Введение к работе
Актуальность работы. Удаление исчерпавших свои возможности и невостребованных клеток необходимо для жизнедеятельности многоклеточных организмов. Контроль за пролиферацией и дифференцировкой клеток достигается путем их сбалансированного деления и элиминирования. Это достигается включением генетической программы, которая регулирует гибель клеток. Клеточная смерть не ограничена биологией развития и является ключевой в элиминировании трансформированных или инфицированных клеток. Программируемая клеточная смерть (ПКС) зависит от процессов метаболизма, транскрипции генов и синтеза новых белков.
ПКС можно вызвать либо подавить/приостановить разнообразными физическими и химическими факторами. ПКС может протекать по разным сценариям: 1)апоптоз, 2)аутофагия, 3Программируемый некроз и их сочетания. Существует непрограммируемая гибель клеток - некроз.
Одним из индукторов ПКС является цианид. Для растений CN не является чужеродным и может образовываться из цианогенных гликозидов и в при синтезе этилена из 1-аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты. У растений ПКС могут вызывать элиситоры. К эффективным элиситорам относится хитозан - продукт неполного дезацетилирования хитина, компонента клеточной стенки грибов. Хитозан вызывает гиперчувствительный ответ - защитную реакцию растений в форме локальной гибели клеток, зараженных патогеном, которая задерживает дальнейшее распространение инфекционного возбудителя.
Цель работы - исследовать хитозан-индуцированную гибель клеток у растений, сравнить хитозан с Н202 и CN в качестве индукторов ПКГ. Экспериментальные задачи:
Испытать CN в качестве индуктора ПКС у Сз- и Сд-растений. Исследовать действие CN на потребление и фотосинтетическое выделение ( насечками листьев кукурузы, Сд-растения.
Испытать хитозан в качестве индуктора ПКС у растений с применением световой и флуоресцентной микроскопии, электрофоретического анализа ДНК в эпидермисе листьев, выявлением активности протеинкиназ в эпидермисе.
Исследовать зависимость хитозановой гибели клеток от активных форм кислорода (АФК), влияние ингибиторов синтеза белка на рибосомах цитоплазмы (циклогексимида) и в митохондриях (линкомицина), а также ингибитора аутофагии 3-метиладенина на гибель клеток, вызванную хитозаном и Н202.
3. Испытать влияние ингибиторов питохромной ветви и альтернативной оксидазы дыхательной цепи митохондрий, а также ингибиторов NADPH-оксидазы плазматической мембраны на хитозан-индуцированное разрушение ядер в эпидермальных клетках гороха. Сравнить их действие на гибель клеток, вызванную CN и Н202.
Научная новизна работы. Исследована хитозан-индупированная гибель эпидермальных клеток в пленках эпидермиса из листьев гороха. Показано, что хитозан вызывает разделение ДНК на олигонуклеосомные фрагменты и увеличивает активность протеинкиназ в эпидермисе гороха. Хитозан-индупированная гибель эпидермальных клеток гороха сопровождается генерацией АФК: супероксидного
аниона-радикала (02), пероксида водорода (Н202) и гидроксильного радикала (ОН). Ингибиторный анализ показал зависимость хитозановой гибели клеток от действия цитохромной ветви и альтернативной оксидазы дыхательной цепи митохондрий, NADPH-оксидазы плазматической мембраны клеток, синтеза белка в митохондриях и на рибосомах цитоплазмы. Полученные данные свидетельствуют о программируемом характере гибели эпидермальных клеток, включающей апоптоз и аутофагию.
Практическое значение работы. Результаты работы расширяют представления об участии биоэнергетических систем и АФК в программируемой гибели клеток растений. Они могут быть использованы в курсах лекций и практикумах по биохимии, физиологии растений, биоэнергетике, клеточной биологии и цитологии. Поскольку ПКС играет важную роль в фитоиммунитете, исследования в этой области могут способствовать сортовыведению сельскохозяйственных растений, обладающих повышенной устойчивостью к патогенам.
Апробация работы. Результаты работы доложены на IX международной конференции молодых ботаников в Санкт-Петербурге (2006), международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2007» (Москва, 2007), международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2007), 12-ой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (2008), на биоэнергетическом семинаре, возглавляемом акад. В.П.Скулачевым (НИИ ФХБ МГУ, 2008), а также на заседаниях кафедры физиологии микроорганизмов МГУ.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, 1 находится в печати.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 160 страницах, иллюстрирована 20 рисунками и 2 таблицами. В обзоре литературы изложены современные представления о ПКС у растений, роли АФК и связи ПКС с биоэнергетикой клетки. Список литературы содержит 472 источника.
