Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Строение и физиологическая активность полисахаридов растений 10
1.2. Методологические подходы к изучению связи между строением и физиологической активностью пектинов 21
1.3. Экспериментальные модели воспаления толстой кишки лабораторных животных 28
Глава 2. Материалы и методы исследования 33
2.1. Растворы и реактивы v 33
2.2. Характеристика пектинов 34
2.3. Введение полисахаридов животным 39
2.3. Индукция кишечного воспаления и его оценка 40
Глава 3. Результаты исследования 43
3.1. Скрининг противовоспалительной активности пектинов 43
3.2. Действие галактуронановых фрагментов пектинов на воспаление стенки толстой кишки 52
3.3. Проницаемость стенки сосудов у мышей, получивших пектины с разной молекулярной массой и моносахаридным составом 58
3.4. Влияние галактуронановых фрагментов пектинов на проницаемость стенки сосудов у мышей 61
3.5. Действие пектинов на структуру кишечной стенки 62
3.6. Действие пектинов на лейкоциты и проницаемость стенки сосудов 64
Глава 4. Обсуждение результатов 70
4. 1 Выявление пектинов, защищающих стенку толстой кишки мышей от химически индуцированного повреждения 70
4.2. Галактуронан - область макромолекулы пектинов, обладающая противовоспалительным действием 76
4.3. Влияние боковых цепей макромолекулы пектинов на их противовоспалительную активность 78
4.4. Характеристика противовоспалительной активности пектинов 80
Выводы
Список литературы
- Строение и физиологическая активность полисахаридов растений
- Характеристика пектинов
- Скрининг противовоспалительной активности пектинов
- 1 Выявление пектинов, защищающих стенку толстой кишки мышей от химически индуцированного повреждения
Введение к работе
Установлено, что пектины ингибируют развитие воспаления стенки кишки у экспериментальных животных, при этом противовоспалительное действие пектинов сопровождается уменьшением количества кишечных лейкоцитов (Rolandelli et aL, 1988; Liu et aL, 2003; Lim et al, 2003).
Было установлено, что действие пектинов на функциональную активность лейкоцитов зависит от молекулярной массы пектиновой макромолекулы (Puhlmann et al, 1992). Установлено, что пектины, обладающие провоспалительным действием, имеют молекулярную массу свыше 100 кДа (Попов, 2002). В то же время показано, что фрагмент потамогетонана с молекулярной массой свыше 300 кДа оказывает противовоспалительное действие. Не исключено, что действие пектинов на. воспаление связано с их молекулярной массой.
Связь между особенностями строения макромолекулы пектинов и их действием на воспаление кишечника не исследована.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: выявить область макромолекулы пектинов, обусловливающую их противовоспалительную активность при кишечном воспалении у мышей.
Задачи исследования.
1. Выявить пектины, предотвращающие развитие воспаления в стенке толстой кишки у мышей.
2. Исследовать противовоспалительную активность линейной области макромолекулы пектинов.
3. Определить зависимость противовоспалительного действия пектинов от типа строения разветвленной области макромолекулы.
4. Оценить действие на воспаление пектиновых фрагментов, различающихся по молекулярной массе и моносахаридному составу.
5. Дать характеристику противовоспалительного действия пектинов при повреждении стенки толстой кишки у мышей, вызванного ректальным введением уксусной кислоты.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ.
В работе впервые исследована способность различных по структуре пектинов ингибировать развитие воспаления в стенке толстой кишки у мышей. Новые пектины, оказывающие противовоспалительное действие при химическом повреждении стенки толстой кишки у мышей. Установлено, что участки галактуронана обладают противовоспалительным действием. Показано, что противовоспалительная активность пектинов не зависит от молекулярной массы фрагментов пектинов и от типа строения разветвленной области их макромолекулы.
Впервые показано, что пектины с определенной структурой способны ингибировать развитие воспаления стенки кишки при однократном превентивном пероральном введении. Показано, что при этом снижается адгезия перитонеальных лейкоцитов и проницаемость стенки сосудов брюшной полости у мышей.
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.
Полученные результаты могут быть использованы в технологии производства пектиновых препаратов с противовоспалительной активностью с перспективой их применения в качестве биологически активных добавок или лекарственных средств. Накопленные данные открывают возможность дать рекомендации об использовании растений, содержащих пектиновые полисахариды с изученным строением, в пищевой и фармакологической промышленности.
Результаты диссертационной работы расширяют представление о связи между физиологической активностью пектинов и их строением и могут быть использованы в курсе лекций для студентов биологических, химических и медицинских факультетов.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.
1. Выявлено, что из пятнадцати исследованных пектинов (см. табл. 2, 3, стр. 32, 34) только комаруман СР, пектин сабельника болотного Comarum palustre, оксикоккусан ОР, пектин клюквы Vaccinium oxycoccus L., танацетан TVC, пектин пижмы обыкновенной Tanacetum vulgare L., раувольфиан RS и RSP, пектин раувольфии змеевидной Rauwolfia serpentine L. предотвращают развитие кишечного воспаления. Установлено, что эти пектины способны ингибировать развитие воспаления в стенке толстой кишки у мышей при однократном превентивном пероральном введении.
2. Противовоспалительное действие пектинов обусловлено галактуронановым фрагментом их макромолекулы. Галактуронан предотвращает повреждение стенки кишки независимо от противовоспалительной активности исходного пектина. 3. Показано, что противовоспалительным действием обладают слаборазветвленные фрагменты пектинов, основным составляющим элементом которых является галактуронан.
4. Противовоспалительным действием обладают только те пектины, которые блокируют привлечение нейтрофилов в стенку толстой кишки после ректального введения кислоты.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. По результатам исследований были сделаны доклады на III Съезде биохимического общества (С.-Петербург, 2002); IV Молодежной научной конференции: «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике» (Сыктывкар, 2004); IX Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых: «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2005); VIII Всероссийском конгрессе: «Оптимальное питание - здоровье нации» (Москва, 2005); Международном научно-медицинском форуме «Гастро-2006» (С.-Петербург, 2006); IV Всероссийской научной конференции: «Химия и технология растительных веществ (Сыктывкар, 2006); II Международной научной конференции: «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений» (Алматы, Казахстан, 2007).
ПУБЛИКАЦИИ. По результатам диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата наук.
Строение и физиологическая активность полисахаридов растений
Строение полисахаридов растений. Полисахариды являются наиболее важным компонентом клеточных стенок растений. Растительные полисахариды разнообразны по строению и в зависимости от вида и места локализации выполняют различные биологические функции (Darvill et al., 1985; Горшкова, 2007).
Пектины присутствуют в первичной клеточной стенке, срединной пластинке и межклеточном пространстве. В межклеточном пространстве пектины присутствуют в растворимой форме. В первичной клеточной стенке пектины присутствуют в виде сложного макромолекулярного протопектинового комплекса с целлюлозой и гемицеллюлозами.
Протопектин составляет большую часть первичной клеточной стенки и играет роль каркасного полисахаридного комплекса (Carpita et al, 1996). По существующей номенклатуре (табл. 1), пектиновыми веществами называются встречающиеся в растениях производные углеводов, которые состоят из остатков а-)-галактуроновой кислоты (Kertesz, 1951; Aspinall, 1982).
Пектины принадлежат к числу наиболее сложных по структуре полисахаридов растений. Они имеют нерегулярный блочный характер построения углеводной цепи и содержат различные макромолекулярные фрагменты линейной и разветвленной областей. Таблица 1 Номенклатура пектиновых веществ
Название пектиновых веществ определение Пектиновые полисахариды (пектины) Полисахариды, главная углеводная цепь, которых состоит из ос-1,4-связанных остатков D-галактуроновой кислоты, а боковые цепи образованы остатками нейтральных моносахаридов. Протопектин Макромолекулярный комплекс, в образовании которого участвуют пектины, целлюлоза, гемицеллюлозы, многовалентные катионы металлов и анионы. Пектиновая кислота Галактуронан, в котором остатки галактуроновой кислоты частично или полностью метоксилированы по карбоксильным группам.
Пектовая кислота Галактуронан, в состав главной углеводной цепи которого входят остатки галактуроновой кислоты, лишенные метоксильных групп. Пектаты Соли пектовой кислоты. Пектинаты Соли пектиновой кислоты. Линейная область макромолекулы пектинов может быть представлена галактуронаном и рамногалактуронаном. Углеводная цепь галактуронана образована 1,4-связанными остатками a-D-галактопиранозилуроновой кислоты (a-D-Ga\pA). Рамногалактуронан состоит из отдельных блоков галактуронана, связанных между собой одним или двумя остатками a-L-рамнопиранозы, включенными в основную цепь «-1,2-связями (Оводов, Строение углеводной цепи кора макромолекулы может различаться у разных пектинов. Отмечается, что пектины могут иметь разную длину основной углеводной цепи (Горшкова, 2007).
Степень полимеризации галактуронана выделенного из яблочного, свекловичного и цитрусового пектинов составляет 72-120, 91-108, 114-138 кДа соответственно (Оводов, 2009). С помощью атомно-силовой микроскопии и анализа галактуронана методом метилирования было показано, что главная углеводная цепь комарумана СР, пектина выделенного из сабельника болотного Сотагит palustre L., наряду с линейными участками ог-1,4- -галактуронана может иметь разветвления в виде боковых цепей, построенных из 1,4-связанных остатков a-D-галактопиранозилуроновой кислоты, присоединенных в 2-0 и 3-0 положения остатков галактуроновой кислоты главной углеводной цепи галактуронана (Ovodova et al., 2005). Разветвленная область пектинов может быть образована арабинаном, арабиногалактаном, рамногалактуронаном I (R.G-I) и рамногалактуронаном II (RG-II) (Vincken et al, 2003). Рамногалактуронан-І представляет собой семейство близкородственных полисахаридов, главная углеводная цепь которых представляет собой рамногалактуронан.
Характеристика пектинов
Характеристика пектинов Пектины, использованные в работе, были выделены и охарактеризованы сотрудниками Лаборатории гликологии и Лаборатории биотехнологии ИФ Коми НЦ УрО РАН. Пектины из растительного сырья были выделены по ранее описанной методике (патент РФ №2149642). Линейный фрагмент макромолекулы пектинов был получен методом частичного кислотного гидролиза. Гидролиз был проведен трифторуксусной кислотой, поскольку она вызывает наименьшую деструкцию моносахаридов (York et aL, 1986). Данный метод основан на различной устойчивости гликозидных связей полисахаридов к действию кислот (Aspinall, 1982), что позволяло получать из пектинов галактуронан, лишенный боковых углеводных цепей из остатков нейтральных моносахаридов (Thibault et aL, 1993). Гомогенные по молекулярной массе фракций пектинов были получены посредством их последовательного разделения по молекулярной массе в ультрафильтрационной ячейке («Millipore», США) с помощью ультрафильтрационных мембран (полисульфон, «Владисарт», Россия) с различными размерами пор (300, 100 и 50 кДа). В результате были получены пектиновые фрагменты с молекулярными массами более 300 кДа, 100-300 кДа и 50-100 кДа. Химическая характеристика исследованных пектинов представлена в Таблицах 2 и 3. Таблица 2 Общая химическая характеристика полисахаридов, использованных в работе введением 5% уксусной кислоты (0,1 мл). Введение кислоты производили через мягкий катетер, на 3 см проксимальней ануса (Itoh et al., 2000). Мышей умерщвляли через сутки и изолировали 5-ти сантиметровый фрагмент толстой кишки проксимальней ануса. Фрагмент кишки вскрывали, промывали от содержимого в физрастворе. С помощью светового микроскопа (х20) определяли степень и площадь поражения. Степень поражения выражали в баллах, используя при этом следующую шкалу: 0 — нет признаков воспаления, 1 - гиперемия, без язв и эрозий, 2 -поверхностные язвы без разрушения слизистой, 3 - язвы с разрушением слизистой, 4 - глубокие некротические язвы (Mahgoub et al., 2003). Площадь поражения выражали в процентах от общей площади фрагмента кишки. В качестве положительного контроля использовали преднизолон (5 мг/кг).
Определение активности МПО. Изолированный фрагмент кишки очищали от содержимого, взвешивали и гомогенизировали в ФБР. Гомогенат центрифугировали при 10000xg в течение 20 мин, для анализа отбирали надосадочную жидкость (0,1 мл). Содержание МПО определяли спектрофотометрически. Полученный супернатант вносили в лунки 96-луночного плоскодонного планшета. К образцам добавляли 0,1 мл субстрата: раствора фосфатно-цитратного буфера, содержащего о/7/ио-фенилендиамин (0,4 мг/мл) и 0,015 % Н2О2 (Пинегин, 1995). Определяли оптическую плотность образцов при длине волны 492 нм с помощью спектрофотометра Power Wave 200 (Bioek Instruments, USA). Активность МПО рассчитывали, используя калибровочный график, построенный для пероксидазы хрена (ПХ) и выражали в ед/мг сырой ткани. Определение количества кишечной слизи. Количество кишечной слизи определяли по степени связывания красителя алцианового синего с кишечной слизью. Выделенный фрагмент толстой кишки аккуратно очищали от фекалий и помещали в раствор с красителем на 2 часа. Краситель, не связавшийся со слизью, дважды отмывали с помощью 0,25 М водного раствора сахарозы, для этого фрагмент толстой кишки помещали на 15 минут в раствор сахарозы. Затем фрагмент извлекали и помещали на 45 минут в свежий раствор сахарозы. Краситель, связавшийся со слизью, экстрагировали с помощью 0,5 М водного раствора хлорида магния в течение двух часов при комнатной температуре. Полученный раствор центрифугировали при 2000 х g ив надосадочной жидкости определяли оптическую плотность при длине волны 605 нм (Blandizzi a/., 1999). Определение проницаемости стенки сосудов. Мышам, наркотизированным эфиром, внутривенно вводили раствор красителя Эванса голубого (0,25 мл), после чего внутрибрюшинно вводили 0,2 мл 0,1 N раствора уксусной кислоты. Через 20 мин животное умерщвляли и брюшную полость промывали фосфатно-буферным раствором (5 мл). В полученный смыв добавляли для осаждения белков 0,01 мл IN раствор NaOH. Определяли оптическую плотность полученного раствора при длине волны 590 нм (Pereira et al, 2000). Определение адгезивности перитонеальных лейкоцитов мышей. Мышей умерщвляли под эфирным наркозом с помощью смещения шейных позвонков. Затем вводили внутрибрюшинно 5 мл охлажденного (+4С) ФБР. После легкого массажа брюшной стенки извлекали экссудат из брюшной полости (Хант, 1989). Полученный смыв центрифугировали при 1200 об/мин в течение 10 мин. К клеточному осадку добавляли ППС и ресуспензировали. Полученную клеточную суспензию (0,1 мл) инкубировали в 96-луночном плоскодонном планшете в течение 15 мин при 37С. Для стимуляции клеточной активности использовали форболовый эфир миристиновой кислоты (0,025 мг/л). После инкубации планшет трижды промывали с помощью ФБР от не прикрепившихся клеток. Адгезированные лейкоциты фиксировали этиловым спиртом и окрашивали красителем Романовского-Гимза (30 мин). После окрашивания планшет промывали до полного удаления красителя не связавшегося с клетками. Затем в планшет добавляли 0,1 мл метилового спирта и измеряли оптическую плотность раствора при длине волны 650 нм (Fraser et al., 1993).
Скрининг противовоспалительной активности пектинов
Установлено, что только пять (СР, OP, RS, RSP и TVC) из 15 исследованных полисахаридов оказывают противовоспалительное действие при химическом поражении стенки толстой кишки у мышей (рис. 1). Противовоспалительное действие пектинов характеризуется снижением площади поражения более чем в два раза (рис. 2) и уменьшением степени повреждения на 40% (рис. 3). Активность МПО в стенке кишки мышей, получивших СР, OP, RS, RSP и TVC, уменьшается по сравнению с контролем в два раза (рис. 4). При этом комаруман СР, раувольфиан RS и RSP, танацетан TVC и оксикоккусан ОР обладают одинаковой степенью защитного действия, сравнимого с действием преднизолона, гормонального противовоспалительного препарата. Установлено, что ряд пектинов оказывает действие только на отдельные параметры повреждения кишки. Так, например, алиуман AS, пектин выделенный из чеснока, снижает активность МПО в стенке кишки и уменьшает площадь поражения, но не действует на степень повреждения. (рис. 1-4). Пектин из ягод брусники VV уменьшает степень и площадь поражения, но не действует на активность МПО в стенке кишки (рис. 1-4). Ж CM Рисунок 1. Образцы стенки толстой кишки мышей через 24 ч после ректального введения уксусной кислоты. За 48 ч до индукции воспаления мыши получали перорально воду, комаруман СР (200 мг/кг), раувольфиан RS и RSP (200 мг/кг), оксикоккусан ОР (200 мг/кг) и танацетан TVC (200 мг/кг), преднизолон (5мг/кг) (а-ж соответственно); (х2,5). контроль ПН АР площадь поражения, % Рисунок 2. Площадь поражения стенки толстой кишки у мышей, получивших полисахариды (п/о 200 мг/кг) за 48 ч до ректального введения уксусной кислоты. Данные представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартное отклонение. Количество животных -7. - различия достоверны по сравнению с контролем при р 0,05. ПН - преднизолон. Названия полисахаридов даны в Табл. 2. контроль ПН АР PC W AS OP СР
Степень повреждения стенки толстой кишки у мышей, получивших полисахариды (п/о 200 мг/кг) за 48 ч до ректального введения уксусной кислоты. Данные представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартное отклонение. Количество животных - 7. - различия достоверны по сравнению с контролем при р 0,05. ПН - преднизолон. Названия полисахаридов даны в Табл. 2. 5
Активность МПО в стенке толстой кишки у мышей, получивших полисахариды (п/о 200 мг/кг) за 48 ч до ректального введения уксусной кислоты. Данные представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартное отклонение. Количество животных - 7. - различия достоверны по сравнению с контролем при р 0,05. ПН - преднизолон. Названия полисахаридов даны в Табл. 2. Обнаружено, что лемнан LM и силенан SV способствуют увеличению площади поражения стенки толстой кишки. Однако активность МПО и степень повреждения остаются на уровне, характерном для мышей, получавших до индукции воспаления воду. Зостеран ZM, бергенан ВС, пектин цитрусовый PC и пектин яблочный АР, а также глюкан, выделенный из раувольфиана (RSG), не оказывают действия на повреждение стенки кишки при химическом поражении. Степень, площадь поражения и активность МПО в стенке толстой кишки у мышей, получавших эти пектины сравнима с таковыми у контрольных мышей, получивших до индукции воспаления воду (рис. 1-4). На основании данных проведенного скрининга для дальнейшего исследования физиологической активности были выбраны комаруман СР, раувольфиан RS и оксикоккусан ОР. Установлено, что ингибирующее действие пектинов на повреждение толстой кишки у мышей уменьшается при снижении дозы введения. Так, если при введении пектинов СР и ОР в дозе 200 мг/кг степень и площадь поражения снижалась на 50 и 35% соответственно, то введение пектинов в дозе 100 мг/кг вызывает уменьшение степени повреждения только на 20-30%, при этом площадь поражения не снижается. О снижении защитного действия комарумана СР и оксикоккусана ОР свидетельствует и менее значительное уменьшение активности МПО в стенке толстой кишки, в среднем на 30%, тогда как при введении пектинов СР и ОР в дозе 200 мг/кг активность МПО уменьшается в два раза. Пектины в дозе 50 мг/кг не оказывают влияния ни на один из определяемых параметров повреждения. Снижение дозы раувольфиана RS в два раза (100 мг/кг) полностью отменяет его действие на морфометрические признаки поражения и на активность МПО в стенке кишки (табл. 5). Таблица 5 Дозозависимость действия пектинов на воспаление толстой кишки Группа Степеньповреждения,баллы Площадьпоражения,% МПО, ед/мг Данные представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартное отклонение Количество животных - 7. - различия достоверны по сравнению с контролем при р 0,05. По-видимому, невысокая активность раувольфиана RS обусловлена примесью глюкана в его образце, на что указывает высокое содержание остатков глюкозы в составе углеводных компонентов RS (см. табл. 2., Гл. 2). Установлено, что протекторное действие пектинов проявляется только при их введении не менее чем за 48 ч до индукции воспаления. Введение комарумана, раувольфиана и оксикоккусана в дозе 200 мг/кг за сутки до ректального введения кислоты не оказывает влияния на повреждение кишки. Введение пектинов в таких же дозах одновременно с индукцией воспаления не оказывает защитного действия на стенку кишки (табл. 6).
1 Выявление пектинов, защищающих стенку толстой кишки мышей от химически индуцированного повреждения
Установлено, что пять (CP, OP, RS, RSP и TVC) из 15 исследованных полисахаридов оказывают защитное действие на стенку кишки. Комаруман СР, оксикоккусан ОР, танацетан TVC, раувольфиан RS и RSP снижают активность МПО в стенке кишки более чем в два раза, в той же степени происходит снижение площади и степени воспаления, увеличивается количество кишечной слизи.
Ранее уже сообщалось, о пектинах, обладающих подобным действием, это два коммерческих пектина - яблочный и цитрусовый. Противовоспалительное действие пектинов проявляется при их добавлении в рацион питания крысам в виде 1% или 2%-ного водного раствора на протяжении 7-Ю дней. Выявлено, что цитрусовый пектин ускоряет регенерацию эпителия толстой кишки (Rolandelli et aL, 1988), пектин яблочный снижает бактериальную инвазию и уровень эндотоксинов в плазме крови у животных после индукции кишечного воспаления (Мао et al., 1996).
Обнаружено, что пектины CP, OP, RS, RSP и TVC оказывают защитное действие на стенку кишечника уже при однократном пероральном введении. Защитное действие пектинов сопровождается снижением количества нейтрофилов в стенке толстой кишки после индукции кишечного воспаления. Использование однократного перорального введения пектинов позволило снизить вероятность влияния на результат короткоцепочечных жирных кислот (ЮДЖК), образующихся при ферментации полисахаридов микрофлорой кишечника (Topping, Clifton, 2001; Fukunaga et al., 2003). Известно, что после инкубации нейтрофилов с КЦЖК ингибируется хемотаксис нейтрофилов и снижается секреция литических ферментов нейтрофилами (Eftimiadi et al, 1987), что может сказываться на повреждении тканей кишечника. Отличием полученных результатов от результатов других исследователей является то, что введение пектинов СР, OP, RS, RSP и TVC в организм животных одновременно с индукцией кишечного воспаления не оказывает защитного действия на стенку толстой кишки. Установлено, что защитное действие пектинов проявляется только при их превентивном введении не менее, чем за 48 ч до индукции воспаления.
Такие особенности могут быть обусловлены различиями в методике индукции кишечного воспаления. Так, например, защитное действие полисахаридов из ревеня и женьшеня было обнаружено с помощью модели кишечного воспаления, вызванного тринитробензолсульфоновой кислотой (Liu et al., 2003; Liu Shao-Ping et al., 2003). Известно, что механизмы развития кишечного воспаления, индуцированного уксусной кислотой и декстрансульфатом отличаются (Elson et al, 1996; Fioracci et al., 2004; Fabia et al., 1992; Millar et al., 1996). В работах большинства исследователей используется длительное (более 5 дней) пероральное введение пектинов после индукции кишечного воспаления. Возможно, что более длительное введение пектинов СР, OP, RS, RSP и TVC после индукции воспаления также ускорит регенерацию ткани кишки.
Выявление сразу нескольких новых пектинов с защитным действием стало возможным благодаря тому, что пектины, использованные нами, выделялись из разных видов растений (сабельник, ряска, смолевка, бадан, чеснок, брусника и клюква), а также из каллусных культур клеток растений (раувольфия и пижма). Тем самым были исследованы пектины с большим разнообразием структур, чем это делалось ранее другими исследователями.
Сравнивали строение пектинов, предотвращающих (комаруман СР) и не предотвращающих (бергенан ВС) воспаление, а также пектинов, вызывающих увеличение площади поражения после индукции воспаления толстой кишки у мышей (лемнан LM и силенан SV).
В основе макромолекулы всех пектиновых полисахаридов лежит линейная цепь из 1,4-связанных остатков а-)-галактопиранозилуроновой кислоты, образующих фрагменты линейного галактуронана. Разветвленная область лемнана LM представлена апиогалактуронаном (Ovodova et al., 2000b; Golovchenko et al, 2002). В силенане SV (Ovodova et al, 2000a), комарумане СР (Ovodova et al, 2005) и бергенане ВС (Golovchenko et al, 2007) разветвленная область макромолекулы представлена рамногалактуронаном-І (RG-I). Несмотря на однотипное строение разветвленной области этих пектинов, только комаруман СР предотвращает развитие повреждения стенки кишки. Строение боковых областей лемнана LM и силенана SV различно, однако оба пектина вызывают провоспалительную реакцию при химическом поражении стенки кишки.
Таким образом, не все пектины, разветвленная область которых представлена рамногалактуронаном-1 обладают противовоспалительным действием. Стимулировать воспаление стенки кишки могут как рамногалактуронановые, так и апиогалактуронановые пектины. Действие пектинов на воспаление, по-видимому, определяется иными особенностями строения пектинов, такими как расположение разветвленных областей на основной углеводной цепи, количеством и моносахаридным составом боковых цепей макромолекулы пектинов.
Исследуемые пектины представляют собой смеси полимергомологов с разной молекулярной массой. Пектины различаются количественным содержанием высоко- и низкомолекулярных фракций. Основным составляющим большинства пектинов являются полисахаридные цепи с молекулярной массой более 100 кДа (табл. 3). Логично предположить, что действие пектинов на кишечное воспаление определяется полимергомологами представленными в большем количестве.
Комаруман СР, танацетан TVC, зостеран ZM, лемнан LMC и пектин яблочный АР более чем на 60- 80% состоят из полисахаридных цепей с молекулярной массой свыше 300 кДа (табл. 3). Предотвращают развитие кишечного воспаления только комаруман СР и танацетан TVC (рис. 1-3). Преобладающими фракциями раувольфиана RS и лемнана LM являются полисахаридные цепи с Mw менее 300 кДа (табл. 3), однако действие этих пектинов на развитие воспаления различно (рис. 1-3).
Поскольку действие пектинов на воспаление различно, то можно предположить, что существенным для противовоспалительной активности пектинов, является не молекулярная масса полимергомологов, а различия в структуре макромолекулы пектинов. Молекулярная масса полисахаридных цепей, входящих в состав пектинов в виде полимергомологов, зависит от количества остатков галактуроновой кислоты и нейтральных моносахаридов, следовательно, можно предположить, что такими различиями могут быть либо длина главной углеводной цепи макромолекулы пектинов, либо структура боковых цепей.
Не исключено, что действие пектинов на воспаление связано с сопутствующими примесями (фенолы, протеины и липополисахариды). Показано, что употребляемые в пищу растения, содержащие в большом количестве примеси фенольных соединений, оказывают антиоксидантное и противовоспалительное действие (Middleton et al., 2000; Cabrera et aL, 2006). Можно было предположить, что противовоспалительная активность комарумана связана с примесями фенолов. Однако бергенан, в составе которого присутствует примерно такое же количество фенолов, что и в комарумане, не оказывает влияния на развитие кишечного повреждения (см. р. 2.2, табл. 4).
