2+. Величина флуоресцентного ответа зонда индо-1 зависела от концентрации ионов кальция и ФК, а также от количества мембранных везикул (рис. 22). Ионофорный эффект ФК наблюдался уже при внесении ионов Са + в концентрации 5 мкМ, максимальные флуоресцентные ответы достигались в присутствии 500 мкМ ионов Са2+ в инкубационной среде. Ионофорный эффект зависел также и от концентрации ФК. Результаты соответствуют данным, полученным на животных объектах в работах Putney и др. (1980) и Nayar и др. (1984).
Зависимость (Са)-ионофорного эффекта 0,5 мМ ФК от концентрации ионов Са (в среде инкубации) у везикул плазмалеммы (А) и эндомембран (Б) корней проростков кукурузы. Концентрацию ионов Са рассчитывали по величине флуоресцентного ответа зонда индо-1, загруженного в везикулы.
Таким образом, обработка ФК везикул плазмалеммы и эндомембран инициирует потоки ионов Са внутрь мембранных везикул. Полученные данные указывают на то, что фосфатидные кислоты, по-видимому, способны функционировать как кальциевые ионофоры в клетках растений.
На следующем этапе работы для оценки ионофорных свойств ФК был применен флуоресцентный индикатор двухвалентных катионов (в том числе и кальция) хлортетрациклин (ХТЦ). Этот зонд отличается от других тем, что с его помощью можно измерять уровень ионов кальция (магния) находящихся в липидной, т.е. мембраной фазе. Комплексы данного зонда с ионами в водном окружении имеют низкую флуоресценцию, но свечение резко увеличивается, если Са2+- или Mg2+-тетрациклиновый комплекс оказывается в гидрофобном окружении, то есть при образовании тройного комплекса катион-ХТЦ-мембрана, например, включается в биологическую мембрану (Добрецов, 1989; Левицкий, 1990). Таким образом, изменения флуоресценции ассоциированного с мембранами комплекса Са2+-ХТЦ отражают сдвиги в концентрации ионов Са около мембраны. Поэтому, регистрируя флуоресценцию комплекса Са —ХТЦ-мембрана, можно оценивать интенсивность потока ионов Са + через мембраны. Важной особенностью зонда является то, что изменение его флуоресценции не зависит от сдвигов рН. Известно, что в области рН 6,0 и выше молекула ХТЦ может присоединять два иона Са2+ (первый по Сю-Сц и второй — по Ci2-Ci) и один ион Mg (который связывается с атомами кислорода при Си и Ci2). При связывании ионов кальция или магния ХТЦ становится однозарядным катионом, поскольку одновременно с присоединением иона происходит диссоциация одной гидроксильной группы зонда (Владимиров, 1980).
Индукция кальциевой проницаемости, вызванная добавлением фосфатидной кислоты (из лецитина яичного желтка) к везикулам эндомембран (ЭМ) корней проростков кукурузы (А) и колеоптилей проростков кукурузы (Б). Эффект регистрировали с помощью зонда ХТЦ. Хорошо известно, что все фосфолипиды, в том числе и ФК, в водном растворе способны самопроизвольно агрегировать, с образованием липидных мицелл (Геннис, 1997). Можно предположить, что в наших экспериментах индукция кальциевой проницаемости происходит за счет встраивания мицелл ФК в мембранные везикулы плазмалеммы и эндомембран.
Известно также, что увеличение флуоресценции зонда возможно, если комплекс зонд — ионы находятся в гидрофобном окружении (Владимиров, 1980). Таким образом, не исключено формирование тройного комплекса, состоящего из мицелл ФК-Са-ХТЦ. Это также могло вызвать усиление флуоресценции зонда ХТЦ и свидетельствовать о транспорте ионов Са внутрь ФК мицелл. Результаты, полученные с помощью зонда ХТЦ, который позволяет регистрировать потоки ионов через мембраны, свидетельствуют о том, что фосфатидные кислоты могут функционировать как ионофоры и переносить ионы по градиенту концентрации. Можно предположить, что в клетках растений ФК, инициируя транспорт ионов по градиенту концентрации в цитоплазму, могут участвовать в системе кальциевой сигнализации и влиять на Са-зависимые процессы.
