Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 5
1.1. Цель и задачи работы 6
2. Обзор литературы 7
2.1. Клеточная смерть. Общая характеристика 7
2.1.1. Краткая история вопроса 7
2.1.2. Формы клеточной гибели 8
2.1.3. Модели для изучения ПКС -12
2.2. ПКС у растений 14
2.2.1. Особенности ПКС у растений 14
2.2.2. ПКС в онтогенезе растений 16
2.2.3. Гиперчувствительный ответ 20
2.3. Механизмы программируемой гибели 24
2.3.1. Регуляция ПКС у растений 24
2.3.2. Деградация компонентов клеток растений 40
2.4. АФК и их роль в программируемой гибели клеток 47
2.5. Участие митохондрий и хлоропластов в ПКС 53
2.5.1. Роль митохондрий в ПКС у растений 53
2.5.1. Возможное участие хлоропластов в ПКС у растений 58
3. Экспериментальная часть 62
3.1. Объекты и методы исследования 62
3.1.1. Объект исследования 62
3.1.2. Инфильтрация и инкубация с реагентами 63
3.1.3. Оксиметрия 64
3.1.4. Анаэробные условия 64
3.1.5. Фиксация объекта, окрашивание и световая микроскопия 65
3.1.6. Флуоресцентная микроскопия 66
3.2. Результаты исследования 68
3.2.1. CN~ как индуктор гибели клеток 68
3.2.2. Влияние антиоксид аито в, анаэробных условий, состояния фотосинтетической и дыхательной ЭТЦ, ингибиторов протеинкиназ и протеаз на С^-индуцированное разрушение ядер 73
3.2.3. Деэнергизация вызывает разрушение ядер устьичных клеток 78
3.2.4. Ингибиторы синтеза белка и разрушение ядер устьичпых клеток 80
3.2.5. Вклад различных АФК в разрушение ядер устьичпых клеток 83
3.3. Обсуждение результатов 93
3.4. Выводы 104
- ПКС у растений
- АФК и их роль в программируемой гибели клеток
- Результаты исследования
- Обсуждение результатов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Гибель клеток может быть непрограммируемой, неконтролируемой (некроз) и программируемой (программируемая клеточная смерть - ИКС). ПКС играет важную роль в реализации программы развития в онтогенезе и поддержании тканевого го-меостаза организма. Являясь важной составляющей иммунитета, ПКС вовлечена в защитные реакции животных и растений на инфекционных возбудителей. Многое известно о механизмах ПКС у животных и человека. У растений механизмы клеточной гибели изучены в меньшей степени, однако имеющиеся данные свидетельствуют о наличии универсальных сигнальных путей и механизмов гибели клеток животных, растений и грибов. Важную роль в ПКС играют биоэнергетические структуры клетки. Дыхательная цепь митохондрий животных является одним из источников активных форм кислорода (АФК, Boveris and Chance, 1973), вызывающих клеточную гибель (Скулачев, 2000). При апоптозе у животных из митохондрий в цитоплазму переходит ряд факторов белковой природы: цитохром с, флавопротеин AIF, Smac/DIABLO, эндо-нуклеаза G (Ravagnan et al., 2002). Известна их роль в апоптозе. Актуально выяснение участия АФК, митохондрий и хлоропластов в ПКС у растений. Перед исследователями возникают разные вопросы. Оказывают ли АФК такое же губительное действие в клетках растений, как у животных? Какую роль играют митохондрии в ПКС у растений? Аналогична ли она участию митохондрий в апоптозе клеток животных? Хлоропласта, уникальные структуры, присущие только растениям, имеют структурное, функциональное и филогенетическое родство с митохондриями. Участвуют ли они в ПКС у растений?
Цель и задачи работы. Цель работы - исследование программируемой гибели устьич-ных клеток листьев гороха. Задачи:
-
Исследовать CN" в качестве индуктора программируемой гибели устьичных клеток из листьев гороха.
-
Исследовать влияние анаэробиоза, антиоксидантов, состояния фотосинтетической и дыхательной электронтранспортных цепей, ингибиторов протеинкиназ и протеаз на CN~-индуцированное разрушение ядер устьичных клеток.
-
Исследовать влияние деэнергизации клетки на состояние ядер устьичных клеток.
-
Исследовать действие ингибиторов синтеза белка на рибосомах цитоплазмы и рибосомах митохондрий и хлоропластов на состояние ядер устьичных клеток.
-
Выявить вклад различных АФК в CN-индуцированное разрушение ядер устьичных клеток.
Научная новизна работы. Исследована ON-индуцированная гибель устьичных клеток в пленках эпидермиса из листьев гороха. Полученные данные позволяют идентифицировать ее как одну из форм ПКС - апоптоз. Гибель клеток стимулируется при освещении. Выявлена зависимость CN'-индуцированного апоптоза устьичных клеток от АФК. Данные, полученные с применением различных акцепторов электронов и ингибиторов фотосинтеза и дыхания, позволяют заключить, что апоптоз устьичных клеток регулируется редокс-состоянием хинонов фотосинтетической и дыхательной электронтранспортных цепей: восстановленный пластохинон хлоропластов стимулирует, а митохондриальный убихинон, по-видимому, подавляет ПКС. Предполагается, что восстановленный пластохинон активирует протеинкиназы, инициирующие программу гибели устьичных клеток. Ингибиторы протеинкиназ и протеаз предотвращают действие CN". Деэнергизация устьичных клеток ингибитором гликолиза и разобщителем окислительного и фотосинтетического фосфорилирования индуцирует апоптоз. Уровень деэнергиза-ции способен, по-видимому, определять тип гибели устьичных клеток (апоптоз или некроз). Исследовано действие ингибиторов синтеза белка на CN-индуцированное разрушение ядер. Данные показывают, что белки, синтезируемые в цитоплазме, по-видимому, предохраняют клеточное ядро от CN -индуцированного разрушения, тогда как белки, синтезируемые в митохондриях и хлоропластах, напротив, способствуют разрушению ядра. Вклад хлоропластного и ми-тохондриального белкового синтеза в ПКС устьичных клеток различается. Из исследованных нами форм активного кислорода вклад в CN-индуцированное разрушение ядер устьичных клеток вносят супероксидный анион-радикал (Ог), Н202 и гидроксильный радикал (ОН), но не синглетный кислород ('Ог).
Практическое значение работы. Результаты работы расширяют представления об участии биоэнергетических систем клетки и активных форм кислорода в программируемой гибели клеток растений. Они могут быть использованы в курсах лекций и практикумах по клеточной биологии, цитологии, биоэнергетике, физиологии растений и биохимии. В перспективе, поскольку ПКС играет важную роль в фитоиммунитете, исследования в этой области могут способствовать созданию новых сортов сельскохозяйственных растений, обладающих повышенной устойчивостью к патогенам.
Апробация работы. Результаты работы доложены на международной научной конференции «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 2000), международной научной конференции «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий» (Саранск, 2001), V Путинской конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века» (Пущино, 2001), международных курсах «Свободные
радикалы, оксид азота и воспаление: молекулярные, биохимические и клинические аспекты» (Турция, Анталия, 2001), III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), Всероссийской научно-практической конференции «Физиология растений и экология на рубеже веков» (Ярославль, 2003), международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2003), XI международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2004» (Москва, 2004), VIII молодежной конференции ботаников в Санкт-Петербурге (Санкт-Петербург, 2004), Ш съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), на заседании Московского биоэнергетического семинара, возглавляемого академиком В.П.Скулачевым (Москва, 2004), на стендовой сессии школы-семинара «Свободные радикалы и заболевания: экспрессия генов, клеточный метаболизм и патофизиология» (Греция, о. Спетсес, 2004).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 128 страницах, иллюстрирована 30 рисунками и 3 таблицами.
ПКС у растений
В клетках растений при ПКС наблюдаются морфологические изменения, сходные с таковыми для клеток животных: конденсация и маргинация хроматина, фрагментация ядер, вакуолизация цитоплазмы. Дробление протопласта на отдельные везикулы, окруженные мембраной (апоптозные тельца), при ПКС у растений наблюдается редко. У животных апоптозные тельца in vivo поглощаются соседними или специализированными клетками, по у растений таких специализированных клеток нет. Кроме того фагоцитоз невозможен из-за наличия клеточной стенки. Поэтому в дальнейшем везикулы или содержимое протопластов разрушаются. В культурах клеток животных наблюдается сходное разрушение, которое названо вторичным некрозом. Разрушение образовавшихся везикул клеток растений может стимулироваться ферментами, секретируемыми соседними клетками. Останки разрушенных клеток утилизируются другими клетками. При отмирании листа клеточные полимеры распадаются, а мономеры вновь используются растением. Однако утилизации продуктов распада отмерших клеток не происходит при ГО, поскольку они несут в себе патоген (Самуилов и др., 20006). Клеточная стенка при ПКС может упрочняться благодаря сшивке белков, образованию целлюлозных утолщений и лигнификации. Этот путь реализуется, например, при формировании сосудов ксилемы, проводящей системы растения (Lam, 2004), и при ГО (Lamb and Dixon, 1997). Другой путь представляет собой разрушение клеточных стенок под действием гидролитических ферментов растения. Деградация клеточных стенок наблюдается при формировании аэренхимы (Gunawardena et al., 2001). При опадании листьев и созревших плодов также идет локальное разрушение клеточных стенок в отделительном слое, но в этом случае клеточная стенка растворяется только частично (Самуилов и др., 20006). Существенная роль в программируемой гибели клеток растений отводится вакуолям. В клетках растений вакуоли выполняют разные функции. В частности, в этом клеточном компартменте могут накапливаться гидролитические ферменты (Marty, 1999), выход которых при разрыве топопласта (вакуолярной мембраны) способствует деградации содержимого клетки. Вакуолизация цитоплазмы практически всегда сопутствует ПКС у растений, однако, выход содержимого из вакуоли может происходить как на ранних, так и па поздних стадиях гибели клетки, в зависимости от формы ПКС (Jones, 2001). Лутофагия в клетках растений также осуществляется с помощью вакуоли (Marty, 1999; Fukuda, 2000; Lam, 2004). При этом вакуоли поглощают участки цитоплазмы и крупные оргапеллы - митохондрии и хлоропласты, что приводит к гибели клетки.
Часто, но не всегда, при ПКС у растений наблюдается олигонуклеосомальная фрагментация ДНК. Показано, что AAL-токсины, продуцируемые грибом Alternaria alternata f. sp, lycopersici, вызывают разрезание ДНК на олигонуклеосомальные фрагменты в семенах и протопластах томатов. Индукция ПКС наблюдалась при действии ГІ2О2, хотя при этом не было выявлено характерной картины фрагментации ДНК (Shimamoto ct а]., 1999). D-Манноза индуцировала апоптоз в корнях резушки и суспензионной культуре клеток кукурузы. Действие D-маннозы приводило к олигонуклеосомалыюй деградации ДНК, совпадающей по времени с активацией ДНКазы в цитозольных экстрактах (Stein and Hansen, 1999). Обработка листьев коровьего горошка и протопластов томатов KCN давала картину «лестницы ДНК» при электрофоретическом разделении нуклеиновых кислот, но другие токсичные реагенты (CuSOj, ZnCl , NaN3) не вызывали «лестничной» фрагментации ДНК, хотя и являлись причиной гибели клеток (Ryerson and Heath, 1996; Wang et al., 1996a). Облучение УФ-светом приводило к олигонуклеосомальному разрезанию ДНК в семенах и протопластах листьев Arabidopsis thaliana (Shimamoto ct al., 1999). Выявлено участие каспазоподобных цистеиновых протеаз при ПКС (Solomon et al., 1999; Korthout ct al., 2000; Wan et al., 2002; Boycc ct al., 2004). Так, протеаза, участвующая в программируемой гибели клеток табака, вызванной вирусом табачной мозаики, обладает каспазоподобной активностью (Chichkova et al., 2004). Эти протеазы были названы метакаспазами. Исследования биохимических свойств метакаспаз растений показывают аналогичную каспазам специфичность к субстратам и чувствительность к специфическим ингибиторам каспаз (Lam and del Pozo, 2000; Woltering et al., 2002). 2.2.2. ПКС в онтогенезе растений В некоторых тканях и органах растений в определенный период развития происходит программируемая гибель клеток. В ряде случаев ПКС способствует формированию специализированных тканей. Ниже рассмотрены примеры ПКС в онтогенезе. Прорастание семян. В семенах злаковых при прорастании происходит гибель клеток алейронового слоя. Из этих клеток высвобождаются различные гидролитические ферменты, разрушающие эндосперм для обеспечения зародыша питанием. В алейроновых клетках ячменя наблюдается олигонуклеосомалъная фрагментация ДНК, чувствительная к действию фитогормопов (Wang et al., 1996b). Однако в более поздней работе, также выполненной на клетках алейронового слоя ячменя, межнуклеосомного разрезания хроматина при обработке гибберелшюм не было обнаружено - ДНК деградировала на более крупные фрагменты (Bethke et al., 1999). Деградация хроматина подавлялась абсцизовой кислотой. При этом гибель алейроновых клеток являлась программируемым процессом. Происходила вакуолизация цитоплазмы, деградация ДНК и последующий разрыв плазматической мембраны клетки с высвобождением ее содержимого. Форма гибели алейроновых клеток идентифицирована как автолиз (Bethke et al., 1999). Ткани корня, В корнях многих видов растений существует специализированная ткань, способствующая аэрации клеток корня, - аэренхима, представляющая собой полость, заполненную воздухом. Аэренхима образуется в результате программируемой гибели клеток (Jones and Dangl, 1996). При образовании аэренхимы, индуцированном гипоксией или фитогормоном этиленом, наблюдаются признаки, характерные для апоптоза: межпуклеосомнос разрезание ДНК, конденсация цитоплазмы и ядерного хроматина, образование везикул, окруженных мембраной и содержащих органеллы, сходных с апоптозиыми тельцами (Gunawardena et al., 2001). Другой случай ПКС в корнях проявляется в клетках корневого чехлика. Эти клетки, образующиеся из корневой меристемы, по мере удлинения корпя гибнут и отслаиваются. Их гибель, по-видимому, является запрограммированным процессом (Shimamoto et al., 1999). Образование проводящих тканей.
Ксилема в онтогенезе подвергается ПКС. Сосуды ксилемы образованы клеточными стенками отмерших клеток. Гибель клеток ксилемы запрограммирована генетически, показана активация специфических TED-генов (tracheary element differentiation). При дифференцировкс клеток ксилемы наблюдается высвобождение содержимого вакуоли и быстрая (в течение 15 мин) деградация ядра. Разрушение ядра происходит в основном за счет активации эидонуклеаз Sl-типа, таких как BEN1 (barley endonuclease 1) и ZEN1 (zinnia endonucleasc 1). При этом не наблюдается строго межнуклеосомной деградации ДНК, как это происходит при апоптозе (Aoyagi et а]., 1998; Ito and Fukuda, 2002). Протеасомы наряду с протеазами играют важную роль в деградации клеточных белков. Ингибиторы протсасом и цистеиновых протеаз, а также ингибитор синтеза белка циклогсксимид предотвращают программируемую гибель клеток ксилемы (Woffenden et al., 1998;Kuriyama, 1999). Центральными органеллами, осуществляющими деградацию клеточного содержимого при ПКС элементов ксилемы, являются вакуоли. Высвобождение из них гидролитических ферментов вызывает деградацию структур клетки (Kuriyama, 1999). Так, нуклеаза ZEN1 имеет оптимум рН 5, наблюдающийся в дифференцирующейся клетке ксилемы после выхода содержимого из вакуоли (Fukuda, 2000). Предполагается, что на начальных стадиях ПКС при дифференцировке клеток ксилемы происходит поглощение Са , активируются цистеиновые протеазы и протеасомы. Гидролитические ферменты (ДНКазы, РНКазы, протеазы) накапливаются в вакуолях, ингибируется транспорт органических анионов в вакуоли, и они увеличиваются в размерах. При этом может происходить деградация части оргапелл и цитоплазмы путем аутофагии. Впоследствии тонопласт вакуоли разрывается и высвобождаются гидролитические ферменты, разрушающие содержимое клетки (Fukuda, 2000). Образование элементов флоэмы также сопряжено с механизмами клеточной деградации. Ситовидные трубки флоэмы не являются мертвыми клетками, однако в онтогенезе подвергаются частичной деградации клеточных структур и лишаются ядер - это похоже на образование безъядерных эритроцитов у млекопитающих (Самуилов и др., 20006). Процесс напоминает ПКС. Происходит набухание и разрыв мембраны центральной вакуоли. Ядро, рибосомы, цитоскелет и аппарат Гольджи при образовании ситовидных трубок флоэмы подвергаются деградации (Van Bel and Knoblauch, 2000; Eckardt, 2001). Формообразование листьев. Листья растения Monstera sp. имеют лопасти и перфорации, образованные в результате локальной программируемой гибели клеток листовых пластинок. Гибель тканей листа является светозависимым процессом (Grccnberg, 1996; Jones and DangI, 1996; Самуилов и др., 20006).
АФК и их роль в программируемой гибели клеток
Кислород является окислителем, широко используемым живыми системами. Различные биохимические процессы, протекающие с участием Oj, сопряжены с образованием ряда активных форм кислорода, характеризующихся высокой окислительной способностью. К АФК относят супероксидный анион-радикал (Ог ), гидропероксидный радикал (UO2), Н20г, гидроксильный радикал (ОН ), сипглстпый кислород ( Oi), N0, пероксинитрит (0N00 ), гипохлорит (НСЮ), а также алкильный (R ), алкоксильпый (R0-) и перокснльный (R00 ) радикалы, образующиеся при окислении липидов (Саприн, Калинина, 1999; Blokhina et al., 2003). В связи с важной ролью N0 в клетке, оксид азота и пероксипитрит в последнее время выделяют в особую группу соединений, называемых активными формами азота (Mikkelsen and Wardman, 2003). Большинство активных форм кислорода представлены свободнорадикальными соединениями, имеющими небольшое время полураспада (t ) и высокий окислительно-восстановительный потенциал. Наиболее высокой реакционной способностью из всех известных соединений обладает гидроксильный радикал (Ео = 2,31 В), однако полураспад его происходит за наносекунды. Тем не менее, ОН крайне опасен для клетки и способен окислить любые клеточные компоненты. 02 - ие очень сильный окислитель, Е0 = -0,33 В, ь/г = 1СГ6 с, однако его лротонир о ванная форма, гидропсроксидный радикал, образующийся в слабокислых средах, имеет высокий окислительно-восстановительный потенциал (1,07 В). Сильными окислителями являются также радикалы липидов: пероксильный радикал (Eof = 1,0 В, tVl = 10 2 с) и алкоксильный радикал (Е0 = 1,7 В, ЬА = 10_6 с).
Синглетный кислород - хороший окислитель, ti/s = 10 6 с. Окислительная способность Н2О2 ниже, чем у свободнорадикальных соединений (Е0 = 0,32 В), по он более стабилен (Sies, 1993; Koppenol, 1994; Саприн, Калинина, 1999), АФК взаимопревращаемы, т.е. появление одной из активных форм кислорода в клетке может приводить к образованию других (Mikkelsen and Wardman, 2003; Mori and Schroeder, 2004): + ё/+ё + Н+ +ё + 2Н+ +ё +ё + 2Н+ + ОН" 02 о2тно2 Н202 ОН 2НгО Первичными АФК, образующимися в клетках, являются синглетный кислород, 02" и NO. Молекулярный кислород в обычных условиях находится в триплетном состоянии ( 02). При взаимодействии с возбужденной молекулой, находящейся в триплетном состоянии, например, молекулой хлорофилла (Okada et al., 1996; Chen and Dickman, 2004), триплетный кислород способен превращаться в синглетный (!02). Образование NO катализируется NO-синтазой (Grant and Loake, 2000; Тарчевский, 2002). Источниками супер оксидного анион-радикала у растений могут служить различные ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции (Cross and Jones, 1991; Blokhina et al., 2003), локализованные в цитоплазме, клеточной стенке, пероксисомах, ЭР, митохондриях и хлоропластах. В кислых средах О2" спонтанно дисмутирует с образованием пероксида водорода. Дисмутация 02" в клетках катализируется ферментом супероксиддисмутазой (СОД): 02т + 02т + 2Н+ - Н202 + 02 Выделяют три группы СОД: с железом, марганцем и медью + цинком в активных центрах. У растений Cu/Zn-СОД локализованы в цитоплазме, пероксисомах и хлоропластах; в митохондриях обнаружены только Мп-СОД, встречающиеся также в пероксисомах; Fe-СОД локализована исключительно в хлоропластах, но встречается лишь у некоторых видов растений (Alscher ct al., 2002). При ГО образование Н202 из 02 катализируется также пероксидазой клеточной стенки (Wojtaszek, 1997; Neill et al., 2002). Гидроксильный радикал образуется в фентоновской реакции (1), при окислении металлов переходной валентности, например, Fe2+, а также в реакции Хабср-Всйса (2): Н202 + Fe2+ - ОН + ОН" + Fc3+ (1) Н202 + 02т - ОН + 02 + Н20 (2) Гидроксильный радикал окисляет любое соединение клетки, находящееся поблизости от места его образования, т.к. имеет малое время жизни. Взаимодействие ОН" с липидами запускает цепную реакцию перекисного окисления, в результате которой нарушаются структура и функции биологических мембран (Владимиров, 2000; Blokhina et al., 2003). При перекисном окислении липидов образуются алкильный, алкоксильный и пероксильный радикалы: ОН + RH -» Н20 + R (алкильный радикал) R + 02 — ROO (пероксильный радикал) ROO + RH ROOH (гидр опер о кс ид липида) + R ROOH — ОН" + RO (алкоксильный радикал, реакция катализируется 02" или Fe +) RO + RH -» ROH + R Пероксииитрит образуется в результате реакции между оксидом азота и супероксидным анион-радикал ом (Grant and Loake, 2000): NO + 02т - ONOO" Главная опасность пероксинитрита (Владимиров, 2000; Mikkelsen and Wardman, 2003), а таюке гипохлорита (Арнхольд, 2004), состоит в том, что они способны вызывать образование гидроксильного радикала: ONOO + Н+ -» ОН + O-N-O (диоксид азота) НСЮ + Fe2+ - ОН" + СГ + Fe3+ нею + о2 - он- + СГ + 02 В клетках образование АФК может быть как контролируемым (активация NADPH-оксидазы, NO-синтазы), так и случайным процессом, сопровождающим окислительно-восстановительные реакции. В связи с высокой реакционной способностью этих соединений и опасностью окисления ими клеточного содержимого, живые организмы имеют защиту от АФК -антиоксидантную систему.
Основными ферментами, обладающими антиоксидантными свойствами, являются СОД, каталаза, пероксидазы. К низкомолекулярным антиоксидантам относятся аскорбат, глутатион, о токоферол, каротиноиды (Blokhina ct al., 2003). Каталаза утилизирует пероксид водорода, образующийся из 02 под действием СОД: 2Н202 - 2Н20 + 02 В результате образуются безопасные для клетки соединения. Пероксидазы катализируют аналогичные реакции, но используют различные субстраты для восстановления пероксида до Н20. Существуют пероксидазы, например, широко используемая в биохимии пероксидаза хрена, обладающие низкой субстратной специфичностью, способные использовать разные субстраты в качестве восстановителей. Другие пероксидазы (Blokhina et al., 2003), напротив, разборчивы к субстратам: аскорбатпероксидаза (1) окисляет аскорбат, а глутатиоппероксидаза (2), предотвращающая перекисное окисление липидов, — восстановленный глутатион (GSH): Н2О2 + 2 аскорбат — 2Н20 + 2 монодегидроаскорбат (1) ROOH + 2GSH - R + 2Н20 + GSSG (2) В строме хлоропластов (Asada, 1999) и матриксе пероксисом (del Rio ct al„ 2002) функционирует аскорбат-глутатиоииый цикл, направленный на утилизацию Н202, образующегося в этих структурах в достаточно большом количестве. Пероксид водорода восстанавливается аскорбатом с образованием Н20. Реакция катализируется аскорбатпероксидазой или происходит спонтанно. Образующиеся при этом монодегидроаскорбат (1) и дегидроаскорбат (2) восстанавливаются ферментами монодегидроаскорбатредуктазой (3) и дегидроаскорбатредуктазой (4) соответственно. В качестве восстановителя монодегидроаскорбатредуктаза использует NAD(P)H, образуя в результате NAD(P)+ и аскорбат. Дегидроаскорбатредуктаза для восстановления дегидроаскорбата использует 2 молекулы GSH, которые, окисляясь, превращаются в GSSG (окисленный глутатион). В дальнейшем GSSG восстанавливается до GSH с помощью глутатиоиредуктазы (5), окисляющей NADPH (Asada, 1999; del Rio et al., 2002; Blokhina et al., 2003): H2O2 + 2 аскорбат — 2H20 + 2 монодегидроаскорбат (1) H202 + аскорбат - 2H2O + дегидроаскорбат (2) 2 монодегидроаскорбат + NAD(P)H + Н+ - 2 аскорбат + NAD(P)+ (3) 2GSH + дегидроаскорбат — GSSG + аскорбат (4) GSSG + NADPH - 2GSH + NADP+ (5) Низкомолскулярные аптиоксиданты (аскорбат, глутатион) могут использоваться в качестве субстратов для пероксидаз. Возможно также непосредственное взаимодействие их с Н2О2. Так, аскорбат реагирует с пероксидом водорода с образованием дегидроаскорбата. При окислении псроксидом SEI-групп остатков цистеина, обычно происходит инактивация белка. Восстановленный глутатион используется для S-глутатионилирования с последующим восстановлением SIT-rpynn. Таким образом, белки возвращаются в нормальное состояние с помощью GSH и тиоловых трансфераз (Thannickal and Fanburg, 2000).
Результаты исследования
В качестве индуктора ПКС использовали CN". Данные литературы подтверждают, что CN индуцирует апоптоз в клетках растений (Ryerson and Heath, 1996; Wang et al., 1996a), ПКС устьичных клеток регистрировали по разрушению ядер. Исследовали зависимость разрушения ядер устьичных клеток от концентрации CN" (рис. 8). Цианид вызывал разрушение ядер устьичных По данным оксиметрии (рис. 10, линия 1), ротенон, ингибитор комплекса I дыхательной цепи, не оказывал влияния на поглощение кислорода (дыхание), нарезками листьев гороха в темноте. При добавлении CN дыхание подавлялось, но не прекращалось. Полное подавление дыхания наблюдалось при последующем добавлении бензилгидроксамата - ингибитора альтернативной оксидазы. В условиях подавления цианидом цитохром с-оксидазы, перенос электронов на кислород осуществлялся через альтернативігую оксидазу, ингибитором которой являлся бензилгидроксамат. Включение света вызывало фотосинтетическое выделение кислорода, которое прекращалось при добавлении CN- (рис. 10, линии 2, 3). Последующее включение реакции Хилла добавлением искусственного акцептора электронов бепзохинона в комбинации с феррицианидом вновь приводило к светозависимому выделению Oz (рис. 10, линия 2). Выделение кислорода в реакции Хилла подавлялось DCMU (диуроном), ингибитором переноса электронов между первичным (QA) и вторичным (Qn) хинонами в ФС II. На фоне DCMU наблюдалось дыхание с участием альтернативной оксидазы, которое подавлялось пропилгаллатом, являющимся, как и бензинлгидроксамат, ингибитором альтернативной оксидазы. Метилвиологсп, восстанавливаясь ФС I, самопроизвольно окисляется 02 с образованием (V, приводя к уменьшению концентрации кислорода в растворе. В присутствии CN на свету после добавления мстил виол оген а регистрировалось увеличение скорости поглощения кислорода (рис. 10, линия 3). DCMU, ингибируя ФС II, подавлял поглощение С 2, вызванное метилвиологеном. Остаточное поглощение О2 на фоне CN- и DCMU с участием альтернативной оксидазы подавлялось пропилгаллатом. Данные, полученные с использованием реагентов Хилла и метилвиологена, показывают, что после обработки CN" ФС II, 6,/-цитохромный комплекс и ФС I хлоропластов сохраняют способность к транспорту электронов. С помощью оптической микроскопии исследовали морфологию CN -индуцированного разрушения ядер устьичных клеток.
Клеточные ядра полностью исчезали в клетках, обработанных цианидом. Исчезновение ядер является критерием клеточной гибели (рис. 11). При действии цианида в устьичных клетках на промежуточных стадиях потери ядра наблюдалась фрагментация ядер - признак апоптоза. По данным электронной микроскопии, полученным нами совместно с Л.Е.Бакеевой и Е.В.Дзюбинской, CN" вызывал конденсацию и маргинацию хроматина, вакуолизацию цитоплазмы и деструктивные нарушения структуры митохондрий и хлоропластов (данные не представлены). Такие изменения ультраструктуры клеток характерны для апоптоза. После инкубации эпидермальных пленок с флуоресцентным зондом DCFH-DA с помощью флуоресцентной микроскопии наблюдали за изменением флуоресценции зонда в клетках эпидермиса. Появление интенсивно флуоресцирующего DCF, который образуется из нефлуоресцирующего DCFH в клетках при окислении, коррелирует с уровнем образования АФК в клетках (LeBel et al, 1992). Отмечено, что флуоресценция в устьичных клетках была гораздо интенсивнее, чем в окружающих их эпидермальных (рис. 12). Исследована зависимость разрушения ядер в темноте и на свету от времени инкубации с цианидом. В клетках, не обработанных цианидом, ядра сохранялись в течение нескольких суток (см. раздел 3.3.4.). Освещение значительно усиливало СЫ"-индуцированное разрушение ядер устьичных клеток (рис. 13). Вероятнее всего, влияние света на гибель хлоропластсодержащих клеток гороха обусловлено участием хлоропластов в ИКС у растений. 3.2.2. Влияние антиоксидантов, анаэробных условий, состояния фотосинтетической и дыхательной ЭТЦ, ингибиторов протеинкиназ и протеаз на CN -индуцированное разрушение ядер АФК являются индукторами апоптоза как у животных, так и у растений (Levine et al., 1994; Pedroso et al., 2000; Zorov et al., 2000; Dat et al., 2003). Генерация АФК усиливается при запуске программы клеточной гибели. Соединения, обладающие аитиоксидантной функцией, снижая концентрацию АФК в клетках, предотвращают апоптоз. Было исследовано действие антиоксидантов на С Г-индуцированное разрушение ядер устьичных клеток. Данные, представленные в таблице 1 показывают, что липидорастворимый антиоксидант сс-токоферол (Trebst et аі., 2002) предотвращает разрушение ядер, вызванное цианидом в темноте и на свету. Маннитол, являющийся ловушкой для гидроксильного радикала (Shen et аі., 1997), предотвращает CN -индуцировапное разрушение ядер на свету. Сорбитол, оптический изомер машштола, не обладающий антиоксидантними свойствами и взятый в качестве контроля, не оказывал влияние на разрушение ядер устьичных клеток, индуцированное цианидом. Анаэробиоз сам по себе не вызывает разрушения ядер и эффективно предотвращает С Г-индуцированное разрушение ядер на свету и в темноте (табл. 1). Подобно метилвиологену, восстанавливающемуся ФС I, мспадион (витамин Кз) способен образовывать CV, восстанавливаясь ФС II, b$f-цитохромным комплексом и ФС I хлоропластов и окисляясь кислородом. Добавление метилвиологена и менадиона к клеткам растений вызывает генерацию АФК (Ог ). Метилвиологен и менадион сами не вызывали разрушения ядер в темноте и на свету (данные не представлены). В комбинации с CN" эти соединения предотвращали разрушение ядер, индуцированное цианидом в темноте и на свету (табл. 1). Такое же действие оказывали другие акцепторы электронов в реакции Хилла (БХ, ДАД, ТМФД, ДФИФ), которые, в отличие от метилвиологена и менадиона, не окисляются Ог с образованием супероксидного анион-радикала. Метилвиологен не оказывал эффекта на СН -индуцированное разрушение ядер в условиях анаэробиоза (табл. 1).
Ингибитор переноса электронов в ФС II DCMU снижал CN -индуцироваиное разрушение ядер на свету и не оказывал влияния в темноте (табл. 1). Разрушение ядер на свету также предотвращалось DNP-INT и" стигмателлином, ингибиторами окисления пластохинопа FeS-протеином Риске в б цитохромном комплексе хлоропластов. Известно, что ПКС у животных и растений, как и многие другие процессы в клетках, регулируется протеинкиназами (Ren et al., 2002). Протеазы играют роль основных исполнителей программы клеточной гибели, разрушая белковые компоненты клеток животных (Chang and Yang, 2000) и растений (Chichkova ct al., 2004). Ингибитор протеинкиназ стауроспорин, ингибиторы цистеиновых протеаз N-этилмалеимид и йодацетамид, ингибитор сериновых протеаз фенилметилсульфонилфторид, хотя и пс обладают высокой специфичностью, тем не менее подавляли разрушение ядер устьичных клеток (табл. 1). Данные свидетельствуют об участии протеаз и протеинкиназ в программируемой гибели устьичных клеток. Ротснон является ингибитором комплекса I дыхательной цепи митохондрий. В отличие от животных, у растений ротенон не подавляет перенос электрона в митохондриальной ЭТЦ (рис. 10, линия 1), так как митохондрии растений имеют альтернативные пути окисления NAD(P)H (Siedow and Umbach, 1995; 2000), в обход комплекса I. Ротенон сам по себе не вызывал разрушения ядер и не оказывал воздействия на индуцированное цианидом разрушение ядер устьичных клеток в темноте (рис. 14). Альтернативная оксидаза митохондрий растений обладает антиоксидантной функцией (Maxwell et al., 1999). Ее нарушение повышает уровень АФК в клетке. Было исследовано влияние ингибитора альтернативной оксидазы бензил гидр оксамата на гибель устьичных клеток в темноте. Бснзилгидроксамат сам по себе не вызывал разрушения ядер и снижал уровень CN -индуцированного разрушения ядер (рис. 14). сс-Кетокислоты, в том числе пируват, являются индукторами альтернативной оксидазы у растений (Rhoads et al., 1998). Пируват, в отличие от бензил гидр оксамата, сам по себе вызывал небольшое разрушение ядер (рис. 14). В комбинации с CN- пируват усиливал деградацию клеточных ядер. Таким образом, активация альтернативной оксидазы стимулировала ПКС и наоборот.
Обсуждение результатов
Исследована программируемая гибель устьичных клеток гороха. У животных содержимое клетки при апоптозе дробится на везикулы - апоптозные тельца. Впоследствии апоптозные тельца разрушаются (вторичный некроз) или фагоцитируются соседними клетками, В результате клетка полностью исчезает. У растений (применительно к нашему объекту) после ПКС остается клеточная стенка, благодаря чему легко оценивать количество погибших клеток. Регистрация апоптоза осуществляется различными методами. Часто используют методы выявляющие появление фосфатидилсерииа в наружном слое плазматической мембраны, межнуклеосо.мную деградацию ДНК, увеличение активности каспаз. Однако биохимические методы не всегда отражают реальную картину происходящего. В случае если гибель клеток осуществляется не через апоптоз, а, например, через аутофагию, вышеперечисленные способы определения ПКС могут оказаться некорректными. С этой точки зрения наиболее адекватным методом регистрации клеточной гибели представляется визуальное наблюдение за клеткой и ее ядерным аппаратом - главной мишени ПКС. Цианид, выбранный нами в качестве индуктора ПКС, обладает рядом достоинств по сравнению с другими биотическими и абиотическими индукторами ПКС. Это соединение легко проникает в клетки, вызывая их массовую гибель. Механизм действия CN на различные клеточные ферменты достаточно хорошо изучен. Кроме того, цианид не является чужеродным соединением в клетках растений (Vcttcr, 2000). CNT вызывал гибель устьичиых клеток гороха. Действие цианида усиливалось на свету. Показано, что у растений цианид вызывает апоптоз. Наблюдалась олигонуклеосомальная фрагментация ДНК (признак апоптоза) при обработке цианидом протопластов и клеток листьев (Rycrson and Heath, 1996; Wang et al., 1996a). На основании данных оптической (фрагментация ядер) и электронной микроскопии (характерные для апоптоза изменения ультраструктуры) СТ -индуцированная гибель устьичиых клеток идентифицирована нами как апоптоз. Несмотря на то, что цианид инактивирует рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазу в хлоропластах и цитохром ооксидазу в митохондриях, сохраняется возможность переноса электронов в ЭТЦ. При обработке устьичиых клеток гороха цианидом, как показывают данные оксиметрии, могут функционировать компоненты ЭТЦ хлоропластов (ФС II, б цитохромный комплекс и ФС I) и митохондрий.
При этом в митохондриях перенос электронов на кислород осуществляется с помощью альтернативной оксидазы (Siedow and Umbach, 2000). В хлоропластах возможен циклический перенос электронов при участии ФС I и б цитохромного комплекса и псевдоциклический перенос электронов (цикл «вода-вода», Asada, 1999). Цианид в клетках также подавляет активность гемсодержащих антиоксидантиых ферментов - каталазы и пероксидаз, которые осуществляют утилизацию Н2О2 и являются важнейшими компонентами защиты клеток от окислительного стресса. Таким образом, обработка цианидом может приводить к увеличению содержания АФК в клетках и тем самым индуцировать ПКС. Данные, полученные с использованием антиоксидантов, подтверждают, что СЫ -индуцированная гибель устьичиых клеток опосредована АФК. Стимуляция СТчГ-иидуцировашюго разрушения ядер при освещении, свидетельствует об участии хлоропластов в ПКС. Это также подтверждается данными о предотвращении световой стимуляции CN -индуцированной гибели клеток ингибиторами переноса электронов в фотосинтетической ЭТЦ (DCMU, стигмателлином и DNP-INT). Каким образом хлоропласта участвуют в программируемой гибели устьичных клеток? На основании полученных результатов о действии антиоксидантов вклад хлоропластов в разрушение ядер мог бы объясняться их участием в ПКС в качестве дополнительных источников АФК (см. также обзор литературы). По данным, представленным в обзоре Асады, до 30% электронного потока в хлоропластах может участвовать в цикле «вода-вода» (быть направлено на восстановление кислорода до Ог ), особенно в условиях подавления цианидом рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы (Asada, 1999). Цианид также ингибируст активность Cu/Zn-супероксиддисмутазы в хлоропластах, однако, по-видимому, полного подавления образования Н2О2 из 02 достичь не удается. Супероксиддисмутаза обладает очень высокой удельной активностью (2-10 М" с-1, см. Asada, 1999) и остается достаточно активной даже после обработки CN". По данным оксиметрии светозависимая менадион-индуцированная генерация Су приводит к образованию Н2О2, которое детектируется по выделению ( после добавки каталазы. При этом активность каталазы сохранялась на довольно высоком уровне даже на фоне 2,5-10 мМ CN" (данные не представлены). Таким образом, работа хлоропластов может вести к значительному увеличению концентрации АФК в клетках растений. Данные флуоресцентной микроскопии с использованием красителя, чувствительного к АФК, показали, что генерация активных форм кислорода в хлоропластсодержащих устьичных клетках намного выше, чем в эпидермальных - это может свидетельствовать о значительном вкладе хлоропластов в генерацию АФК. Использование цианида в качестве индуктора ПКС будет давать неадекватные результаты, так как окисление флуоресцентного красителя зависит от активности пероксидаз в клетке, a CN" является их ингибитором. На основании предположения о том, что хлоропласты - дополнительные источники АФК при ПКС, ожидалось, что метилвиологеп и менадиоп, соединения, значительно усиливающие генерацию АФК в клетках, будут стимулировать ПКС. Однако наши данные показывают обратный результат. Другие акцепторы электронов в реакции Хилла (БХ, ДАД, ТМФД и ДФИФ) действуют подобно метил виол ore ну и менадиону, следовательно, предотвращение CN -индуцированного разрушения ядер этими соединениями связано, по-видимому, с их способностью окислять компоненты фотосинтетической ЭТЦ. На основании этого было сделано предположение, что участие хлоропластов в программируемой гибели устьичных клеток не ограничивается их вкладом в образование АФК, и что, по-видимому, какой-то компонент ЭТЦ хлоропластов также может регулировать процесс ПКС. Известно, что редокс-состояние пластохинона регулирует фосфорилирование белков тилакоидных мембран (Vener et al., 1997; Wollman, 2001). Работа фотосинтетической ЭТЦ на ярком свету приводит к восстановлению хинона.
Пластохинол, через невыясненный механизм вызывает активацию протеинкиназ, фосфорилирующих белки, что ведет к изменению положения тилакоидных белков относительно друг друга и расстыковке тилакоидов в гранах хлоропластов. Это явление, названное спилловером, способствует перераспределению энергии светового возбуждения между евстсобирагощими комплексами ФСI и II. Возможно, подобным образом пластохинон регулирует и ПКС. Ингибируя рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазу, CN" приводит к восстановлению компонентов ЭТЦ хлоропластов, включая пластохинон. В этих условиях ингибиторы переноса электронов DCMU, стигмателлин и DNP-INT предотвращают восстановление пластохигюна на участке о цитохромного комплекса, а акцепторы электронов метилвиологен, менадион, БХ, ДАД, ТМФД и ДФИФ окисляют пластохинон. Вероятно, так объясняется подавление CN -индуцировашюго разрушения ядер этими соединениями. Их действие подтверждает предположение о регуляции ПКС редокс-состоянием пластохинона. По результатам, представленным в таблице I, сопоставлены данные о возможности образования АФК, предполагаемом состоянии пластохинона ЭТЦ хлоропластов и наблюдаемом разрушении ядер (табл. 2). Эти данные показывают, что программируемая гибель устьичных клеток зависит комбинированного действия двух факторов: АФК и редокс-состояния пластохинона на участке о й цитохромного комплекса. При совместном действии этих факторов (АФК + восстановленный пластохинон) ПКС реализуется с максимальной эффективностью (табл. 2). Поскольку восстановленный пластохинон является активатором протеинкиназ (Verier et al., 1997; Wollman, 2001) и, с другой стороны, протеинкиназы принимают участие в ПКС у животных и растений (Desikan et al, 1999; Ren et al., 2002), предполагается следующий механизм регуляции программируемой гибели устьичных клеток пластохиноном (PQ) хлоропластов: свет + CN" — РОНг активация протеинкиназ - ПКС.
