Введение к работе
Актуальность работы. Каррагинаны - Сульфатированные полисахариды красных водорослей, в основе химической структуры которых находится дисахаридное повторяющееся звено, состоящее из остатков D-галактозы, соединенных регулярно чередующимися [3-1-4 и а-1-3 глликозидными связями. Структурное разнообразие каррагинанов обусловлено присутствием (3-(1-4) остатка в виде 3,6-ангидрогалактозы, а также количеством и местоположением сульфатных групп в моносахаридных остатках (Knutsen, 1994). Регулярные полисахариды, полимерная цепь которых построена из повторяющихся дисахаридных звеньев одного типа, получили собственное название. Природные каррагинаны редко соответствуют регулярным структурам, чаще они содержат повторяющиеся звенья нескольких типов и представлены нерегулярной или гибридной структурой, что объясняется многоступенчатым биосинтезом полисахаридов в клеточной стенке водорослей.
Вариабельность первичной структуры каррагинанов обуславливает многообразие их макромолекулярной организации и определяет широкий спектр их биологической активности (Yermak, Khotimchenko, 2003). В то же время биологические свойства этих полисахаридов, как и их надмолекулярная структура, изучаются в основном на коммерческих образцах, представленных каппа- и лямбда-типами каррагинанов. Всестороннее изучение каррагинанов красных водорослей дальневосточных морей позволит оценить влияние различных уровней структурной организации полисахаридов на их физиологическую активность.
Среди разнообразных биологических свойств сульфатированных
полисахаридов наибольший интерес в настоящее время привлекают
противовирусная, антикоагулирующая, иммуномодулирующая,
противоопухолевая, противоязвенная активности. Сульфатированные полисахариды взаимодействуют со множеством протеинов клеток эукариот и оказывают на иммунный ответ организма разнонаправленное действие, как ингибирующее, так и стимулирующее (Stephanie et al., 2010), что позволяет рассматривать каррагинаны в качестве возможных иммуномодуляторов. В последнее время появились данные об антиоксидантной активности полисахаридов морских водорослей (Yuan, Walsh, 2006, Zhang et al., 2010, Costa et al., 2010). Среди сульфатированных полисахаридов продолжается поиск веществ, проявляющих выраженное антитромбическое действие, не вызывающее кровотечение (Melo et al., 2004, Mestechkina, Shcherbukhin, 2010, Jiao et al. 2011, Pomin 2010). Однако данные о влиянии структурных особенностей и молекулярной массы полисахаридов на активацию тромбоцитов, играющих основную роль в системе первичного гемостаза организма, немногочисленны.
Каррагинаны, используемые как загустители и стабилизаторы различных пищевых продуктов, относятся к растворимым пищевым волокнам (ПВ) и внесены в список пищевых продуктов (Food and Drugs, 2008).
ПВ - пищевые волокна; АСМ - атомно-силовая микроскопия; БАД - биологически активная добавка; ИЛ - интерлейкин; ФНОа - фактор некроза опухоли a; G - З-р-Р-галактоза; D - 4-a-D-галактоза; DA - 4-3,6-ангидро-О-галактоза; S - сульфатная группа; ЛПС - липополисахарид; АФК -активные формы кислорода; ком. - коммерческий; FRAP - железо-восстанавливающая способность (от англ. ferric reducing antioxidant capacity); ССЗ - сердечно-сосудистые заболевания; ИБС -ишемическая болезнь сердца; КА - коэффициент атерогенности; ХС - холестерин; ХС-ЛПНП -холестерин липопротеинов низкой плотности; ХС-ЛПВП - холестерин липопротеинов высокой плотности; ТГ - триглицериды; СРБ - С-реактивный белок; CD3+- Т-лимфоциты; CD4+ - Т-хелперы-индукторы; CD8+ - Т-цитотоксические лимфоциты; ИРИ - CD4+/CD8+; CD22+ - В-лимфоциты; CD16+ -NK-клетки (нормальные киллеры); CD25+ - лимфоциты (рецептор к ИЛ2, активированные
Известно, что недостаток ПВ в рационе человека способствует возникновению многих желудочно-кишечных, метаболических и сердечнососудистых нарушений (Galisteo et al., 2008). В случае сердечно-сосудистых заболеваний ПВ способны понижать риск их развития посредством улучшения липидных показателей крови (Brown et al., 1999, Castro et al., 2005). Кроме того, ПВ находятся в тесном контакте с лимфоиднои тканью, связанной с кишечником, которая составляет значительную часть общей иммунной системы организма. Хотя известно, что ПВ, в частности полисахариды, могут модулировать различные звенья иммунитета, способность ПВ влиять на иммунную систему организма остается недостаточно исследованной.
В связи с этим весьма актуальным является изучение возможности использования каррагинана как источника ПВ в комплексной терапии пациентов с различными заболеваниями.
Цель работы: изучить влияние структуры каррагинанов, выделенных из красных водорослей Японского моря семейств Tichocarpaceae и Gigartinaceae, на их биологическую активность и экспериментально обосновать возможности использования этих полисахаридов в медицинской практике.
Для достижения поставленной цели в работе были сформулированы следующие задачи:
определить физико-химические характеристики и изучить макромолекулярную организацию различных типов каррагинанов;
исследовать иммуномодулирующую активность каррагинанов в моделях ex vivo;
изучить антиоксидантные свойства каррагинанов в экспериментах in vitro;
определить антитромботическое действие каррагинанов;
оценить возможность использования БАД «Каррагинан-ДВ» в комплексной терапии пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями.
Научная новизна работы. Впервые методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) изучена надмолекулярная структура каррагинанов, выделенных из красных водорослей семейств Tichocarpaceae и Gigartinaceae. Установлена избирательность иммуномодулирующего действия отдельных структурных типов каррагинанов и показана их потенциальная антиоксидантная активность. Исследованы антитромботические свойства каррагинанов, и впервые показано, что они ингибируют коллаген-индуцированную агрегацию тромбоцитов, снижая активацию этих клеток с участием гликопротеина VI.
Практическая значимость работы. Показано, что БАД «Каррагинан-ДВ», рекомендованный в качестве дополнительного источника пищевых волокон и использованный в комплексной терапии пациентов с сердечнососудистыми нарушениями, способствует нормализации параметров липидного обмена, снижению уровня маркеров хронического воспалительного процесса и положительной динамике ряда показателей иммунного статуса.
Основные положения, выносимые на защиту. Каррагинаны - каппа, лямбда, каппа/бета, икс и каппа/йота - выделенные из красных водорослей семейств Tichocarpaceae и Gigartinaceae, являются высокомолекулярными сульфатированными полисахаридами (М.м. от 147 до 527 kDa) с различной надмолекулярной структурой. Методом АСМ выявлены особенности
лимфоциты); CD95+ - лимфоциты (активированные лимфоциты, маркер аппоптоза); ФЧ -фагоцитарное число; ФИ - фагоцитарный индекс; ФАН - фагоцитарная активность нейтрофилов; ИЗФ - индекс завершенности фагоцитоза; lg - иммуноглобулин, НМ - низкомолекулярный.
макромолекулярной организации каррагинанов, обусловленные как
нерегулярностью структуры, так и степенью сульфатирования полисахаридов. Все каррагинаны обладают иммуномодулирующей активностью, индуцируя в концентрационной зависимости синтез цитокинов, активацию лимфоцитов, активность макрофагов. Степень проявления этой активности зависит от структуры полисахаридов. Каппа/бета-каррагинан обладает избирательным действием в отношении индукции синтеза про- (ИЛ-6 и ФНОа) и противовоспалительных цитокинов (ИЛ-10). Антиоксидантные свойства каррагинанов проявляются в способности перехватывать оксид азота, гидроксил радикал, супероксид анион и определяются структурными особенностями полисахаридов. Каррагинаны обладают антитромботическим действием, понижая скорость коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов и ингибируя адгезию этих клеток, опосредованную коллагеновым рецептором тромбоцитов - гликопротеином VI. Эффект антикоагулирующего действия каррагинанов зависит от молекулярной массы и степени сульфатирования полисахарида. БАД «Каррагинан-ДВ» может быть рекомендован в комплексной терапии пациентов с ИБС.
Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены автором в виде устных докладов на следующих конференциях: «9th International Marine Biotechnology Conference» (Qingdao, China, 2010); «Renewable Wood and Plant Resources: Chemistry, Technology, Pharmacology, Medicine» (Санкт-Петербург, Россия, 2011); «Russian-Indian Symposium on Glycosciences» (Москва, Россия, 2011).
Публикации. Всего 14 работ, из них по теме диссертации 12 публикаций, в том числе статей, опубликованных в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, определенных ВАК - 5, тезисов в материалах научных конференций - 7.
Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании отдела молекулярной иммунологии ТИБОХ ДВО РАН 26 декабря 2011 года.
Работа выполнена в лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета ТИБОХ ДВО РАН в соответствии с плановой темой НИР «Изучение структуры и иммунобиологических свойств макромолекул и их комплексов, включенных в патогенез наиболее распространенных и социально значимых бактериальных инфекций» (№ гос. per. 01.2.00 951069, научный руководитель - д.х.н. Т.Ф. Соловьева). Работа поддержана грантами: Президиума РАН - «Фундаментальные науки -медицине» (руководитель д.х.н. И.М. Ермак) и «Молекулярная и клеточная биология» (руководитель к.б.н. В.А. Рассказов); интеграционным грантом ДВО - УРО РАН (руководитель д.х.н. И.М. Ермак) и грантами ДВО РАН (руководитель аспирантка Е.В. Соколова).
Личный вклад соискателя. Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором в совместной работе с сотрудниками лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета ТИБОХ ДВО РАН и сотрудниками МО ДВО РАН. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль соискателя была определяющей.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 256 источников. Работа изложена на 117 страницах машинописного текста.
Автор выражает искреннюю благодарность своим руководителям д.х.н. Ермак И.М. и д.б.н. Богданович Л.Н. за неоценимую помощь в выполнении диссертационной работы и безграничное терпение; к.х.н. Барабановой А.О. за
любезное предоставление образцов каррагинанов, используемых в работе, к.х.н. Давыдовой В.Н. и к.б.н. Аминину Д.Л. за практические помощь в определении иммуномодулирующей активности; к.х.н. Горбач В.И. и к.х.н. Назаренко Е.Л. за практическую помощь при проведении исследований; Калитник А.А. за любезное предоставление НМ производного каппа-каррагинана, д.х.н. Соловьевой, к.х.н. Хоменко В.А. и всем сотрудникам ЛМОАБИ. Особую благодарность автор выражает член-корреспондент РАН Васьковскому В.Е. и д.х.н. Лукьянову за тщательный критический анализ текста диссертации и автореферата. Автор также выражает благодарность сотрудникам МО ДВО РАН: главному врачу к.м.н. Крыжановскому СП. и заведующей диспансерным отделением терапевту Ивановой Т.Б., оказавшим неоценимую помощью в проведении клинических исследований, и особую признательность врачу-лаборанту Сергеевой Н.В. за помощь в проведении работы с биологическим материалом; а также сотрудникам ИАПУ ДВО РАН к.ф.-м.н. Чусовитину Е.А. и Балагану С.А. за эксперименты с использованием АСМ.
