Введение к работе
Актуальность темы. Тропомиозин (ТМ) является одним из ключевых компонентов регуляторного аппарата тонких филаментов во всех типах мышц. Вытянутые молекулы ТМ связываются с семью мономерами актина и тропониновым комплексом в составе тонкого филамента. Современные представления о механизме регуляции сокращения скелетной и сердечной мышцы сформулированы в виде теории «стерического блокирования», согласно которой ТМ способен перемещаться на поверхности актинового филамента, открывая или закрывая участки взаимодействия актина с головками молекул миозина. Положение ТМ на актине зависит от нескольких факторов, ключевыми из которых являются концентрация ионов кальция и наличие головок миозина. Данные кинетических и структурных исследований показывают, что для ТМ характерны три состояния, которые отражают его различные положения на поверхности актинового филамента. Эти состояния принято обозначать как «blocked» (связывание миозина с актином невозможно), «closed» (разрешено только «слабое» связывание) и «open» (осуществляется изомеризация актомиозинового комплекса и переход «слабого» связывания в «сильное») [МсКШор & Geeves, 1993; Vibert et al, 1997].
Молекула ТМ представляет собой димер а-спиралей, образующих левозакрученную суперспираль (coied-coil). Это объясняется наличием в первичной структуре ТМ непрерывающихся семичленных повторов (гептад). Соответственно, аминокислотную последовательность ТМ можно изобразить как (a b с d е fg)n, где положения а и d обычно заняты гидрофобными остатками, а в положениях е и g находятся остатки с заряженным радикалом. В целом, гидрофобные взаимодействия образуются в месте контакта спиралей и стабилизируют coiled-coil, тогда как электростатические взаимодействия между остатками е и g обусловливают специфичность образования двойной спирали и ее стабильность. Остатки с, d и / обычно гидрофильны и определяют взаимодействие ТМ с другими белками. Таким образом, стабильность молекулы ТМ зависит от природы остатков в положениях a, d, е и g, sl также от спиралеобразующей способности всех остальных аминокислотных остатков, включая отмеченные выше.
Для ТМ характерно наличие 4 генов, которые в результате альтернативного сплайсинга дают суммарно более 30 изоформ. В скелетных мышцах человека ТМ присутствует главным образом в виде гомодимеров а- и Р-изоформ, тогда как для гладкой мышцы характерно наличие аР-гетеродимеров.
Ввиду простоты своего устройства, молекула ТМ представляет собой идеальный объект для изучения взаимосвязи структуры и функции в молекулах белков. В этом отношении особый интерес представляют аминокислотные замены (мутации) в ТМ, ассоциированные с различными заболеваниями - например, миопатиями. Как правило, такие мутации имеют ярко выраженный функциональный фенотип, поэтому изучение
вызываемых ими структурных изменений ТМ интересно с точки зрения как фундаментальной науки, так и биомедицины. Известно, например, что мутация Arg91Gly в Р-изоформе ТМ ассоциирована с дистальным артрогриппозом - тяжелым наследственным заболеванием мышц. Кроме того, было установлено, что функциональными последствиями данной мутации является значительное снижение сродства молекул ТМ к актину и слишком высокая сократительная активность мышц. Тем не менее, оставалось непонятным, какие именно изменения в структуре мутантного ТМ приводят к таким эффектам.
Другим подходом в изучении структуры и функций ТМ является направленное изменение первичной структуры его молекулы (например, путем введения точечных мутаций) с последующим анализом свойств таких мутантных белков. В последнее время внимание исследователей стала привлекать центральная часть молекулы ТМ, которая по данным ограниченного протеолиза трипсином является наименее стабильным участком молекулы. Недавно S. Lehrer с соавторами показали, что замена остатка Asp 137 на Leu полностью предотвращает расщепление трипсином центральной части молекулы ТМ [Sumida et al, 2008]. Поскольку Asp 137 является заряженным остатком в положении d (т.е. в гидрофобном коре молекулы), авторы объясняли дестабилизацию центральной части ТМ наличием этого остатка. Тем не менее, заряженные остатки также присутствуют в положении d и в других участках молекулы, однако протеолиз там не происходит, несмотря на наличие множества потенциальных участков расщепления трипсином. Отметим, что при изучении дестабилизации центральной части ТМ от внимания исследователей ускользало наличие в ней консервативного остатка Glyl26, который, предположительно, сильно снижает стабильность двойной а-спирали ТМ. Таким образом, механизм дестабилизации центральной части молекулы ТМ оставался до конца непонятным. Поскольку данные трипеинолиза позволяли судить лишь о локальных изменениях в области участка расщепления, оставалось совершенно неясным, каковы в действительности размеры нестабильной центральной части молекулы ТМ. Кроме того, немалый интерес вызывает вопрос о функциональной значимости дестабилизации центрального участка молекулы.
Целью данной работы стало изучение структуры и свойств мутантных форм ТМ, несущих замены Arg91Gly (R91G), Glyl26Ala (G126A) и Glyl26Arg (G126R). В соответствии с этой целью были поставлены следующие конкретные задачи:
1) С помощью сайт-направленного мутагенеза получить рекомбинантные белки: Р-изоформы ТМ гладких и скелетных мышц человека, несущие мутацию R91G, и а-изоформу ТМ скелетных мышц человека, несущую мутации G126A или G126R.
Методами ограниченного протеолиза трипсином, дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) и кругового дихроизма (КД) изучить влияние указанных мутаций на структуру и стабильность молекулы ТМ и различных ее участков.
Используя метод химического «сшивания», исследовать влияние мутации R91G в Р-изоформе ТМ человека на ее способность к образованию оф-гетеродимеров с а-изоформой ТМ.
Изучить влияние мутаций G126A и G126R в скелетномышечном а-ТМ человека на его сродство к F-актину, а также на его регуляторные свойства в составе полностью реконструированных тонких филаментов.
Научная новизна. В работе впервые подробно исследован характер тепловой денатурации гладкомышечной и скелетномышечной изоформ Р-ТМ. С помощью метода ДСК установлено наличие в молекуле Р-ТМ двух калориметрических доменов (т.е. участков молекулы, которые денатурируют кооперативно и независимо друг от друга). Для идентификации этих доменов впервые было применено сочетание метода ДСК с измерениями температурных зависимостей флуоресценции эксимеров пирена. С помощью такого подхода установлено, что менее термостабильный домен представляет собой N-концевую часть молекулы, тогда как более термостабильный домен соответствует ее С-концевой части. Проведено подробное изучение эффекта мутации R91G на структуру и термостабильность гладкомышечной и скелетной изоформ Р-ТМ человека. Показано, что эта мутация вызывает драматическое снижение термостабильности всего N-концевого домена молекулы ТМ.
Методом химического сшивания показано, что мутация R91G в гладкомышечной изоформе Р-ТМ резко снижает ее способность образовывать аР-гетеродимеры с гладкомышечным а-ТМ. Предложен термодинамический механизм, описывающий снижение эффективности образования аР-гетеродимеров ТМ под действием мутации R91G.
С помощью метода ДСК впервые показано, что для некоторых участков молекулы скелетномышечного а-ТМ характерно некооперативное плавление, что свидетельствует об их высокой конформационной подвижности. Впервые предложена и проверена идея об участии аминокислотного остатка Glyl26 в дестабилизации центральной части молекулы а-ТМ. Использование мутантных форм а-ТМ, несущих замены G126A и G126R, впервые позволило объяснить необычный характер протеолиза молекулы ТМ трипсином и установить, что некооперативное плавление имеет место именно в центральной части молекулы ТМ. Более того, впервые удалось определить приблизительные размеры этой нестабильной части молекулы ТМ (60-70 аминокислотных остатков, что соответствует четверти длины молекулы ТМ). На основании полученных данных высказана гипотеза о
структурной организации молекулы ТМ, согласно которой молекула состоит из двух доменов разной стабильности (N-концевого и С-концевого) и нестабильного центрального участка между ними.
Продемонстрировано, что конформационная подвижность центральной части ТМ не является, вопреки распространенному мнению, необходимым фактором для связывания ТМ с актиновым филаментом. Кроме того, показано, что стабилизация центральной части молекулы ТМ может оказывать заметное влияние на регуляторные свойства ТМ в полностью реконструированных тонких филаментах, что проявляется в увеличении АТРазной активности актомиозина.
Научно-практическая ценность. Полученные данные значительно расширяют и углубляют представления об особенностях структурной организации молекулы тропомиозина, а также представляют несомненную важность для понимания тех молекулярных механизмов, которые лежат в основе различных тяжелых заболеваний мышц, ассоциированных с миопатическими мутациями в молекуле тропомиозина.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на Международных симпозиумах «Биологическая подвижность» (г. Пущино-на-Оке Московской области, 2008; 2010) и на 37-м Европейском мышечном конгрессе (г. Оксфорд, Великобритания, 2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ (3 статьи в рецензируемых журналах и 4 тезисов).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (
глав), описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения
( главы), заключения, выводов и списка цитируемой литературы ( источников).
Диссертация изложена на страницах, содержит рисунков и таблиц.
