Программируемая гибель клеток и окислительный стресс, вызванные ингибиторами митохондриальных функций Изюмов Денис Сергеевич

Содержание к диссертации

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4

ВВЕДЕНИЕ 7

Актуальность проблемы 7

Цель и задачи исследования 8

Научная новизна работы 8

Практическая ценность работы Ю

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11

Общие положения о программированной смерти клеток 1Г

Участие каспаз в апоптозе 12

Активация апоптоза с участием рецепторов 13

Митохондриалъный путь активации каспаз 16

Проапоптозные белки митохондрий 17

Независимая от каспаз гибель клеток 18

Роль белков семейства Bcl-2 в апоптозе 18

Участие кальция в апоптозе 23

Активные формы кислорода и азота 25

Роль комплекса 1 дыхательной цепи в продукции АФК. 27

Роль комплекса III дыхательной цепи в продукции АФК 30

Антиоксидантные системы клетки 32

Влияние АФК на гибель клеток 36

Регуляция апоптоза с помощью АФК и АФА 37

Продукция АФК при фотодинамической обработке клеток 42

Механизмы гибели клеток, индуцированной истощением АТР 47

Сенсоры уровня АТР в клетках 53

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 56

Использованные культуры клеток 56

Использованные реагенты 56

Приготовление растворов и сред для культивирования клеток 58

Приготовление фосфатного буфера 58

Приготовление безглюкозной поддерживающей среды Рингера-Кребса 58

Приготовление растворов трипсина и ЭДТА 59

Приготовление питательной среды Игла, модифицированной Дальбекко 59

Методы работы 59

Пересев клеток 59

Замораживаие и размораживание клеточных культур 60

Пересев клеток для экспериментов 60

Определение концентрации клеток с помощью камеры Горяева 60

Определение жизнеспособности клеток 61

Определение жизнеспособности клеток с использованием флуоресцентных красителей 61

Определение продукции АФК 62

Регистрация дыхания клеток 62

Иммунофлуоренсцентное окрашивание клеток 63

Регистрация выхода цитохрома с с помощью Western блота 63

Истощение уровня АТР в клетках и его восстановление 64

Разделение фрагментированных молекул ДНК с помощью электрофореза 64

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 66

Измерение дыхания клеток линий HeLa и HeLa-Bcl-2 66

Влияние митохондриальных ингибиторов на гибель клеток 67

Влияние биоэнергетических функций митохондрий на апоптоз клеток, индуцированный

стауроспорином 67

Влияние биоэнергетических функций митохондрий на апоптоз клеток, индуцированный

фактором некроза опухолей-а 69

Олигомицин ингибирует апоптоз клеток HeLa, индуцированный ФНО-А 70

Окислительный стресс, индуцируемый ФНО-а и действие митохондриальных ингибиторов 73

Исследование продукции АФК митохондриями клеток HeLa, индуцированной фотоактивацией
флуоресцентного красителя Mitotracker Red 74

Исследование окислительного стресса и апоптоза, индуцированных временным снижением

уровня АТР в клетках HeLa 81

Комбинация 2-ДОГ и митохондриальных ингибиторов вызывает снижение уровня АТР в клетках

HeLa 81

Временное снижение уровня АТР вызывает гибель клеток HeLa 83

Апоптоз клеток HeLa, вызванный временным снижением уровня АТР в клетках, сопровождается

транслокацией белка Вах и выходом цитохрома с из митохондрий 85

Дробление молекул ДНК при апоптозе 88

Апоптоз клеток HeLa, вызванный временным падением уровня АТР, сопровождается окислительным

стрессом 88

Глубокое снижение уровня АТР вызывает преимущественно некротическую гибель клеток HeLa 90

Вляниеудаления сыротки из среды инкубации на гибель клеток HeLa, индуцированную
митохондриальными ингибиторами 92

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 94

ВЫВОДЫ ОШИБКА! ЗАКЛАДКА НЕ ОПРЕДЕЛЕНА.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 107

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ЭР — эндоплазматический ретикулум

ЭТЦ — электронтранспортная цепь

ЭТС — эмбриональная телячья сыворотка

AIF — апоптоз-индуцирующий фактор

АМРК — АМР-активируемая протеинкиназа

Apaf — фактор, активирующий апоптозные протеазы

АТР — аденозинтрифосфорная кислота

BIR — бакуловирусный 1АР-повтор

CAD — ДНКаза, активируемая каспазами

CM-DCF-DA — 5-(и-6)-хлорметил-2',7'-дихлородигидрофлуоресцеин

*

*

TRAF — фактор, ассоциированный с рецептором ФНО-а

UCP — разобщающие белки

Д\|/ — митохондриальный мембранный потенциал

Введение к работе

В последние годы мы стали свидетелями революционных событий в митохондриологии. Привычное представление о митохондриях как об энергетических станциях клетки, производящих АТР, общие принципы действия которых известны (хемиосмотическая теория сопряжения), сменилось на представление о них, как об органеллах, в котором заключены факторы, определяющие судьбу клетки. Ранее роль митохондрий в развитии патологий ограничивалось нарушением энергообеспечения при токсических и гипоксических повреждениях. Теперь на передний план вышли "побочные" процессы, в которых участвуют митохондрии, такие как продукция активных форм кислорода (АФК), нарушение внутриклеточной передачи сигналов и выход из митохондрий белков, способных активировать программу гибели клеток (апоптоз) (Черняк и др., 2005). Среди этих белков центральное место занимает цитохром с, который, оказавшись в цитоплазме, участвует в образовании апоптосомы, катализирующей активацию каспаз - специфических протеаз, участвующих в апоптозе.

Окислительный стресс считается основным компонентом в развитии многих серьезных патологий и естественного старения организма. АФК, производимые митохондриями, рассматриваются в качестве одного из факторов, усиливающих внутриклеточный окислительный стресс. Исследования последних лет прояснили многие детали механизмов генерации АФК в митохондриях, но общая картина процесса пока не ясна. Нехватка фактических данных пока еще не позволяет достаточно полно обосновать представления о роли митохондрий в окислительном стрессе. Кроме того вклад именно митохондриальных АФК предстоит продемонстрировать в случае различных патологий (Андреев и др., 2005). Митохондрии способны воспринимать разнородные сигналы, поступающие из внеклеточной среды (через специфические рецепторы, как в случае цитокинов, или без них, как при физических стрессах) и от других клеточных структур (ядра, цитоскелета, ретикулума и др.), перерабатывать их и выдавать сигнал, который может практически неизбежно привести клетку к гибели. На каждой из этих стадий не установлены многие принципиальные механизмы, не идентифицированы все компоненты сигнальных путей, не прослежена их связь и соотношение этих

процессов с основными биоэнергетическими функциями митохондрий. Практически ко всем компонентам окислительного фосфорилирования были найдены селективные ингибиторы (в основном антибиотики), а затем были расшифрованы механизмы их действия. Использование этих ингибиторов позволило прояснить механизмы многих биоэнергетических процессов.

Таким образом, исследования в описанной области являются, без сомнения, достаточно актуальными. Прояснение роли биоэнергетических процессов митохондрий в развитии окислительного стресса и программируемой гибели клеток (ПКС) позволит человеку более эффективно бороться с заболеваниями, в основе которых лежит повышенная продукция АФК и нарушения реализации апоптоза.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы являлось исследование роли биоэнергетических функций митохондрий в апоптозе и окислительном стрессе клеток HeLa, активируемых через рецепторы плазматической мембраны (ПМ), ингибирование протеинкиназ, путем фотодинамической обработки клеток и временным снижением уровня АТР в клетках.

Задачи исследования:

1. Исследование действия митохондриальных ингибиторов на апоптоз и окислительный стресс клеток HeLa, индуцируемые фактором некроза опухолей-а (ФНО-а) и стауроспорином (СТ).

2. Исследование действия митохондриальных ингибиторов на продукцию АФК в митохондриях, индуцированную фотодинамической обработкой клеток HeLa.

3. Исследование механизмов окислительного стресса и гибели клеток HeLa, вызванных временным снижением уровня АТР.

Научная новизна работы

В работе проведено исследование влияния митохондриальных ингибиторов на гибель клеток HeLa и окислительный стресс, активируемые в различных экспериментальных моделях, лежащих в основе развития многих патологий человека. Установлено, что ингибиторы электронтранспортной цепи (ЭТЦ) митохондрий, разобщители окислительного фосфорилирования не вызывают

гибели клеток HeLa в исследуемые промежутки времени. Кроме этого они не влияли на окислительный стресс и апоптоз клеток, вызванные обработкой клеток ФНО-а и СТ. Экспрессия белка Вс1-2 подавляла окислительный стресс и апоптоз, индуцированные действием ФНО-а и СТ. Ингибитор АТР-синтазы олигомицин подавлял все проявления апоптоза (продукцию АФК, фрагментацию ядра и выход цитохрома с из митохондрий), индуцированные ФНО-а, но не СТ. Предполагается, что защитное действие олигомицина опосредовано ингибированием неспецифической митохондриальной гигантской поры (ГП) и не связано с ингибированием АТР-синтазы и влиянием олигомицина на трансмембранный потенциал митохондрий.

Разработана модель митохондриальной продукции АФК, индуцированной фотоактивацией специфического митохондриального красителя Mitotracker Red. В этой модели показано, что ингибиторы комплекса I (ротенон и пиерицидин А) и комплекса III (миксотиазол) дыхательной цепи митохондрий значительно стимулировали продукцию АФК комплексом I. Этот процесс подавлялся при добавлении ингибитора флавинов дифенилениодония (DPI) и антиоксидантов N-ацетилцистеина и митохондриально-направленного mitoQ. Полученные данные позволяют предположить, что источником АФК в данном случае являлся флавиновый компонент комплекса I.

Показано, что временное снижение уровня АТР в клетках, вызванное одновременным ингибированием гликолиза (с помощью конкурентного ингибитора гликолиза 2-дезокси-0-глюкозы (ДОГ)) и окислительного фосфорилирования вызывает апоптоз клеток HeLa. В качестве митохондриальных ингибиторов использовали олигомицин, миксотиазол и разобщитель окислительного фосфорилирования FCCP. Глубина падения уровня АТР (примерно на 60% от исходного уровня) и гибель клеток не зависели от типа используемого митохондриального ингибитора. Апоптоз сопровождался повышенной продукцией АФК, но не был чувствителен к действию антиоксидантов. Более глубокое или более длительное снижение уровня АТР в клетках вызывало преимущественно некротическую гибель клеток, которая в отличие от апоптоза не была чувствительна к экспрессии белка Вс1-2 и не подавлялась ингибитором каспаз

zVADfmk. Предполагается, что существуют некоторые "АТР-метры", отслеживающие изменения уровня АТР в клетках и запускающие сигнал к гибели.

Практическая ценность работы

Исследование роли митохондрий в развитии окислительного стресса и апоптоза в последнее время приобретает все большее значение. Этот интерес связан с возрастающим количеством доказательств участия этих процессов в развитии многих патологий человека. Большее понимание механизмов окислительного стресса и гибели клеток, понимание роли митохондрий в этих процессах поможет обрести новые средства борьбы с различными заболеваниями, такими как инсульт, инфаркт, нейродегенеративные заболевания и др.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Общие положения о программированной смерти клеток

В последние годы в научной литературе появляется все большее количество работ, посвященных исследованию апоптоза. Этот процесс является генетически регулируемым и по важности для организма стоит на одном уровне с пролиферацией и дифференцировкой. Многие важные процессы организма, такие как образование тканей, элиминация потенциально опасных клеток, борьба с патогенами, удаление органов или структур, не нужных организму после определенной стадии развития или не нужных определенному полу, осуществляются посредством апоптоза (Jacobson et а]., 1997). При этом нарушения в реализации апоптозной программы могут приводить к различным заболеваниям у человека, связанных с накоплением ненужных организму собственных измененных потенциально опасных раковых клеток или, наоборот, с излишними потерями клеток, наблюдаемыми, например, при нейродегенеративных или ишемических заболеваниях (Bratton et al., 2001).

Гибель клеток посредством апоптоза сопровождается ядерной и цитоплазматической конденсацией, при этом клетка дробится на апоптозные тельца, которые впоследствии поглощаются соседними клетками или макрофагами. Таким образом, клетка, зараженная патогеном, может погибать вместе с ним, препятствуя его размножению.

Характерными биохимическими признаками апоптоза являются снижение трансмембранного потенциала митохондрий, продукция АФК, выход фосфатидилсерина на поверхность клеточной мембраны, селективный протеолиз, олигонуклеосомная фрагментация молекул ДНК.

Существует альтернативный тип гибели клеток - некроз, возникающий при острых патологических реакциях, происходящих при действии экстремальных факторов. При некрозе клетки набухают, теряется целостность ПМ, при этом содержимое некротических клеток может попадать на соседние клетки, что приводит к развитию воспалительного процесса (Новиков, 1996). Ранее считалось, что некроз является генетически нерегулируемым типом гибели. В настоящее время в ряде моделей показано, что некротическая гибель клеток может сопровождаться активацией сигнальных путей, участвующих в апоптозных

процессах процессах. Кроме этого часто недостаточный для протекания апоптоза уровень АТР в клетках может приводить их к гибели путем некроза, даже после специфических апоптозных стимулов (Single et al., 2001).

Участие иаспаз в апоптозе

Ключевым этапом исполнения апоптозной программы является активация уникального класса протеаз, называемых каспазами (от caspase - cisteine aspartase или цистеиновые аспартазы). Эти протеазы содержат в своем активном центре цистеин и ведут расщепление субстратов вблизи остатков аспарагиновой кислоты. Предшественники каспаз - прокаспазы состоят из продомена и двух субъединиц: большой и малой. Некоторые каспазы содержат короткий линкер (около 10 аминокислот) между субъединицами. Каспазы способны активировать друг друга, при этой активации от прокаспазы отщепляется продомен, а большие и малые субъединицы двух прокаспаз формируют активную каспазу - тетрамер, обладающую двумя активными центрами (Green, 1998).

Каспазы, относящиеся к инициаторному и воспалительному типам, содержат длинный продомен, состоящий из примерно 100 аминокислот, в то время как короткий продомен эффекторных каспаз содержит только 30 аминокислотных остатков. Длинные продомены содержат различные мотивы, в основном DED (death effector domain, эффекторный домен смерти) и CARD (caspase recruitment domain, домен, рекрутирующий каспазы). Недавно был обнаружен DID (death inducing domain, домен, индуцирующий смерть). Каждая из прокаспаз-8 и -10 содержит две тандемные копии DED, в то время как CARD-домен обнаружен в каспазах-1, -2, -4, 5, -9. Эти домены опосредуют гомофильные взаимодействия между прокаспазами и их адаптерными молекулами и играют важную роль в активации прокаспаз (Chang and Yang, 2000).

Помимо различий в структуре продоменов, каспазы могут быть сгруппированы по их субстратной специфичности. Каспазы-6, -8 и -9 предпочтительно расщепляют субстраты с последовательностью валин/лейцин-глутамат-треонин/гистидин-аспартат (V/L-E-T/H-D), в то время как каспазы-3 и -7 селективно расщепляют мотив, состоящий из последовательности аспартат-глутамат-валин-аспартат (D-E-V-D). Оптимальной мишенью для каспазы-1 и родственным ей каспазам-4 и -5 являются последовательности тирозин-валин-

аланин-аспартат (YVAD) или триптофан/лейцин-глутамат-гистидин-аспартат (W/L-E-H-D) (Haunstetter et al., 1998).

Каспазы могут ингибироваться некоторыми белками вирусов и млекопитающих, включая белки IAP (inhibitor of apoptosis, ингибитор апоптоза), впервые идентифицированные у бакуловирусов. Это эволюционно закрепленные белки, содержащие тандем повторов (примерно 70 аминокислот) называются BIR (baculovirus IAP-repeats, бакуловирусные IAP-повторы). Их аналоги найдены у млекопитающих (XIAP, ML-IAP, survivin и т. д.). Белок XIAP способен ингибировать каспазы-3, -7 и -9 (причем через разные домены), но не каспазу-8 (Bratton et al., 2001; Cryns et al., 1998).

Различные формы посттрансляционной модификации могут влиять на активность каспаз. Например, фосфорилирование каспазы-9 с помощью серин-треониновой протеинкиназы Akt ингибирует ее активность. При этом фосфорилирование осуществляется вдалеке от активного центра каспаз и, вероятно, мешает сборке субъединиц каспазы в тетрамер (Chang and Yang, 2000).

Другим вариантом посттрансляционной модификации каспаз является S-нитрозилирование. При этом радикальная группа NO переноситься на цистеин активного центра каспаз с образованием группы R-S-NO (Chandra et al., 2000).

Существуют различные механизмы запуска апоптоза, приводящие к активации каспаз. Основными считаются два пути: активация с участием клеточных рецепторов и активация, опосредованная митохондриями.

Активация апоптоза с участием рецепторов

При реализации первого пути инициации апоптоза происходит связывание внеклеточных белков-лигандов (ФНО-а, FasL, TRAIL и Apo-3L) с их рецепторами на поверхности плазматической мембраны (Haunstetter et al., 1998). Все эти рецепторы состоят из трех частей: цистеин-богатого внеклеточного домена, трансмембранного домена и цитоплазматического DD-домена (death domain, домен смерти) (Bratton et al., 2001). При этом взаимодействие лиганда с рецепторами вызывает их тримеризацию в плазматической мембране, в результате чего рецептор получает возможность взаимодействовать с адаптерной молекулой через свой цитоплазматический DD-домен (Самуилов, 2000). Если лигандом является

ФНО-а, то адаптерной молекулой является TRADD (TNFR-associated death domain, домен смерти, ассоциированный с ФНО-о). При этом вследствие конформационного изменения адаптера появляется возможность его взаимодействия с двумя прокаспазами-8, которые в сближенном состоянии обладают способностью активировать друг друга (рис. 1). Функция адаптера заключается в сближении каспаз. Комплекс, состоящий из рецептора, адаптерной молекулы и прокаспаз называется DISC (death inducing signaling complex, сигнальный комплекс, вызывающий смерть) (Raff, 1998).

Каспаза-8 способна далее активировать прокаспазу-3 с образованием зрелой каспазы-3, участвующей в терминальных стадиях апоптоза (Debatin and Krammer, 2004). Кроме этого каспаза-8 участвует в расщеплении белка Bid с образованием его активной формы tBid, которая способна транспонироваться к митохондриям и запускать митохондриальный путь апоптоза.

Сборка комплекса, состоящего из рецептора ПМ, адаптерной молекулы и прокаспаз регулируется эндогенными ингибиторами Это показано при открытии семейства вирусных белков FLIP, содержащих DED-домены. Эти белки способны препятствовать взаимодействию прокаспаз-8 и -10 с адаптером, конкурируя с ними за связывание с DED-доменом адаптерной молекулы. Таким путем вирусы предотвращают апоптоз и получают возможность репликации (Cryns et al., 1998).

Рис. 1. Схема путей активации каспаз с участием рецепторов ПМ и митохондрий. Показано участие проапоптозных белков Вах и Bid в выходе цитохрома с из митохондрий (объяснения в тексте). ? -стрессовый стимул, приводящий к транслокации белка Вах к митохондриям и выходу цитохрома с.

Помимо индукции апоптоза ФНО-а через свои рецепторы может включать различные сигнальные пути, препятствующие апоптозу. После связывания с рецепторами TRADD может взаимодействовать со вторичными адаптерами Ripl (receptor interacting proteinl, белокі, взаимодействующий с рецептором) и TRAF2 (TNFR-associated factor2, фактор 2, ассоциированный с рецептором ФНО-а). Это приводит к активации IKK комплекса (Nemo), который стимулирует транскрипционный фактор NF-кВ, через фосфорилирование и деградацию его ингибитора I-B, кроме этого активируется транскрипционный фактор (ТФ) API. Оба эти фактора являются антагонистами апоптоза и повышают транскрипцию генов, способствующих выживанию клеток (Chandel et al., 2001). Показано, что активация NF-B в клетках саркомы Ewing подавляла окислительный стресс, индуцированный обработкой клеток с помощью ФНО-а. При этом активация NF-kB приводила к повышению в клетках уровня тиоредоксина и Mn-СОД (Djavaheri-Mergny et al., 2004). Поэтому при активации апоптоза в клетках HeLa с помощью ФНО-а для подавления активации антиапоптозных систем клетки требуется ингибирование синтеза белка (Sidoti-de Fraisse et al., 1998).

TRAF2 способен активировать киназу JNK (c-Jun N-terminal kinase) через промежуточную МКК7-киназу. Роль JNK в апоптозе до конца не выяснена и зависит, вероятно, от типа клеток и инициирующего стимула. Помимо растворимой формы ФНО-а, существует его мембранная форма. Ее рецептор TNFR2 имеет укороченный цитоплазматический DD-домен и не способен связываться с адаптером TRADD. TNFR2 может непосредственно связываться с TRAF2 и активировать NF-кВ и JNK (Wajant et al., 2003; Varfoloveev et al., 2004). Сверхэкспрессия химерного рецептора, состоящего из внеклеточной и транс мембранной части (CD28) и цитоплазматической части без DD-домена приводила к активации транскрипционного фактора NF-кВ и подавляла апоптоз в клетках линии НЕК293 (human embrionic kidney cell line, линия клеток почки эмбриона человека) (Chandel et al., 2001).

Недавно (Jaatella et al., 2003) было показано, что ингибирование каспаз может повышать уровень некроза в клетках после активации TNFR1. На клетках Jurkat было обнаружено, что TNFR1 может запускать альтернативную форму клеточной смерти, которая морфологически отличается от апоптоза. Из-за участия

белка Rip данный тип гибели был назван программируемый некроз (ПН). Индуцированный с помощью ФНО-а ПН подавлялся при расщеплении белка Rip каспазой-8 (Chan et al., 2003). Митохондриальный путь активации каспаз

Помимо рецепторного пути активации каспаз, существует другой, не менее важный пути активации, происходящий с участием митохондрий. Митохондрии содержат цитохром с - ключевой компонент митохондриальной ЭТЦ, представляющий собой водорастворимый, положительно заряженный белок. Как и большинство других митохондриальных белков, цитохром с кодируется ядерными генами и синтезируется в цитоплазме в виде молекулы-предшественника -апоцитохрома с. Апоцитохром с селективно импортируется в межмембранное пространство митохондрий, где ковалентно взаимодействеут с гемом через свои цистеиновые остатки с образованием тиоэфирной связи (Bossy-Wetzel et al., 1998).

При индукции апоптоза цитохром с выходит из межмембранного пространства митохондрий в цитоплазму, где соединяется с адаптерной молекулой Apafl (apoptotic protease activating factor, фактор, активирующий апоптозные протеазы), взаимодействуя с WDR-областью в адаптере. Также к Apafl присоединяется через домен NBD (nucleotide-binding domain, нуклеотид-связывающий домен) молекула АТР/дезоксиАТР, при этом вместе с цитохромом с они вызывают самолигомеризацию Apafl, что приводит к экспонированию домена CARD и дальнейшему взаимодествию с ним прокаспаз-9 и их активации (рис. 1). Комплекс, состоящий из адаптера Apafl и, связанных с ним молекулы цитохрома с, АТР/дезоксиАТР и прокаспаз-9, называется апоптосомой (Adams and Cory, 2002). Предполагаются по крайней мере 3 пути выхода цитохрома с из митохондрий:

1. В некоторых моделях апоптоза выход цитохрома с происходил при активации РТР (permeability transition роге, гигантская пора (ГП)) (Kowaltowski et al., 2001). Эта пора представляет собой сложный комплекс, состоящий из адениннуклеотид-транслокатора (АНТ) (во внутренней митохондриальной мембране (ВММ)), вольт-зависимого анионного канала (ВЗАК), называемого также порин (в наружней митохондриальной мембране (НММ)) и циклофилина D (в матриксе митохондрий). ГП неспецифична и позволяет проходить молекулам массой до 1.5 кДа. При открытии поры происходит набухание митохондрий, их

НММ лопается. Помимо цитохрома с из митохондрий выходят и другие проапоптозные факторы, такие как Smac и AIF (подробнее далее).

2. В норме в митохондриях при участии ВЗАК и АНТ идет обмен ADP (из
цитозоля) на синтезированный АТР из матрикса митохондрий. При нарушении
работы АНТ происходит прекращение обмена молекул АТР на ADP, при
работающей дыхательной цепи митохондрий это приводит к гиперполяризации
НММ и ее разрыву, сопровождающемуся выходом проапоптозных факторов в
цитозоль.

3. Выход цитохрома с через пору, образуемую при олигомеризации
проапоптозного белка Вах в НММ. В олигомеризации может участвовать ВЗАК
(подробнее см. ниже) (Bratton et al., 2001).

Проапоптозные белки митохондрий

Помимо цитохрома с, митохондрии содержат и другие белки, способные выходить в цитозоль после апоптозных сигналов и приводить клетку к гибели. Белки Smac/Diablo (second mitochondrial activating factor, вторичный митохондриальный активатор апоптоза) (Susin et 1., 1999; Verhagen et al., 2000) и HtrA2/Omi, попадая в цитозоль, связывают белок IAP (inhibitor of apoptosis, ингибитор апоптоза), являющийся ингибитором каспаз, и тем самым способствуют апоптозу. Кроме этого митохондрии содержат и каспазонезависимые эффекторы клеточной смерти: белок AIF (apoptosis inducing factor, апоптоз-индуцирующий фактор) (Joza et al., 2001) и эндонуклеазу G (endoG). Белки AIF и endoG вызывают конденсацию хроматина и олигонуклеосомальную фрагментацию молекул ДНК.

Показано, что обработка клеток HeLa стауроспорином (ингибитором протеинкиназ) приводила к олигомеризации Вах в НММ и вызывала выход из митохондрий цитохрома с, Smac/Diablo и HtrA2/Omi, но не белков AIF и endoG, выход которых осуществлялся только после активации каспаз и подавлялся при добавлении неспецифического ингибитора каспаз zVADfmk. Таким образом, существует иерархия в выходе проапоптозных сигнальных молекул из митохондрий (Arnoult et al., 2003).

В работе, выполненной на клетках Jurkat было показано, что обработка клеток сукцинат а-токоферилом (а-ТОС) приводила к повышенной продукции АФК, выходу цитохрома с и Smac/Diablo из митохондрий в цитозоль и активации

каспаз. При этом неспецифический ингибитор каспаз не влиял на снижение Л\|/ и продукцию радикалов, но препятствовал гибели клеток. Ингибитор каспазы-9 блокировал апоптоз, индуцированный действием сукцинат се-токоферола, но не Fas- или TRAIL-опосредованному апоптозу. Сверхэкспрессия белка Вс1-2 блокировала гибель клеток, препятствуя выходу проапоптотических белков из митохондрий (Weber et al., 2003). Независимая от каспаз гибель клеток

При ингибировании каспаз белком IAP (inhibitor of apoptosis, ингибитор апоптоза) клетки могут погибнуть каспазо-независимым способом. Истощение пула цитохрома с в митохондриях приводило к подавлению дыхания и снижению концентрации АТР. Результатом этого являлось падение митохондриального мембранного потенциала (Ду) и нарушение импорта белков. Эти нарушения в работе митохондрий приводят к каспазо-независимой клеточной смерти. Такой тип гибели может быть вызван в клетке различными токсичными для митохондрий веществами, такими как АФК, действием оксида азота NO и др. Индукция каспазо-независимой гибели может быть полезна для удаления раковых клеток, которые часто имеют дефекты в апоптозном ответе (Kuwana and Newmeyer, 2003). Роль белков семейства ВсІ-2 в апоптозе

Протоонкоген Вс1-2 (от B-cell lymphoma/leukemia-2) впервые был обнаружен при анализе злокачественных В-клеток. Вс1-2 млекопитающих является гомологом белка Ced9, обнаруженного у нематоды С. elegans и представляющего собой эндогенным ингибитором апоптоза (Rizzuto et al., 2003).

Все белки члены семейства белков Вс1-2 (сейчас известно 15 представителей семейства) содержат 1-4 Bcl-2-гомологичных домена (ВН) (рис. 2) и делятся на две группы в зависимости от их про- (белки Вах, Bad, Bid, Bak, Bok, Bik/NBK, Hrk) или антиапоптозного действия (Bcl-XL, McL-1, Bfl-1, Bcl-w, Al) (Rizzuto et al., 2003; Curtin et al., 2002). Проапоптозные члены семейства классифицируются далее по содержанию доменов ВН. Белки, содержащие только ВНЗ-домен - проапоптозные, при активации апоптоза они взаимодействуют с мультидоменными представителями семейства. Известно, что содержащие только ВНЗ-домен проапоптозные белки Bid и Віт способны непосредственно активировать белки Вах и Bak, а белки Bad и Вік инактивируют антиапоптозные белки Bcl-XL и Вс1-2.

Все домены имеют одинаковую структуру и состоят из 7 или 8 а-спиралей, две из которых гидрофобны и, за счет этого, вероятно, могут быть встроены в мембраны.

ВоН)

м-*

И* I

А1 В*Х

!30к.-ЧЮ

содержащие только ВНЗ-доиан

Рис. 2. Схематическая классификация некоторых представителей семейства Вс1-2 белков. ТМ-гидрофобный регион С-концевой части белков. Проапоптозные мультидоменные (ВН1-3) белки могут содержать слабо прикрепленный ВН4-домен (не показан) (по Kuwana et al., 2003).

До сих пор не ясно, какие структурные черты определяют про- или антиапоптозные функции белков. В зависимости от апоптозных стимулов происходит активация различных представителей семейства Вс1-2. Например, активированная через рецепторный путь каспаза-8, способна расщеплять белок Bid, после этого происходит N-миристилирование его С-концевого фрагмента и Bid становится активным. При УФ-индуцироваином апоптозе и негативной селекции тимоцитов происходит активация Bim. Открепление клеток от подложки вызывает активацию белка Bmf. В норме белки Bim и Bmf связаны с цитоскелетными структурами (с микротрубочками и миозиновым комплексом, соотвественно). Возможно, различные стимулы могут нарушать связь белков Bim и Bmf с цитоскелетом, при этом освобожденные белки получают возможность мигрировать к сайтам своего действия. Другие члены группы белков, содержащих один лишь

ВНЗ-домен способны только к транскрипционной активации. Например, белки Noxa и Puma регулируются активностью белка р53 (Kuwana et al., 2003).

Проапоптозные белки Вах, Bid и Bad, расположенные в цитозоле, способны транслоцироваться к наружной мембране митохондрий в ответ на апоптозные стимулы, способствуя выходу проапоптозных белков из митохондрий. При этом нокаут генов Вах и Вак может блокировать апоптоз в некоторых моделях (Lindsten et al., 2000; Wei etal., 2001).

Одним из вариантов исследования проапоптозных функций белков семейства Вс1-2 является изучение их влияния на проницаемость липидных бислоев. В норме проапоптозный белок Вах расположен в цитоплазме, при индукции апоптоза происходят конформационные изменения в его N- и С-областях, при этом происходит его транслокация и вставка в мембраны митохондрий и ЭР (Murphy, et al., 2000; Perez and White, 2000).

Tsujimoto и коллеги в 1999 г показали, что белок Вах может взаимодействовать с порином и участвовать в образовании поры, через которую может выходить цитохром с (но не белки большей массы) из липосом со встроенным ВЗАК. С другой стороны показано, что Вах сам по себе способен олигомеризоваться и образовывать пору в НММ и позволять, таким образом, выходить цитохрому с и другим проапоптозным факторам из митохондрий. Было показано, что очищенный белок Вах может подвергаться конформационным изменениям при инкубации с липидными везикулами в отсутствие других белков. Взаимодействие Вах с липосомами не зависело от липидного состава везикул. При этом Вах не был способен олигомеризоваться, встраиваться в мембрану липосом и формировать пору в отсутствие активированного белка tBid (Yethon et al., 2003).

Трансфекия белка Bid в клетках HeLa приводила к активации у них апоптоза, при этом белок Bid процессировался в активную форму (tBid) и транслоцировался к мембранам митохондрий, где олигомеризовался и вызывал олигомеризацию белков Вах и Вак, также транслоцированных к митохондриям из цитозоля. Сверхэкспрессия белка Вс1-2 блокировала tBid-индуцированный выход цитохрома с из митохондрий и апоптоз клеток HeLa, но не влияла на процессинг Bid и его транслокацию к митохондриям. Защитное антиапоптозное действие белка Вс1-2

может реализовываться через препятствие вставке tBid в НММ и ингибирование tBid-индуцированной олигомеризации Вах.

В некоторых моделях выход цитохрома с из митохондрий и активация апоптоза происходят без участия проапоптозных белков Вах и Вак. Показано, что радикалы супероксиданиона и перекись водорода (см. далее) способствуют выходу цитохрома с из митохондрий при активации ГП в присутствии Са²⁺. Более того, супероксид сам по себе, но не перекись, способен вызывать выход цитохрома с, не влияя на митохондриальный мембранный потенциал (в присутствии внемитохондриального АТР). Этот процесс подавлялся при связывании белка ВЗАК с помощью антител или добавления его ингибитора DIDS. Ингибиторы компонентов ГП циклофилина D и аденин-нуклеотид-транслокатора (циклоспорина А и бонгкрековой кислоты, соответственно) не влияли на выход цитохрома с. Супероксид-индуцированный выход цитохрома с не требовал участия проапоптозных белков Вах и Вак (Madesh и Hajnoczky, 2001).

Вопреки широко изученному антиапоптозному действию белка Вс1-2, в некоторых моделях сверхэкспрессия Вс1-2 не предотвращала апоптоз (Nylandsted et al., 2000) или даже усиливала его (Cheng et al., 1997).

Характерный для митохондрий липид кардиолипин под действием апоптозных стимулов выходит на внешнюю поверхность НММ и облегчает контакт tBid с мембраной, повышая чувствительность НММ к Вах-индуцированному образованию поры. Антиапоптозные белки Вс1-2 и Bc1-Xl препятствуют олигомеризации Вах и Вак, не влияя на способность tBid взаимодействовать с Вак и Вах (Kuwana and Newmeyer, 2003).

Индукция апоптоза в клетках RPTC (rat proximal tubule cells, клетки проксимальных почечных канальцев), экспрессирующих большое количество белка Вах, при гипоксии и последующей реоксигенации сопровождалась транслокацией белка Вах к митохондриям. При этом сверхэкспрессия белка Вс1-2 не предотвращала транслокацию Вах, но блокировала выход цитохрома с из митохондрий. Предполагается, что белок Вах из-за насыщенности НММ белком Вс1-2 (стерических помех) не может глубоко вставляться в НММ и формировать олигомеры (Mikhailova et al., 2001).

Первичная культура клеток, изолированных их мышей с нокаутированными генами, кодирующими белки Вах и Вак, была устойчива к различным стрессовым воздействиям, таким как обработка стауроспорином, облучение УФ, гипоксия (McClintock et al., 2002).

Клетки НСТ 116 (human colorectal cancer cells, клетки рака кишечника человека), содержащие мутантные аллели белка Вах, были устойчивы к обработке хемотерапевтическими веществами 5-фтороурацилом и салиндаком, в норме активирующими апоптоз в этих клетках (Zhang et al., 2000).

Недавние исследования показали наличие альтернативного пути активации митохондриального пути апоптоза. При определенных стимулах происходит выход Са²⁺ из эндоплазматического ретикулума (ЭР) и его накопление в митохондриях, в которых Са вызывает открытие ГП, набухание НММ и ее разрыв. Это приводит к выходу проапоптозных белков из межмембранного пространства митохондрий в цитозоль. Защитное действие белка Вс1-2 в этом случае обусловлено не его действием на НММ, а локализацией Вс1-2 на поверхности ЭР. Вах и Вак наоборот стимулируют выход Са²⁺ из митохондрий.

Антиапоптозные белки Bcl-2, Bcl-XL, Mcl-1, BHFR1 были обнаружены на мембранах ядра, ЭР, митохондрий с цитоплазматической стороны, мутанты этих белков с пониженной способностью заякоривания на мембранах были менее эффективны в предотвращении апоптоза.

Белок Вс1-2 способен взаимодействовать с различными клеточными белками, не относящимися к семейству Вс1-2, такими как Nipl, Nip2, Nip3, белок вТРаза R-ras р23, Raf-1, BAG-1, PrP, р-53-связывающий белок р53-ВР2, протеинфосфатаза кальциневрин, карнитин пальмитоилтрансфераза I. Для некоторых этих белков взаимодействие с Вс1-2 определяет релокализацию на митохондриальную мембрану. Белок BAG-1 после связывания с Вс1-2 взаимодействует с Raf-1 и активирует его. При этом Raf-І получает возможность связываться с НММ и фосфорилировать проапоптозный белок BAD, защищая клетки от апоптоза (Mignotte and Vayssiere, 1998).

Показано, что представители семейства Вс1-2: белки Bcl-2, Bcl-XL и Вах, Вак способны непосредственно взаимодействовать с АНТ, ослабляя или стимулируя активацию ГП (Brenner et al., 2000).

Киназа JNK способна стимулировать гибель клеток в различных моделях через фосфорилирование и активацию проапоптозных белков семейства Вс1-2 (Davis, 2000).

Участие кальция в апоптозе

Участие Са в апоптозе было продемонстрировано с помощью ионофоров -переносчиков Са²⁺ через мембраны по электрохимическому градиенту. Впоследствии было показано, что перезагрузка кальцием митохондрий является общим финальным этапом различных типов гибели клеток (Lynch et al., 2000). Выход Са из ЭР может приводить к апоптозной гибели клеток (Pinton et al., 2001), причем в повышенных концентрациях Са²⁺ может вызывать некроз.

Экспрессия белка Вс1-2 в клетках HeLa и НЕК-203 приводила к снижению концентрации Са²⁺ в ЭР и ее повышению в митохондриях и цитозоле. Это не являлось побочным эффектом Вс1-2 и играло важную роль в его антиапоптозной защите, понижая чувствительность клеток к апоптозным стимулам. Показано, что

9+

повышение содержания Са в клетках усиливает апоптозный эффект (Pinton et al., 2000).

В экспериментах, выполненных на эндотелиальных клетках, было показано, что обработка клеток с помощью ФНО-а и арахидоната приводили к выходу Са²⁺ из ЭР, при этом хелатор Са ВАРТА блокировал Са -индуцированное образование АФК. Действие ФНО-а, но не арахидоната приводило к накоплению Са²⁺ в митохондриях и митохондриальной продукции АФК. Арахидонат, повышая уровень Са в цитозоле, не влиял на его накопление в митохондриях и митохондриальную продукцию АФК (Parthasarathi et al., 2002).

Эмбриональные фибробласты мышей, дефицитные по белкам Вах и Вак были устойчивы к различным апоптозным стимулам, и имели пониженное содержание Са²⁺ в ЭР. Восстановление уровня Са²⁺ в ЭР путем сверхэкспрессии Са -АТРазы саркоэндоплазматического ретикулума (SERCA) повышало чувствительность клеток к апоптозу, индуцируемому различными стимулами (арахидоновой кислотой, С2-церамидом, окислительным стрессом). Реэкспрессия Вах также восстанавливала уровень Са²⁺ в ЭР. Таким образом, ключевым сигналом к апоптозу является выход Са²⁺ из ЭР и его накопление в митохондриях, одним из

защитных механизмов действия антиапоптозных белков является снижение уровня Са²⁺ в ЭР (Rizzuto et al., 2003).

9-І-

На клетках HeLa было показано, что церамиды вызывают выход Ca^ZT из ЭР и его загрузку в митохондрии, это сопровождается фрагментацией и набуханием

9 +

митохондрий. Сверхэкспрессия ВЗАК, tBid повышали аккумуляцию Са в митохондриях и чувствительность к апоптозным стимулам. Выход Са из ЭР предшествовал транслокации белка drpl к митохондриям и их фрагментации. Роль Са²⁺ в апоптозе опосредована не только митохондриями. Многие сигнальные пути, связанные с выживанием клеток, дифференцировкой, дегенерацией -

9+

опосредованы действием Са в цитозоле (Breckenridge et al., 2003).

Важная роль в Са²⁺-опосредованной передаче апоптозного сигнала принадлежит семейству протеинкиназ С (РК С), большой группы родственных белков, различающихся по своим биохимическим свойствам ("классические" -активируются Са²⁺ и диацилглицеролом, "новые" или "атипичные" РК С - Са²⁺-нечувствительны и активируются или диацилглицеролом, или другими липидными молекулами). В большинстве экспериментальных моделей "классические" изоформы (в частности а и 0II изозимы) - антиапоптозные. Часто РК Са подавлена при апоптозе. Наоборот, "новая" РК СМб участвует в митохондриально-опосредованном апоптозе, активируясь под действием различных физико-химических стимулов. При апоптозе наблюдается транслокация РК С к митохондриям и аппарату Гольджи, где происходит их активация при фосфорилировании по остаткам тирозина.

В сигнальных путях апоптоза принимают участие С а -зависимые фосфатазы. В частности, многие механизмы гибели сопровождаются активацией Са -зависимой фосфатазы кальциневрина в результате процесса, блокируемого Вс1-2.

9-І-

Многие процессы протеолиза связаны с действием Са -зависимых протеаз -кальпаинов. Кальпаины - цистеиновые протеазы, синтезирующиеся в виде неактивных проэнзимов и активируемые Са²⁺. Мишенями кальпаинов являются такие важные участники апоптоза, как Bcl-X_L, Bid, каспаза-12, XIAP. Ингибиторы кальпаинов могут эффективно предотвращать апоптоз.

Каспаза-12 расположена в ЭР и активируется в условиях, когда ЭР подвержен стрессу (например нарушении Са²⁺-гомеостаза), но не под действием мембрано- или митохондриально-опосредованных сигналов (Rizzuto et al., 2003). Активные формы кислорода и азота

Метаболизм аэробных организмов сопровождается продукцией активных форм кислорода (АФК), представляющих собой свободные радикалы: супероксид анион (0₂*"), гидроксил радикал (ЮН) и нерадикальный пероксид водорода (Н₂0₂). АФК обладают высокой химической активностью и способны окислять молекулы ДНК, белков, углеводов и липидов.

Клетки обладают многоэшелонной системой антиоксидантной защиты для борьбы с АФК, нарушения в ее работе могут приводить к сверхпродукции АФК в клетке и развитию окислительного стресса. Окислительный стресс вовлечен в развитие многих заболеваний человека, включая СПИД, амиотрофный латеральный склероз (ALS), болезни Хантингтона, Паркинсона (Adams et al., 2001), Альцгеймера (Aksenov et al., 2001). Клетки центральной нервной системы обладают повышенной чувствительностью к окислительному стрессу. При этом в мозге отсутствует каталаза и низко содержание глутатиона.

Митохондрии, представляюшие собой "энергетические станции" клетки, являются и основным источником АФК. В физиологических условиях происходит утечка электронов, переносимых по ЭТЦ митохондрий и их передача непосредственно на кислород - при этом образуется супероксидный анион-радикал 0₂*\ Помимо митохондрий в образовании 0₂^#" могут принимать участие цитохром р450 в ЭР, липоксигеназы, циклооксигеназы, ксантиноксидазы и NADPH-оксидаза. Супероксидный анион-радикал уже сам по себе является токсичным для клеток. Он способен инактивировать белки, содержащие FeS-центры (например, аконитазу, сукцинатдегидрогеназу, NADH-убихиноноксидоредуктазу). Ионы железа, освобождаемые при этой реакции, могут участвовать в реакции Фентон (см. ниже). Дисмутация 0₂*" с помощью супероксиддисмутазы (СОД) приводит к образованию Н₂0₂. Пероксид водорода в отсутствие металлов с переменной валентностью является слабоактивной молекулой, не способной к окислению белков, липидов и ДНК. Помимо дисмутации пероксид водорода способны образовывать различные оксидазы, включая гликолат и моноаминоксидазы, являющиеся участниками

пероксисомального пути окисления жирных кислот. Все ткани человека образуют Н2О2, причем в некоторых (желудочнокишечный тракт, мочеполовая система, эндотелий сосудов) пероксид водорода содержится в больших количествах и выполняет антибактериальные функции (Halliwell et al., 2000).

В некоторых моделях пероксид водорода в низких концентрациях вызывал апоптоз, а в высоких - каспазо-независимый некроз (Hampton et al., 1997; Creagh et al., 2000).

Пероксид водорода способен взаимодействовать с железом Fe²⁺, образуя гидроксильный радикал ЮН в реакции Фентон: Fe²⁺ + Н₂0₂ -» Fe³⁺ + -ОН + "ОН

Кроме этого гидроксил-радикал может образовываться в катализируемой металлами реакции Хабера-Вайса (Haber-Weiss): О/ + н₂о₂ -» 0₂ + -ОН + ^_ОН

АФК и АФА, образуемые в клетке, довольно сложно поддаются детекции из-за коротких времен полужизни. Антиоксиданты и ловушки для радикалов являются эффективным орудием доказательства вовлечения АФК и АФА в апоптоз (Banno et al., 2005). При этом использование антиоксидантов может в некоторых случаях препятствовать развитию апоптоза.

В нормально функционирующих митохондриях происходит утечка 1-2% электронов с ЭТЦ, которые восстанавливают молекулы 0₂ с образованием супероксидного анион-радикала. Основными сайтами генерации 0₂*" в митохондриях являются NADH-убихиноноксидоредуктаза (комплекс I дыхательной цепи митохондрий) и убихинол-цитохром с-оксидоредуктаза (комплекс III) (Андреев и др., 2005).

Большое количество Мп-СОД в матриксе митохондрий позволяет поддерживать 0₂^,_ на невысоком уровне. При иммунных ответах фагоцитов происходила сборка и активация NADPH-оксидазы, расположенной на ПМ, при этом происходила генерация 0₂*~.

Помимо АФК важнейшими радикалами клетки являются активные формы азота (АФА), которые в отличие от АФК синтезируются главным образом в митохондриях и цитозоле. Оксид азота NO формируется эндогенно при окислении L-аргинина в L-цитруллин семейством NO-синтаз. Оксид азота существует в

различных химических формах (NO', N0, N0 ), которые, обладая различной химической активностью, способны выполнять в клетке множество функций, включая регуляцию сердечнососудистой системы, гладкомышечную релаксацию, передачу нервных импульсов, участие в коаггуляции и иммунорегуляции. Кроме этого оксид азота может участвовать в индукции/подавлении апоптоза, переводе апоптоза в некроз. N0, взаимодействуя с 0₂'~, образует пероксинитрит (ONOO), который также может свободно диффундировать внутри- и внеклеточно и действовать как мощный окислитель (Bringold et al., 2000).

Существует три изоформы NOS: нейрональная (nNOS, NOS1), эндотелиальная (eNOS, NOS3) - Са²⁺/кальмодулин-зависимые, конститутивно-экспрессируемые в различных типах клеток и индуцибельная NOS (iNOS, NOS2) -Са ⁺-независимая, экспрессируется в клетках иммунной системы в ответ на различные стимулы. Все эти три иозоформы NOS присутствуют в цитоплазме. Недавно была открыта митохондриальная NOS (mtNOS), активация которой вместе с продукцией 0₂*" приводит к образованию высокоактивного пероксинитрита (Haynes et al., 2004). Все NOS функционируют в виде гомодимеров. Они производят NO в двуступенчатом процессе. Показано, что апоптоз, индуцированный ФНО-а, сопровождается генерацией АФК и АФА. Ингибирование iNOS в клетках MCF-7 приводило к снижению ФНО-а-индуцированной цитотоксичности. Трансфекция eNOS в клетках HeLa наоборот препятствовала развитию у них апоптоза, индуцированного ФНО-а. Роль комплекса I дыхательной цепи в продукции АФК

Комплекс I дыхательной цепи, NADH-убихиноноксидоредуктаза дыхательной цепи митохондрий, представляет собой сложный макромолекулярный комплекс белков и состоит из 46 субъединиц, кодируемых ядерной и митохондриалной ДНК (Shoffner and Wallace, 1995). Различные компоненты комплекса, участвующие в переносе электронов и сохраненные в процессе эволюции от прокариот до млекопитающих, транспортируют электроны от NADH через группу FeS-центров на восстановленный убихинон, при этом протонная помпа, переносящая Н⁺ из матрикса наружу внутренней мембраны митохондрий, формирует мембранный потенциал митохондрий (А\|/).

Семихиноны, образуемые комплексом I, могут окисляться кислородом с образованием супероксидного анион-радикала (рис. 3). Сайты генерации семихинонов близки к участкам, ингибируемым ротеноном и пиерицидином. Ротенон ингибирует 20кДа-Р55-субъединицу. Другой участок образования семихинонов - 49кДа-субъединица, ингибируемая пиерицидином (Raha and Robinson, 2000).

NADH NAD

Рис. 3. Образование семихинона в комплексе I дыхательной цепи митохондрий. После окисления NADH флавин-содержащей (Fp) 51кДа субъединицей, электроны переносятся на железосерный центр. В последующем переносе участвуют 2Fe-2S центр 24кДа субъединицы и 4Fe-4S центр 75кДа субъединицы. Далее электроны попадают на два 4Fe-4S центра 23кДа субъединицы TYKY и 4Fe-4S центр 20кДа субъединицы PSST. В комплексе 1 обнаружено два сайта образования семихинонов, показаны два хинон (Q)- и семихинон (<3-)-связывающих сайта: один - в 49кДа субъединице и один в субъединице PSST. На схеме показаны участки действия ингибиторов комплекса I пиерицидина А и ротенона (Raha and Robinson, 2000).

В экспериментах, выполненных на выделенных митохондриях и субмитохондриальных частицах (СМЧ), было показано, что в отсутствие антимицина А (ингибитора переноса электронов в комплексе III дыхательной цепи) продукция АФК с ЫАВ⁺-зависимыми субстратами минимальна, тогда как с сукцинатом при обратном переносе электронов наблюдалась значительная продукция пероксида водорода. Эта продукция блокировалась при добавлении ротенона. В некоторых моделях (Betarbet et al., 2000) и в наших исследованиях показано, что ротенон сам может вызывать продукцию АФК в комплексе I.

Показано, что выход цитохрома с из митохондрий может приводить к повышению восстановленности компонентов дыхательной цепи и вызывать повышенное образование АФК в комплексе I (в присутствии глутамата и малата). Продукция АФК в этом случае снижалась при добавлении экзогенного цитохрома

с. Повышение отношения NAD(P)H/NAD(P) к окисленному также усиливало продукцию АФК в комплексе I дыхательной цепи. В условиях общей восстановленности компонентов дыхательной цепи слабое разобщение может снижать продукцию АФК (Skulachev and Goglia, 2004; Kushnareva et al., 2002).

Продукцию супероксида удобно исследовать на субмитохондриальных частицах, в которых компоненты дыхательной цепи обращены во внешнюю среду, кроме этого СМЧ не содержат антиоксиданты матрикса митохондрий. На СМЧ было показано, что миксотиазол в отсутствие антимицина А способен приводить к генерации АФК (Starkov and Fiscum, 2001). Муцидин (ингибитор о-центра) не приводил к продукции супероксида в комплексе III из СМЧ. Однако, добавление NADH к муцидин-ингибированным СМЧ приводило к 4-кратному повышению продукции супероксида в комплексе I. Действие ротенона также приводило к повышению продукции АФК в комплексе I. Вероятно, в этой продукции АФК участвует FeS-кластер ^-комплекса I. Добавление короткоцепочечных аналогов CoQ приводило к повышению продукции супероксида, вероятно, за счет переноса электронов с кластера N2 на молекулярный кислород (Genova et al., 2001).

В экспериментах, выполненных на митохондриях выделенных из скелетных мышц крыс, было показано, что продукция супероксида комплексом I при заингибированнном с помощью стигмателлина комплексе III в присутствии пирувата и малата в результате прямого переноса электронов составляет лишь 10% от продукции супероксида, наблюдаемой при обратном переносе электронов в присутствии субстрата комплекса II сукцината. Однако, при добавленном АТР (для генерации градиента рН) в присутствии ингибиторов хинон-связывающего сайта ротенона, пиерицидина и миксотиазола наблюдался высокий уровень продукции АФК. Источником супероксида в этом случае являлся участок в комплексе I, находящийся в районе убисемихинон-связывающего сайта не выше флавинов или FeS-центров (Lambert and Brand, 2004).

Клетки, дефицитные по комплексу I, обладают различными фенотипическими особенностями, включая непереносимость катаракты и задержки развития, возникновение болезни Ли с дегенерацией базальных ганглиев и кардиомиопатией и др. Клетки пациентов с заболеваниями средней тяжести обладали повышенной продукцией супероксида комплексом I, без изменения

уровня Mn-СОД, в то время как в клетках пациентов с тяжелым уровнем заболевания был обнаружен повышенный уровень Mn-СОД. Действие Мп-СОД при повышенной генерации супероксида может быть пагубным для клеток, так как приводит к избытку пероксида водорода в митохондриях. Кроме этого высокий уровень Mn-СОД в клетках может приводить к повышенному образованию гидроксил-радикала (Luo et al., 1997). Утечка электронов с дыхательной цепи, приводящая к повышенному образованию супероксидного анион-радикала и, как следствие, повышенному уровню пероксида водорода и гидроксил-радикала в клетках может быть результатом генетических дефектов комплекса I или нарушениями в его сборке. Роль комплекса III дыхательной цепи в продукции АФК

Комплекс III дыхательной цепи митохондрий содержит убихинол, принимающий восстановительные эквиваленты от комплексов I и II и передающий их через серию реакций далее на цитохром Ь, железосерный белок Риске (FeS_R) и цитохром сj на финальный акцептор электронов цитохром с.

Убихинол донирует один электрон на FeSR (сайт, ингибируемый миксотиазолом), при этом вблизи наружной поверхности ВММ образуется семихинон, который затем восстанавливает гем цитохрома b (ЬД Второй гем цитохрома Ъ (Ь_н), расположенный ближе к матриксу митохондрий, принимает электроны от гема hi, и восстанавливает убихинон с образованием убисемихинона (сайт, ингибируемый антимицином A) (Trunpower, 1990).

Два ингибитора комплекса III имеют различные эффекты на продукцию супероксидного анион-радикала. Блокирование потока электронов с помощью антимицина А, на уровне окисления цитохрома Ь_н, препятствует передаче электрона от семихинона в сайте о и таким образом может стимулировать его окисление 0₂ с образованием супероксида (рис. 4). Показано, что антимицин А повышал продукцию АФК в присутствии глутамата и сукцината (субстратов комплексов I и II дыхательной цепи, соответственно) (Pamplona et al., 2002). Действие миксотиазола не приводит к продукции АФК, так как он препятствует образованию семихинона на внешней стороне ВММ (Raha and Robinson, 2000; Gille and Nohl; 2001).

межмемВранное пространство

Рис. 4. Продукция супероксида комплексом III дыхательной цепи митохондрий. На схеме показан перенос электронов от убихинола (QH_;) на железо-серный белок Риске, на этом участке образуется убисемихинон. Гем Ьц питохрома Ь восстанавливает убихинон (Q), при этом также может образовываться убисемихинон. Действие антимицина А приводит к образованию белком Риске семихинона, который окисляется молеулярным кислородом с образованием супероксида. Стигмателлин и миксотиазол препятствуют образованию семихинона белком Риске (Raha and Robinson, 2000).

Показано, что комплекс I продуцирует супероксид в матриксе митохондрий, тогда как супероксид, образуемый комплексом III попадает в матрикс и межмембранное пространство митохондрий примерно в одинаковых количествах (Miwaetal.,2003).

Ротенон, ингибируя комплекс I дыхательной цепи, приводит к восстановлению NADH-дегидрогеназы и таким образом может являться потенциальным индуктором образования АФК комплексом I (Turrens and Boveris, 1980). Однако в экспериментах, проведенных на кардиомиоцитах крыс линии Sprague-Dawley, было показано, что в присутствии глутамата ротенон не влиял на продукцию АФК в митохондриях, но значительно стимулировал продукцию АФК в СМЧ. Вероятно, в митохондриях выделяемые в матрикс АФК детоксифицировались антиоксиданти ыми системами (Мп-СОД, глутатион-пероксидазой, каталазой). Субмитохондриальньте частицы, лишенные антиоксидантов матрикса, выделяли супероксидный анион-радикал в среду инкубации, где он был доступен для детекции. Ротенон подавлял антимицин А-индуцированную продукцию АФК в присутствии субстратов комплекса I, но не III. Эти результаты показывают, что главным источником АФК в этой модели являлся комплекс III дыхательной цепи. Ингибитор комплекса II малонат способен подавлять антимицин А-индуцированную продукцию супероксидного анион-

радикала в присутствии субстрата комплекса II сукцината (Chen et al., 2003). Хотя комплекс II не является основным источником АФК в митохондриях, он может снижать превращение убихинона в убихинол и влиять, таким образом, на антиоксидантные активности митохондрий (Ramsay and Singer, 1992).

Существует предположение, что супероксид, образуемый о-центром комплекса III, попадает в межмембранное пространство митохондрий, в то время как супероксид, образуемый і-центром, идет в матрикс митохондрий. Таким образом, антимицин А, ингибируя комплекс III на уровне і-центра, приводит к продукции супероксида вдали от антиоксидантов матрикса (Demin et al., 1998).

Показано, что при ишемии миокарда происходит снижение активности цитохромоксидазы. Ингибитор цитохромоксидазы азид натрия (NaN₃) не приводит к стимуляции продукции АФК комплексом IV, но повышает восстановленность комплексов I и III и продукцию ими АФК (Dawson et al., 1993). Антиоксидантные системы клетки

И АФК, и АФА в клетке могут производиться в результате нормальных метаболических процессов. В нормальных условиях антиоксидантные системы минимизируют отрицательное воздействие АФК на клетку. Сверхпродукция АФК может приводить к развитию окислительного стресса. Дисфункция антиоксидантных систем наблюдалась при многих заболеваниях человека, таких как амиотрофный латеральный склероз, болезнь Паркинсона, Альцгеймера и Хантингтона и др.

Антиоксиданты могут быть разделены по действию на первичные и вторичные. Участники первичной антиоксидантной защиты предотвращают окислительный стресс, непосредственно перехватывая АФК до их повреждающего действия на внутриклеточные мишени, и включают СОД, глутатионпероксидазу, каталазу, тиоредоксин. Известны 4 класса СОД: Mn-СОД, Си, Zn-СОД, Ni-СОД и внеклеточная СОД. Все они катализируют дисмутацию супероксидного анион-радикала 0₂'\ приводящую к образованию пероксида водорода Н₂0₂: О/ + 0₂-- +2Н⁺ -» Н₂0₂ + 0₂

Ингибирование СОД с помощью 2-метоксиэстрадиола в клетках лейкемии человека сопровождалось накоплением 0₂** и апоптозом (Cleveland et al., 2000).

Первичные механизмы защиты против Н₂0₂ реализуются с участием каталазы и ГП через редокс-цикл глутатиона. Каталаза, способная расщеплять любые концентрации Н₂0₂ без насыщения, обнаружена в клетках только в пероксисомах, в то время как глутатионовый редокс-цикл существует в цитозоле и митохондриях. Расщепление пероксида водорода каталазой приводит к образованию воды и молекулярного кислорода: 2 Н₂0₂ -* 2Н₂0₂ + 0₂

Сверхэкспрессия каталазы способна защищать клетки от развития окислительного стресса (Bai et al., 1999) и апоптоза (Tome et al., 2001). Глутатион и глутатионовый редокс-цикл

Глутатионовая система является, вероятно, наиболее важным защитным мханизмом, существующим в клетке. Трипептид GSH (7-glu-cys-gly) является не только эффективной ловушкой АФК, но и участвует в регуляции редокс-состояния клетки. Глутатионпероксидаза (ГПр) осуществляет восстановление Н₂0₂ и других пероксидов, при этом сам глутатион (GSH) переходит в окисленную форму (GSSG): ROOH + 2GSH -* ROH + GSSG + Н₂0

Обратное восстановление GSSG осуществляется глутатионредуктазой (ГР). Лимитирующим фактором в синтезе GSH является содержание L-7-глутамил-цистеинсинтазы. Индукция синтеза этого фермента предовтращала глутаматную токсичность, индуцированную окислительным стрессом (Murphy et al., 1991), а его нокаут приводил к апоптозной гибели клеток эмбрионов мышей (Shi et al., 2000). В нормальных условиях более 95% глутатиона в клетке находится в восстановленном состоянии. Снижение внутриклеточного уровня GSH повышает чувствительность клеток к апоптозу (Oda et al., 1999; Xu et al., 2001) и часто сопровождается повышенной продукцией АФК (Carmody et al., 1999). Ингибиторы GSH-транспортера предотвращают утечку GSH, что говорит об участии в этом процессе GSH-специфических мембранных каналов. Антиоксидантные свойства цитохрома с

Межмебранное пространство митохондрий содержит около 0,7 мМ цитохрома с, который способен эффективно удалять супероксид. Окисленный цитохром с может альтернативно восстанавливаться как дыхательной цепью, так и

супероксидом, а восстановленный цитохром с регенериуется (окисляется) его естественным акцептором - митохондриальной цитохром с-оксидазой. Способность цитохрома с к выделению полезной метаболической энергии за счет потенциально токсичного супероксида оправдывает его название "идеального антиоксиданта" (Андреев и др., 2005; Pereverzev et al., 2003).

Показано, что обработка гранулярных клеток мозжечка крыс глутаматом сопровождается продукцией АФК и выходом цитохрома с. Инкубация этих клеток в присутствии АФК-генерирующей системы ксантин+ксантин оксидазы также приводила к выходу цитохрома с. Вышедший цитохрома с был способен переносить электроны с супероксидного анион-радикала на молекулярный кислород через дыхательную цепь и таким образом снижать глутамат-индуицрованную токсичность. Таким образом, вышедший из митохондрий цитохром с в этой модели может обладать антиоксидантными свойствами (Atlante et al., 2000). Bcl-2 - антиоксидант

Протоонкоген Вс1-2 широко описан в литературе, как эффективный блокатор гибели клеток. Большинство исследований, посвященных изучению свойств белка Вс1-2, сфокусированы на его взаимодействии с митохондриями, в частности с ГП. В других исследованиях было показано, что экспрессия Вс1-2 способна защищать клетки от окислительного стресса, т. е. Вс1-2 в данном случае может действовать как антиоксидант. В экспериментах, выполненных на клеточных линиях лимфомы мышей, было показано, что сверхэкспрессия белка Вс1-2 приводила к повышению содержания GSH в клетках. Кроме этого экспрессия Вс1-2 приводила к релокализации GSH из цитозоля в ядро (Voehringer et al., 1998). Такое перераспределение GSH позволяет влиять на редокс-потенциал ядра и формировать восстановительные условия в клетке.

Белки Вс1-2 и Bcl-X_L способны сдвигать клеточный редокс-потенциал в более восстановленное состояние. На митохондриальном уровне сенсором редокс-состояния клетки, способным запускать апоптоз, являются тиолы (Fleury et al., 2002).

Но кроме этого существуют доказательства антиапоптозного действия Вс1-2 в моделях, где продукция АФК незначительна (Jacobson et al., 1995).

Антиапоптозный белок Bcl-2, локализованный преимущественно на НММ, кроме ингибирования выхода цитохрома с из митохондрий, может также защищать клетки от окисления липидов и тиолов, индуцированного менадионом и пероксидом водорода. Защитное от апоптоза действие Вс1-2 наблюдалось также и в р-клетках, в которых продукция АФК незначительна, т. е. участие белка Вс1-2 не ограничено его антиоксидантными свойствами (Kane et al., 1993).

При этом клетки не имели функциональную митохондриальную дыхательную цепь, но, тем не менее, были способны поддерживать Ду, близкий к норме. В исследованиях, проведенных на культуре клеток HL60, было показано, что обработка СТ вызывала продукцию О-/ и апоптоз клеток, не чувствительный к антиоксиданту N-ацетилцистеину. При этом сверхэкспрессия белка Вс1-2 подавляла СТ-индуцированную гибель клеток, ингибируя выход цитохрома с из митохондрий. Защитный эффект Вс1-2 проявлялся и на р -клетках, не содержащих дыхательную цепь. В данном случае Вс1-2 не может быть приписана антиоксидантная функция (Cai and Jones, 1998).

Во многих моделях защитное действие белка Вс1-2 не было связано с подавлением продукции АФК. Обработка клеток СТ приводила к подавлению потребления клетками молекулярного кислорода, но при этом происходила повышенная продукция супероксида, не чувствительная к экспрессии Вс1-2. В данном случае антиоксидантные свойства Вс1-2 являются опосредованными и не связаны с препятствием генерации супероксида (Cai and Jones, 1998). Bcl-2 способен подавлять СТ-индуцированный апоптоз, не только блокируя выход цитохрома с, но и через его непосредственное связывание (Kharbanda et al., 1997). Антиоксидантные функции разобщающих белков

Митохондриальные разобщающие белки (uncoupling proteins, UCP) принадлежат к семейству анионных переносчиков и обладают некоторыми общими с АНТ чертами: имеют сходную доменную композицию, импортируются в митохондрии без N-концевого расщепления, связывают пуриновые нуклеотиды в анионной форме и осуществляют опосредованный перенос протонов через ВММ. Разобщение дыхания с помощью UCP является одним из механизмов терморегуляции у теплокровных организмов (Nedergaard et al., 2001). Матрикс митохондрий богат пероксидами жирных кислот, которые представляют собой

агрессивные оксиданты, способные повреждать митохондриальную ДНК, аконитазу и другие ферменты матрикса. Транслокация пероксидов жирных кислот из матрикса через ВММ с помощью белков UCP осуществляет антиоксидантную защиту матрикса. Перенесенные пероксиды жирных кислот не могут транслоцироваться обратно в матрикс с помощью UCP из за существования разности потенциалов в митохондриальной мембране (Goglia and Skulachev, 2004). Влияние АФК на гибель клеток

На многих клеточных моделях показано, что повышенная генерация АФК способна вызвать апоптоз или некроз. Генерация АФК наблюдалась при ФНО-о индуцированном апоптозе (Sidoti-de Fraisse et al., 1998; Shchepina et al., 2002).

На клетках линии HeLa было показано, что сверхэкспрессия у них белка р53 способна активировать апоптоз, не связанный с выходом цитохрома с из митохондрий и не требующий участия проапоптозных представителей семейства Вс1-2. При этом было показано, что сверхэкспрессия белка р53 приводила к повышенной продукции АФК в клетках. Апоптоз сопровождался активацией каспаз (неспецифический ингибитор каспаз zVADfmk подавлял гибель клеток) и ингибировался при сверхэкспрессии белка Bcl-2 (Li et al., 1999).

Продукция АФК может вызывать гибель гепатоцитов. Токсические эффекты ротенона (ингибитора комплекса I) и теноилтрифторацетона (TTFA) (ингибитора комплекса И) были опосредованы окислительным стрессом и переокислением липидов. При этом использование антимицина А и цианида - ингибиторов комплексов III и IV, соответственно, приводило клетки к гибели через активацию ГП и снижение уровня АТР в клетках, при этом не наблюдался окислительный стресс и не происходило переокисления липидов. Антиоксиданты подавляли гибель клеток, индуцированную ротеноном и TTFA, но не антимицином А и цианидом (Zhang et al., 2001). Эффективным ингибитором переокисления липидов и гибели клеток является антиоксидант а-токоферол. Взаимодействуя с гидроксил-радикалами, он подвергается одноэлектронному окислению с образованием токофероксил-радикала. Сукцинат d-a-токоферила (TS) - этерифицированная форма о>токоферола - обладает цитопротективным эффектом против различных митохондриальных токсинов (Fariss, 1997).

Сукцинат d-a-токоферила (TS) подавлял окислительный стресс и гибель гепатоцитов, индуцированные ротеноном, но не TTFA. При этом TS препятствовал ротенон-индуцированному переокислению липидов, но не влиял на снижение уровней GSH и АТФ в гепатоцитах. Обработка фруктозой подавляла АА и CN-индуцированную гибель гепатоцитов, препятствуя активации ГП и падению уровня АТФ в клетках. Снижение уровня GSH приводило к повышению чувствительности гепатоцитов к токсическим эффектам ингибиторов комплексов I и II, но не влияло на токсичность ингибиторов комплексов III и IV (Zhang et al., 2001). Регуляция апоптоза с помощью АФК и АФА

АФК в клетке вовлечены в различные физиологические процессы, являясь посредниками сигнальных путей, активаторами ПК, таких как тирозинкиназы, митоген-активируемые ПК (МАПК), белков Ras. Семейство МАРК включает киназы ERK (extracellular signal-regulated kinases, внеклеточные регулируемые киназы), JNKs (c-Jun N-terminal kinase, c-Jun N-концевые киназы) и p38-MAPK (Lewis et al., 1998). Добавление к клеточным культурам изотиоцианата или полифенолов зеленого чая может препятствовать у них химически-индуцированному развитию канцерогенеза через активацию МАРК-киназ (Owuor and Kong, 2002). Активация ERK-киназ происходит в ответ на действие факторов роста и дифференцировки и сопровождается стимуляцией тирозинкиназных рецепторов, рецепторов, зависящих от гетеротримерного G-белка и цитокиновых рецепторов. Киназы JNKs и р38 участвуют в регуляции апоптоза и активируются в ответ на различные стрессовые сигналы, включая УФ-облучение, действие хемотерапевтических агентов, осмотического стресса, гипоксии, гипертермии.

Помимо активации апоптоза в различных моделях, АФК способны активировать и антиапоптозные факторы, участвуя таким образом в сигнальных процессах клетки. АФК способны активировать транскрипционные факторы, такие как АР-1 и NF-кВ и индуцировать экспрессию защитных генов. В зависимости от типа клеток АФК могут стимулировать митоз (Clement and Pervaiz, 1999), индуцировать старение клеток (Lundberg, 2000), являться индукторами гибели клеток. Различные эффекты АФК на клетки опосредованы не только их неспецифическим окислением макромолекул, но также влиянием на сигнальные пути. Неспособность клеток детоксифицировать АФК при их повышенной

генерации приводит к окислительным повреждениям белков, ДНК и может вызывать гибель клеток. Ингибирование дыхательной цепи митохондрий может также стимулировать продукцию АФК и приводить к апоптозу (см. выше) (Fleury et al., 2002).

Редокс-статус клетки может иметь неопределенное влияние на апоптоз. Хотя
экзогенные АФК способны запускать процессы апоптоза, различные участники
апоптозной программы, например каспазы, чрезвычайно чувствительны к
окислительно-восстановительному состоянию клетки и требуют

восстановительных условий для своей активности. Один из потенциальных регуляторов апоптоза, NO, обладает способностью к индукции и подавлению апоптоза. Кроме этого N0 может переключать апоптоз на некроз.

Результат действия NO может зависеть от многих факторов, включая тип клеток, уровень стресса, редокс-состояние клеток и способность клеток бороться с АФК (Gramaglia et al., 2004).

При исследовании NO-индуцированного апоптоза клеток сетчатки было продемонстрировано, что NO может стимулировать продукцию цГМФ, активируя растворимую гуанилатциклазу (рГЦ) и приводить к повышению содержания Са²⁺ внутри клетки и активации апоптоза.

На других моделях было показано, что NO-зависимая генерация внутриклеточного nGMP защищала от апоптоза лимфоциты, эозинофилы, эмбриональные мотонейроны, клетки PC 12. Точный механизм защитного действия hGMP не известен. В случае РС12-клеток предполагается участие ПК G и предотвращение активации каспаз через ингибирование выхода цитохрома с из митохондрий. Недавно было показано, что молекулы цвМР способны подавлять апоптоз гепатоцитов, индуцированный ФНО-а и актиномицином D (Li et al., 2000), при этом наблюдалось повышение активности серин-треониновой киназы Akt. Активация киназы Akt усилиает выживаемость клеток через фосфорилирование проапоптозного белка Bad и прокаспазы-9. Однако, ингибирование активации Akt не влияло на защитный эффект цвМР, что говорит об участии цвМР в различных защитных сигнальных путях в клетке (Bruckdorfer, 2005).

Механизмы защитного действия NO, не связанные с цвМР, включают ингибирование переокисления липидов, удаление пероксил-радикала, выхода

цитохрома с из митохондрий, индукцию защитных белков (включая Вс1-2 и Hsp70). Кроме этого защитное действие N0 может быть опосредовано его участием в S-нитрозилировании белков. Каспазы, содержащие цистеин в своем активном центре, являются потенциальными мишенями S-нитрозилирования. Кроме этого каспазы восприимчивы к окислительным модификациям под действием АФК, при этом они образуют дисульфиды. В отличие от молекул N0, обладающих коротким периодом полураспада, нитрозотиолы - достаточно стабильные вещества. Дитиотрейтол (ДТТ) способен разрушать связи N0 с тиольными группами белков. DTT препятствовал NO-опосредованному ингибированию каспаз в Fas-индуцированном апоптозе клеток печени (Fiorucci et al., 2001). NO, продуцируемый донором SNAP или iNOS, ингибировал ФНО-индуцированный апоптоз гепатоцитов через S-нитрозилирование каспаз-8 и -3 (Kim et al., 2000).

S-нитрозилирование может влиять на функционирование многих важных сигнальных белков в клетке, включая тканевую трансглутаминазу (Ttg), транскрипционные факторы NF-кВ и АРІ, протеазу кальпаин, белок р53.

Окислительно-восстановительные изменения являются важным механизмом регуляции NMDA-рецепторов. Повышенная стимуляция ионных каналов, активируемых NMDA-рецепторами, и последующая продукция АФК вовлечены в процессы нейротоксичности при многих заболеваниях человека, таких как болезнь Хантингтона, Альцгеймера и СПИД. При этом гибель клеток может быть апоптозной или некрозной. S-Нитрозилирование NMDA-рецепторов обладает нейропротективным действием.

Ингибирование апоптоза с помощью NO может повышать некроз клеток за счет снижения уровня АТР в клетках вследствие нарушения ЭТЦ митохондрий и повышенной (по сравнению с некрозом) зависимости апоптоза от АТР (Gramaglia et al., 2004). NO может нарушать работу митохондрий, обратимо инактивируя цитохромоксидазу - конечный акцептор электронов дыхательной цепи, таким образом стимулируя продукцию супероксид-аниона, пероксинитрита и истощение уровня АТР в клетках. Комплексы I и II также подвержены действию NO. При этом ингибирование комплекса I сопровождается S-нитрозилированием тиолов, в то время как ингибирование комплекса II приводит к индуцированному ONOO" окислительному стрессу. NO может подавлять апоптоз ингибируя открытие ГП и

выход цитохрома с из митохондрий. Таким образом, в норме в клетке существует

баланс про- и антиапоптозных функций N0.

Сигнальные функции АФК и АФА в трансформированных клетках

Экспрессия в трансформированных фибробластах белка RAS приводит к активации GTPa3bi RAC, которая затем активирует NADPH-оксидазу. Трансформированные фибробласты при участии NADPH-оксидазы ПМ способны генерировать супероксидный анион-радикал, выполняющий в клетке сигнальные функции, такие как регуляция пролиферации и поддержание роста клеток. Супероксид может функционировать также как сигнал для трансформации клеток через повышение экспрессии оксидазы Мох-1 (Suh et al., 1999). Во многих клеточных системах активация NADPH-оксидазы и последующая продукция супероксида необходимы для запуска апоптоза (Finkel, 2000).

Истощение глутатиона в клетках приводило к запуску апоптоза трансформированных фибробластов через реакцию Хабера-Вейса, катализируемую металлами с переменной валентностью. В ^трансформированных клетках, апоптоз, индуцированный снижением уровня GSH, зависит от эндогенных АФК. В трансформированных же фибробластах АФК, производимые митохондриями, могут не играть значительной роли в гибели клеток из-за высокого уровня активности катал азы. Таким образом, в этом случае внеклеточные АФК более эффективны в индукции гибели клеток, по сравнению с внутриклеточными. Пероксид водорода, образуемый в результате дисмутации внеклеточного супероксида, способен регулировать внутриклеточный уровень активности каталазы в трансформированных клетках (Bauer, 2002).

Трансформированные клетки не зависят от программ старения, в них подавлены гены опухолевой супрессии и активированы онкогены (Hanahan and Weinberg, 2000). При трансформации происходит и изменение сигнальных путей клеток.

Разработана новая модель, межклеточная индукция апоптоза. Она заключается в индукции селективного апоптоза трансформированных фибробластов, запускаемого их ^трансформированными соседями. Повышенная чувствительность трансформированных клеток к естественным антиопухолевым агентам определяется повышенной продукцией АФК у трансформированных

ІРОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ I БИБЛИОТЕКА

клеток-реципиентов и продукцией пероксидазы и N0 в ^трансформированных клетках-эффекторах. NO используется в различных антиопухолевых системах, включая макрофаги (Heigold and Bauer, 2002), моноциты, натуральные киллеры (NK-клетки), гранулоциты и т. д. (Paul and Bauer, 2001). При этом во многих моделях сам NO может подавлять апоптоз через ингибирование переокисления липидов и S-нитрозилирование каспаз, в то время как продукт его взаимодействия с супероксидом - пероксинитрит — является мощным индуктором апоптоза.

Устойчивость ^трансформированных клеток объясняется исходно низкой продукцией у них супероксида (Bauer, 2002). При этом эбселен, селективная ловушка пероксинитрита, подавлял апоптоз в этой модели.

Супероксидный анион-радикал, обладая коротким временем жизни, способен диффундировать в клетке на расстояния в несколько микрометров (Saran and Bors, 1994). Супероксид может реагировать с некоторыми биомолекулами (например, с NO, цитохромом с), однако сам по себе он не способен активировать апоптоз. Антиоксиданты не влияют на уровень супероксида в клетке. Однако его взаимодействие с другими АФК или АФА приводит к образованию высокоактивных молекул. Перекись водорода, например, более активна и в определенных концентрациях способна вызывать гибель клеток (Li et al., 1997). При участии металлов с переменной валентностью перекись водорода в реакции Хабера-Вейса превращается в короткоживущий, но высокоактивный гидроксил-радикал. Взаимодействие супероксида с гипохлоритом также приводит к образованию ^#ОН. Непосредственное взаимодействие супероксида с NO приводит к образованию пероксинитрита (Beckman and Koppenol, 1996). Все эти продукты представляют собой мощные индукторы апоптоза.

Переокисление липидов, вызванное действием ЮН и пероксинитрита, может сопровождаться в клетке истощением уровня GSH, активацией сфингомиелиназы и последующим синтезом церамидов. Церамиды являются вторичными посредниками апоптоза в клетках и способны активировать ГП (Liu et al., 1998), приводя к выходу цитохрома с из митохондрий и активации каспаз.

Опухолевая трансформация клеток может происходить при активации онкогенов и инактивации генов-супрессоров опухолей (Hanahan and Weinberg, 2000). Опухолевые клетки могут обладать устойчивостью к антиопухолевым

сигналам, выделяемым Т-клетками, естественными киллерами (NK cells), макрофагами и гранулоцитами. Эти клетки способны индуцировать апоптоз трансформированных клеток через активацию рецепторного пути, пути с участием гранзима В, через выделение ФНО-ct, N0 и миелопероксидаз (Lafron et al., 1996). Многие механизмы направленного токсического действия АФК описаны в экспериментах, посвященных исследованию антибактериального действия гранулоцитов. Супероксид, образуемый гранулоцитами и превращающийся затем в перекись водорода и гидроксил-радикал, оказывает токсическое действие на бактериальные патогены (Bauer, 2000).

Продукция АФК при фотодинамической обработке клеток

В последнее время в борьбе со злокачественными образованиями организма широко используются методы фотодинамической терапии (ФДТ), основанные на активации фотосенсибилизаторов, селективно накапливающихся в злокачественных клетках. Фотосенсибилизаторы в возбужденном состоянии вызывают продукцию АФК в клетках и их последующую некротическую или апоптозную гибель (Oleinick et al., 2002; Kessel and Castelli, 1999).

Гиперицин - фотосенсибилизатор, образуемый растением Hypericum, способен селективно накапливаться в опухолевых клетках. Без облучения гиперицин обладает минимальной токсичностью для клеток (Agostiniss et al., 2002). Хотя гиперицин накапливается преимущественно в мембранах аппарата Гольджи и ЭР, его фотовозбуждение приводит к выходу цитохрома с из митохондрий и активации апоптосомы (Vantieghem, 2002).

В исследованиях, проведенных на клетках линии HeLa и Т24 (клетки карциномы мочевого пузыря человека), было показано, что фотодинамическая обработка клеток с использованием гиперицина сопровождалась активацией циклооксигеназы-2 (СОХ-2) и последующей продукцией простагландина PGE₂., участвующего в иммуномодуляторных ответах клетки. При этом ингибитор МАПК PD169316 препятствовал повышению экспрессии СОХ-2. Экспрессия р38 МАПК приводила к повышенной устойчивости этих клеток к фотодинамической обработке (Hendrickx et al., 2003).

Повышенная продукция АФК и загрузка Са²⁺ в митохондрии может приводить к падению потенциала ВММ и вызывать повреждения клеток. В

различных работах было показано влияние АФК, образуемых в результате фотодинамического облучения клеток, на падение A\j/_m (Duchen, 1999), выход Са ⁺ из ЭР, митохондриальную продукцию "АФК-индуцированных АФК" ("ROS-induced ROS release") (Zorov et al., 2000).

В целях понимания взаимоотношений активации ГП и продукции АФК на кардиомиоцитах была разработана модель, основанная на наблюдении продукции АФК в участках спонтанно деэнергизованных митохондрий. Эта продукция усиливалась при фотоактивации производных тетраметилродамина, накапливающегося в митохондриях. Локальное облучение отдельных митохондрий вызывало продукцию в них "запускающих" АФК (ROS triggering), которые приводили к падению потенциала митохондрий и открытию ГП (митохондрии становились проницаемы по кальцеину, этот процесс ингибировался бонгкрековой кислотой (БК), являющейся ингибитором компонента ГП - циклофилина Д). Продукция "запускающих" АФК подавлялась в присутствии антиоксиданта Тролокса. Активация ГП совпадала со вторичной "взрывной" продукцией АФК (burst ROS), этот феномен был назван "АФК-индуцированная продукция АФК" (Zorov et al., 2000).

Для исследования влияния падения митохондриального потенциала небольшой группы митохондрий на поведение всей клетки Aon и коллеги (2003) применяли локальное засвечивание митохондрий миоцитов желудочков гинеи. Падение Aif/, вызванное локальным облучением небольшой группы митохондрий с помощью лазера приводила к осцилляциям Ai|/, NADH и АФК в большей части митохондриальной популяции. При этом осцилляции происходили при продукции АФК выше определенного порогового уровня и не были связаны с активацией ГП и загрузкой Са в митохондрии. Ингибиторы комплексов I и III ротенон и миксотиазол, соответственно, ингибитор Fo-субъединицы АТРазы олигомицин подавляли осцилляции A\j/, индуцированные облучением. Антимицин А, стимулирующий образование семихинона повышал продукцию АФК в два раза. Ингибиторы анионных каналов в этой модели усиливали продукцию АФК в облученном участке, но блокировали распространение АФК по клетке, это говорит об участии АФК в открытии анионных каналов в митохондриях (Aon et al., 2003).

Jou и коллеги пытались понять механизмы продукции АФК и гибели астроцитов мозга крысы (rat brain astrocytes, RBA-1), индуцированные облучением лазера. При использовании флуоресцентного маркера MitoTracker Green и АФК-чувствительных красителей DCFH-DA и дигидрородамина было показано, что облучение астроцитов видимым светом вызывает митохондриальную продукцию АФК. Антиоксиданты витамин Е и мелатонин значительно снижали продукцию АФК, индуцированную облучением клеток с помощью лазера и препятствовали апоптозу. Блокатор ГП циклоспорин А (Цс А)не влиял на продукцию АФК и апоптоз в этой модели (Jou et al., 2002).

АФК, образуемые в результате фотодинамической обработки клеток, могут повреждать различные внутриклеточные белки. Существуют различные методы, позволяющие детектировать окисленные белки. Окисление белков по остаткам тирозина может определятья при использовании флуоресцеин-меченого аналога тирозина - тиромина (Tyr-Fluo) (Vlies et al., 2001) (подробнее см. выше). Многие сигнальные пути клетки реализуются посредством фосфорилирования тирозиновых остатков. Помимо остатков тирозина в белках к окислению с помощью АФК высокочувствительны также остатки цистеина, гистидина, метионина и триптофана (Sobolev et al., 2000).

Способность опухолевых клеток накапливать большие количества фотосенсибилизатора по сравнению с нормальными клетками и возможность локального облучения позволяет вызывать селективную гибель именно опухолевых клеток. При этом тип гибели клеток (апоптоз/некроз) может зависеть не только от природы и концентрации фотосенсибилизатора, но и дозы облучения (Moor, 2000).

Фотосенсибилизатор гипокреллин A (Hypocrellin А) в силу своей гидрофобной природы локализуется преимущественно в мембранах различных органелл клетки. При использовании красителя Tyr-Fluo было показано, что фотодинамическая обработка фибробластов Rat-І, загруженных гипокреллином, приводит к окислению определенных белков, отличных от окисляемых при действии 200 мкМ перекиси водорода. При этом было показано, что при примерно одинаковом суммарном уровне окисления белков по остаткам тирозина гипокреллин А после фотооблучения клеток приводил к апоптозу большинства

клеток, тогда как пероксид водорода практически не вызывал гибели (Sakharov et al., 2003).

Взаимодействие между активированным фотосенсибилизатором и молекулярным кислородом может приводить к образованию синглентного кислорода и вызывать гибель клеток (Oleinick and Evans, 1998). При этом из-за короткого времени жизни синглентного кислорода его повреждающее действие осуществляется вблизи участка локализации фотосенсибилизатора (Moan and Berg, 1991).

Другой фотосенсибилизатор - фталоцианин (Рс4) локализуется также в мембранах клетки. Облучение клеток epidermoid carcinoma человека (А431), загруженных Рс-4, светом с длинами волн 670-675 нм приводило к продукции в них АФК, повышению проницаемости НММ, деполяризации и набуханию митохондрий, выходу цитохрома с и апоптозу. Блокатор митохондриальной продукции АФК десфероксамин подавлял эти события. При этом блокаторы ГП Цс А и трифторопиразин (ТФП) ингибировали пермеабилизацию НММ и деполяризацию, но не влияли на продукцию АФК митохондриями (Lam et al., 2001).

Флуоресцентный краситель хлорметил-Х-розамин (MitoTracker Red) селективно накапливается в митохондриях, связываясь с тиолами белков и пептидов в матриксе митоходрий и обладает свойствами фотосенсибилизатора. Облучение клеток остеосаркомы человека 143 ТК", загруженных Mitotracker Red, приводило к падению потенциала НММ и повышению ее проницаемости, не связанной с открытием ГП митохондрий. В дальнейшем происходил выход цитохрома с из митохондрий и гибель клеток. Эти события происходили одинаково в клетках с нормальной митохондриальной ДНК (р⁺) и в клетках, лишенных митохондриальной ДНК (р ). Данные показывают, что этот процесс не требует участия окислительного фосфорилирования (Minamikawa et al., 1999).

MitoTracker Red может являться и антагонистом апоптоза, ингибируя СССР-индуцированную активацию ГП в тимоцитах мышей. Этот эффект не связан, вероятно, с фотоактивацией и обусловливается химическим взаимодействием MitoTracker Red с тиолами митохондрий (Marchetti et al., 1997).

Известно, что УФ способен вызывать гибель клеток in vitro и in vivo (Wu et al., 1999). Облучение клеток светом в синей области спектра способно вызывать повреждения клеток при интенсивностях в 10 раз ниже интенсивности, требующейся для повреждения клеток длинноволновым светом (например в зеленой области). Показано, что повреждения клеток, индуцируемые видимым светом, реализуются через развитие окислительного стресса (Tanito et al., 2002).

Фото динамическое воздействие света в области 425 нМ может приводить к развитию у человека заболевания age-related macular degeneration, которое сопровождается гибелью пигментных эпителиальных клеток сетчатки (ARPE-19). При этом было показано, что облучение синим светом клеток ARPE-19 приводило к продукции дыхательной ЭТЦ митохондрий супероксида, которая подавлялась при добавлении ротенона. Продукция супероксида не наблюдалась в клетках без митохондриальной ДНК. Антиоксидант mitoQ, представляющий собой убихинон, связанный с липофильным катионом трифенилфосфонием (селективно накапливающийся в энергизованных митохондриях под действием Ду) эффективно защищал клетки ARPE-19 от продукции АФК и гибели клеток, индуцированных облучением клеток синим светом (King et al., 2004). Показано, что антиоксидант mitoQ способен предотвращать переокисление липидов митохондрий и защищать митохондрии от окислительных повреждений, вызванных фотодинамической обработкой. После детоксикации АФК, mitoQ регенерируется дыхательной цепью - возможна реактивация его антиоксидантных проявлений. В культурах клеток mitoQ накопленный в митохондриях, защищал клетки от апоптоза, индуцированного Н₂Ог, но не СТ или ФНО-а. Сброс потенциала Avj/ в митохондриях с помощью протонофорного разобщителя FCCP препятствовал накоплению MitoQ в митохондриях и проявлению его антиоксидантных функций (Kelso et al., 2001). Кроме этого накопление mitoQ в митохондриях может препятствовать развитию у пациентов заболевания атаксии Фридриха, связанного с нарушением экспрессии в клетках белка фратаксина, приводящего к окислительным повреждениям в митохондриях. При этом идебенон короткоцепочечный аналог Qi₀, равномерно распределенный в цитоплазме и органеллах клетки, был менее эффективен, по сравнению с MitoQ (Jaustin et al., 2003).

Механизмы гибели клеток, индуцированной истощением А ТР

Живые клетки должны иметь системы защиты, следящие за нормальным функционированием их метаболических систем и структур, интактностью генома. Не будь этих систем защиты - появилась бы возможность существования клеток-"монстров", которые могли бы привести весь организм к гибели. Системы контроля, существующие в клетке, отражают "самурайский закон" биологии: "Лучше умереть, чем ошибиться" (Skulachev, 2000; 2002).

Уровень АТР в клетках является одним из решающих параметров гомеостаза клеток. В клетке предполагается наличие некоторых "АТР-метров", способных отслеживать изменения уровня АТР и инициировать гибель клеток при снижении уровня АТР ниже определенного порогового уровня. Энергетические расстройства в клетках не могут гарантировать нормальное поддержание гомеостаза и целостность генома, поэтому избирательное удаление клеток с пониженным уровнем АТР может сохранять интактность популяции клеток в целом.

При ишемии и последующей реперфузии миокарда кардиомиоциты гибнут путем апоптоза и некроза. При этом в механизмах гибели кардиомиоцитов могут принимать участие представители семейства белков теплового шока 70 (heat shock protein 70, Hsp70). Эти белки являются молекулярными шаперонами, снижающими агрегацию определенных белков в условиях теплового шока или энергетического голодания. С другой стороны белки Hsp70 способны подавлять стресс-киназу JNK, активирующую апоптоз при разлчных типах стресса (Mosser et al., 1997). В отличие о стресс-киназ JNK и р38 активируемая также при стрессе киназа Erk ингибирует апоптоз. Т. о. в результате потери энергии в клетках могут активироваться механизмы гибели и защиты (Yue et al., 2000).

Повышенная экспрессия белка Hsp72 снижала апоптоз во многих клеточных моделях (Beere et al., 2000).

Нарушения в энергетических процессах клеток может повышать их чувствительность к действию проапоптозных стимулов. Показано, что замена глюкозы на галактозу в среде культивирования значительно повышала чувствительность клеток HGT-1 (human gastric epithelial cell line) к действию пероксида водорода. В норме клетки HGT-1 в культуре обладают повышенной устойчивостью к окислительному стрессу (van Gorp et al., 1999). Из-за

невозможности участия галактозы в пентозофосфатном пути обработка пероксидом водорода вызывала выпячивание мембраны клеток (т. н. "блэббинг"), предшествующее некрозу. При этом в клетках снижалось отношение NADPH/NADP⁺ и наблюдалось истощение уровня GSH. Добавление 2-дезоксиглюкозы (2-ДОГ) подавляло НгОг-индуцированнную цитотоксичность через участие 2-ДОГ в пентозофосфатном пути (ПФП) и предотвращение снижения NADPH/NADP⁺ и истощения уровня GSH в клетках.

Обработка клеток с помощью NO в галактозо-содержащей среде вызывала быстрое снижение уровня АТР, добавление 2-ДОГ не влияло на этот процесс. Другим эффектом NO являлось нарушение редокс-гомеостаза клеток за счет истощение уровня GSH в клетках. Обработка клеток в галактозной среде или в среде с 2-ДОГ с помощью олигомицина вызывала быстрое снижение уровня АТР в клетках. Олигомицин не влиял на уровень АТР в клетках, инкубируемых в среде с глюкозой, в этом случае клетки при ингибировании окислительного фосфорилирования могли получать энергию за счет превращения глюкозы в лактат в процессе гликолиза (Goffe et al., 2002). На многих клеточных моделях показано торможение окислительного фосфорилирования в присутствии субстратов гликолиза (эффект Крэбтри) (Robinson, 1996).

Gabai и др. исследовали механизмы гибели миогенных клеток крыс Н9с2, индуцированную временным истощением уровня АТР, как экспериментальной модели ишемии/реперфузии in vitro. Было показано, что инкубация клеток в безглюкозной среде в присутствии ротенона приводила к снижению уровня АТР до 3% от исходного уровня. Последующее внесение клеток в нормальную среду инкубации приводило к восстановлению АТР до исходного уровня, при этом через 24 ч большинство клеток погибало с чертами апоптоза (фрагментация ядра) и некроза (повреждение ПМ). В условиях энергетического голодания происходила активация киназы SEK1, которая активировала стресс-киназу JNK. Экспрессия белка Hsp72 подавляла гибель клеток через подавление активации киназы JNK. Ингибитор киназы Erk PD98059, значительно повышал гибель клеток в этих условиях (Gabai et al., 2000). В продолжении этой работы было показано, что истощение АТР в клетках Н9с2 приводит к быстрой деэнергизации митохондрий, предшествующей продукции АФК. В этих условиях экспрессия каталазы снижала

продукцию АФК и подавляла некротическую гибель клеток. Продукция АФК и активация JNK в этой модели происходили независимо друг от друга в результате различных сигнальных путей, приводя клетки к некрозу. Было показано, что мутантный белок Hsp72, с нарушением функционирования в роли шаперона также мог предотвращать некроз клеток Н9с2 (Yaglom, et al., 2003).

В последнее время появляется все больше работ, в которых небольшие, обратимые повреждения клеток могли приводить к их гибели некрозом (Proskuryakov et al., 2003). Примером этого может являться описанный выше программированный некроз кардиомиоцитов. Показано также, что некротическая гибель клеток может быть обусловена ингибированием активности каспаз при снижении уровня АТР в клетках (Eguchi et al., 1999; Latta et al., 2000).

В работе, выполненной на культуре клеток почки RPTC (rat proximal tubule cells, клетки проксимальных почечных канальцев крысы) было показано, что истощение клеток по АТР, вызванное инкубацией в безглюкозной среде Рингера-Кребса в присутствии разобщителя окислительного фосфорилирования СССР, приводит к транслокации проапоптозного белка Вах из цитозоля к митохондриям и выходу цитохрома с в цитозоль. При этом сверхэкспрессия белка Вс1-2 не влияла на уровень истощения АТР в клетках и транслокацию белка Вах. Предполагается, что антиапоптозный эффект белка Вс1-2 заключается в стерическом препятствии вставке Вах в НММ и его олигомеризации, предшествующей выходу цитохрома с (Mikhailov, et al. 2001).

Эти же авторы показали, что транслокация белка Вах, индуцированная истощением уровня АТР в клетках вызывает гомоолигомеризацию белка Вах, в норме расположенного в митохондриях, при этом гомоолигомеры Вах и Вак могли копрецепитировать между собой. Олигомеризация Вах и Вак не зависела от активации белка Bid и блокировалась при экспрессии белка Вс1-2. Показано также, что Вах требуется для олигомеризации Вак, в то время как, Вак необходимый для транслокации Вах, не влияет на его олигомеризацию (Mikhailov et al., 2003).

Инкубация клеток RPTC в безглюкозной среде в условиях гипоксии, приводящая к снижению уровня АТР в клетках и последующая реоксигенация (при помещении клеток в нормальную среду инкубации и восстановлении уровня АТР в клетках) также приводили к выходу цитохрома с из митохондрий и активации

каспаз. При этом добавление глюкозы в момент гипоксии препятствовало падению уровня АТР в клетках и последующему развитию апоптоза. Если в условиях нормоксии клетки не способны были синтезировать АТР вследствие различных нарушений - апоптозный тип гибели переключался на некроз (Saikumar et al., 1998).

Показано, что обработка клеток Jurkat стауроспорином вызывает апоптоз. Инкубация этих клеток в безглюкозной среде с ротеноном приводила к снижению в них уровня АТР. Добавление глюкозы приводило к восстановлению уровня АТР в клетках Jurkat. При этом обработка клеток стауроспоином в этих условиях вызывала некроз. Сверхэкспрессия белка Вс1-2 в этих клетках была способна подавлять и апоптоз и некроз (Single et al., 2001).

Обработка клеток почечного эпителия с помощью NaCN и 2-ДОГ приводила к снижению в них уровня АТР. После восстановления уровня АТР в клетках при возврате их в нормальные условия происходили выход цитохрома с из митохондрий и активация каспаз. При этом было показано, что преинкубация клеток в условиях теплового шока вызывала экспрессию в них белка Hsp72 и в значительной степени подавляла апоптоз, индуцированный временным снижением уровня АТР в клетках. Предполагается, что защитный эффект белка Hsp72 заключается в его участии в поддержании целостности НММ и препятствию выхода проапоптозных белков из митохондрий. Кроме этого белок Hsp72 в роли шаперона может копрецепитировать с белком Вс1-2 и восстанавливать его функцию. Также показано, что Hsp72 может взаимодействовать с вышедшим из митохондрий цитохромом с и препятствовать образованию апоптосомы (Li et al., 2002).

В исследованиях, проведенных на интерлейкин-зависимых полилимфоидных клетках мышей FL5 и клетках Jurkat, было показано, что комбинированная обработка с помощью ингибитора комплекса III антимицина А и ингибитора АНТ бонгкрековой кислоты (БК) вызывала снижение уровня АТР в клетках и их последующую апоптозную гибель. При этом действие антимицина А и БК по отдельности не приводило к изменению уровня АТР в клетках и гибели - в этих условиях потребности клеток в АТР реализовывались за счет гликолиза. При этом экспрессия белка Вс1-2 в клетках FL 5 и Jurkat подавляла апоптоз, не влияя на

уровень истощения АТР в клетке. В безглюкозной среде антимицин А сам по себе вызывал более глубокое снижение уровня АТР в клетках и приводил к гибели клеток некрозом, не чувствительным к экспрессии Bcl-2 (Graaf et al., 2002).

Опухолевые клетки характеризуются повышенным уровнем гликолиза, который может приводить к закисленню внеклекточного матрикса и гибели нетрансформированных клеток соседей. Это позволяет опухолевым клеткам мигрировать в окружающую ткань (Gatenly and Gawlinski, 2003).

Замена глюкозы на пируват в среде инкубации и добавление 2-ДОГ приводили к снижению уровня АТР в клетках U937, HeLa и MCF-7 и повышали их чувствительность к апоптозу, индуцированному ФНО-се через повышенный уровень образования сигнального комплекса DISC и активацию каспазы-8. В этих условиях обработка клеток ФНО-а приводила к активации митохондриального пути апоптоза, сопровождающегося выходом цитохрома с и активацией каспазы-9. Истощение уровня АТР в клетках линии В-лимфобластомы человека SKW6.4, в которых обработка ФНО-о; не приводит в норме к активации митохондриального пути апоптоза, также приводило к повышению их чувствительности к ФНО-а (Munoz-Pinedo et al., 2003).

Клетки HeLa обладают высоким уровнем окислительного фосфорилирования и гликолиза. Ингибиторы дыхания миксотиазол, антимицин А и ротенон не влияли на уровень АТР в клетках и не вызывали их гибели, при этом клетки поддерживали уровень АТР за счет гликолиза. ДОГ в комбинации с любым из этих ингибиторов дыхания приводил к быстрому снижению уровня АТР в клетках HeLa и их гибели некрозом (Щепина и др., 2002). Наши эксперименты показали, что если после истощения уровня АТР поместить клетки HeLa в нормальные условия - уровень АТР в клетках быстро восстанавливается практически до исходного уровня, при этом через сутки наблюдается значительная апоптозная гибель клеток (Izyumov et al., 2004).

Хотя гипоксия сама по себе может приводить к тканевым повреждениям, более сильный эффект оказывают повреждения, индуцированные действием на клетки кислорода при реоксигенации. На клетках кардиомиоцитов цыплят (McPherson and Yao., 2001), клетках эпителия легких человека (Li et al., 2002)

показано участие дыхательной цепи митохондрий при продукции АФК после периода нахождения клеток в условиях гипоксии.

Инкубация клеток HUVEC (human umbilical vein endothelial cells, эндотелиальные клетки пупочной вены человека) в условиях гипоксии в безглюкозной среде в присутствии ДОГ и последующая реоксигенацция при помещении клеток в нормальную среду инкубации в условиях нормоксии приводили к повышенной продукции ими АФК. Ингибиторы немитохондриальных АФК-генерирующих систем: NADPH-оксидазы - DPI и апоцинин, ингибитор ксантиноксидазы аллопуринол, ингибиторы монооксигеназы DPI и цитохрома/?450 - «-нафтофлавин не влияли на продукцию АФК в этих условиях. При этом антимицин А почти полностью блокировал продукцию АФК при реоксигенации. Предполагается, что основным источником АФК в этой модели являлся цитохром Ъ комплекса III дыхательной цепи митохондрий (Therade-Matharan et al., 2004).

Протоонкоген с-Мус представляет собой ТФ, который формирует гетеродимер с белком Мах и активирует гены, вовлеченный в пролиферацию. Однако, сверхэкспрессия с-Мус клеткой в условиях недостатка ростовых факторов приводит к активации апоптоза (Conzen et al., 2000). В работе, выполненной на фибробластах крысы линии Rat-І было показано, что клетки с пониженной экспрессией белков Вах и Вак, экспрессирующие с-Мус, не гибли в условиях гипоксии и в безсывороточных условиях в отличие от контрольных клеток, экспрессирующих Вах и Вак. При этом клетки с пониженной экспрессией белка р53 погибали в условиях гипоксии, но не в безсывороточных условиях. Неспособность белка р53 участвовать в регуляции гибели клеток, индуцированной гипоксией может заключаться в недостаточной активации генов-мишеней р53 -белков Puma, Noxa и Pten. Белок, названный фактором, индуцируемым гипоксией (hypoxia-inducible factor, HIF), является проапототическим регулятором гибели клеток в условиях гипоксии, участвуя в активации транскрипции генов. Однако в данной работе гибель клеток в условиях гипоксии была HIF-независимой (Brunelle et al., 2004).

Серин-треониновая киназа PKB/Akt способна повышать потребление глюкозы клеткой и активность гликолиза (Gottlieb et al., 2000). Показано, что обработка клеток Jurkat 1,9-дидеоксифорсколином (ddFSK) вызывает

ингибирование гликолиза и окислительного фосфорилирования, приводя к снижению уровня АТР. Обработка ddFSK приводила к переключению апоптоза, вызванного различными индукторами на некроз. При этом ddFSK не влиял на образование апоптосомы. Снижение уровня АТР в клетках происходило Bcl-XL- и PKB/Akt-нечувствительным способом (Gramaglia et al., 2004). Сенсоры уровня АТР в клетках

Сенсором глюкозного истощения в клеток млекопитающих может являться ПК С, ее активация может также подавлять рецептор-индуцированный апоптоз клеток (Ruiz-Ruiz et al., 1999). Наиболее хорошо охарактеризованным сенсором изменения уровня АТР в клетках млекопитающих является АМР-активируемая ПК (АМРК), представляющая собой аналог дрожжевой киназы SNF-1 (Kemp et al., 1999). Показано ее участие в транскрипции генов, активируемых изменением снижением уровня глюкозы в клетках (da Silva Xavier et al., 2000).

АМРК представляет собой гетеротримерный комплекс, состоящий из каталитической а-субъединицы и нетакалитических /3- и 7-субъединиц. В условиях гипоксии, ишемии, теплового шока, низкого содержания глюкозы происходит повышение уровня AMP в клетках, это приводит к аллостерической активации АМРК, которая фосфорилирует многие субстраты, препятствуя снижению уровня АТР в клетках. АМРК ингибирует ключевые ферменты биосинтетических путей, такие как ацетил-КоА-карбоксилазу, участвующую в биосинтезе жирных кислот, и 3-гидрокси-З-метил-КоА, вовлеченную в синтез холестерола. Кроме этого АМРК стимулирует окисление жирных кислот и потребление клеткой глюкозы (Hardie et al., 1998; Sambandam and Lopaschuk, 2003). Хотя большинством идентифицированных субстратов АМРК являются ферменты метаболизма, появляются данные, демонстрирующие участие АМРК в экспрессии генов, существуют примеры ТФ и кофакторов, которые непосредственно регулируются АМРК (Leff, 2003).

Другим сенсором АТР в клетках является киназа mTOR (mammalian target of rapamycin, мишень для рапамицина млекопитающих), которая активируется в клетке в ответ на действие митогенов и аминокислот. Киназа mTOR связана с белком Raptor, который способен взаимодействовать с киназой р70 и облегчать ее фосфорилирование с помощью mTOR. Дисфункция митохондрий, приводящая к

снижению уровня АТР в клетках, подавляла с помощью АМРК активацию р70 через ингибирование сигнального пути mTOR (Tokunaga et al., 2004).

Показано, что митохондриальные ингибиторы, такие как ротенон, азид, СССР способны подавлять активацию р70 (Dennis et al., 2001). Ингибироваие клеток в безглюкозной среде также подавляло активацию киназы р70 (Kimura et al., 2003). Небольшое изменение уровня АТР в клетках может приводить к значительному повышению содержания AMP в клетке через действие аденилаткиназ, контролирующих концентрацию AMP в клетке и расположенных преимущественно в межмембранном пространстве митохондрий.

Потенциальным активатором киназы р70 может являться лейцин. Показано, что лейцин, действуя на комплексы TSC и Rheb, участвует в регуляции mTOR. Помимо этого лейцин и другие аминокислоты с разветвленной структурой участвуют в другом метаболическом пути, в котором лейцин с помощью аминотрансферазы превращается в а-кетоизокапроат и затем в митохондриях с помощью дегидрогеназы формирует изовалерил-КоА и NADH. Таким образом, лейцин способен также регулировать функции mTOR через митохондрии и активацию АМРК (Xu et al., 2001b).

Киназа АМРК способна взаимодействовать с опухолевым супрессором TSC2 (гамартином), который вместе с TSC1 (туберином), является антагонистом mTOR. Киназа РКВ, наоборот, активирует mTOR через фосфорилирование и инактивацию TSC2 ( Inoki et al., 2003). Регуляторы АМРК изучены гораздо хуже. Белок LKB, инактивация которого приводит к развитию синдрома Певтца-Джегерса, способен фосфорилировать и активировать АМРК.

Показано, что в условиях гипоксии в клетках линии DU145 (рак простаты человека) происходит быстрая активация АМРК, предшествующая индукции экспрессии HIF-1. Блокирование АМРК снижало экспрессию генов, транскрипционно активируемых HIF-1. АМРК-индуцируемая активация HIF-1 не зависела от фосфатидилинозитол-3-киназы (РІЗКУAkt) и от митоген-активируемых киназ (МАРК) (Lee et al., 2003).

ТФ HIF-1, состоящий из субъединиц HIF-la и HIF-1/3, активируется в условиях гипоксии. Его деградация при нормоксии происходит через Ог-зависимое пролил-гидроксилирование HIF-la и дальнейшее протеасомальное расщепление.

Действие киназы PI3K/PKB может приводить к повышению уровня HIF-1 в опухолевых клетках (Semenza, 2003). Дерегуляция митоген-активируемых сигнальных путей (зависящих и не зависящих от HIF-l) в опухолевых клетках позволяет им переключать свой метаболизм на гликолиз.

В условиях недостатка ростовых факторов, экспрессия белка Вс1-2 может защищать клетки от апоптоза. При этом РКВ может снижать уровень метаболизма в клетке и стимулировать гликолиз (Plas and Thompson, 2002). Более того, РКВ способна также ингибировать апоптоз через повышение активности митохондриальной гексокиназы, участвующей в первой стадии гликолиза -фосфорилировании глюкозы за счет АТР, производимой при окислительном фосфорилировании (Kuznetsov et al., 2004).

Растворимая гуанилатциклаза (рГЦ), являющаяся рецептором NO, ингибируется в присутствии гомеостазного уровня АТР. При этом снижение уровня АТР при инсульте приводит к активации рГЦ и ее взаимодействию с NO. Механизмы участия рГЦ в метаболических сигнальных путях пока не ясны (Ruiz-Stewart et al., 2004).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Использованные культуры клеток

В работе использовали линии клеток карциномы человека HeLa и HeLa-Bcl-2, любезно предоставленные сотрудником института полиомелита Г. А. Беловым. Культуры клеток выращивали в среде DMEM (Dulbecco-modified Eagle medium, среда Игла, модифицированная Дальбекко) с высоким содержанием глюкозы (25 мМ), без пирувата, с добавлением гентамицина сульфата (0,08 мг/мл) в присутствии 10%-ной эмбриональной телячьей сыворотки (FCS) (Gibco) в атмосфере 95% воздуха и 5% С0₂ при 37 С.

Линия клеток HeLa-Bcl-2 содержала трансфецированный вектор pLPC-bcl-2, содержащий ген устойчивости к пуромицину под контролем LTR вируса лейкоза мышей Молони. Это позволяло отбирать трансформированные клетки путем добавления в среду инкубации 1 мкг/мл пуромицина. Отличие линии HeLa-Bcl-2 от исходной было подтверждено с помощью Western-блота с использованием антител к белку Вс1-2.

Все эксперименты проводили через двое суток после посева клеток. Эксперименты по определению жизнеспособности клеток проводили в 96-луночных планшетах (Costar) с концентрацией 10⁴ клеток на одну лунку. В других опытах культуры клеток пересевали на чашки Петри (Costar) с покровными стеклами в концентрации 8,0x10⁴ клеток/мл.

Использованные реагенты

Стауроспорин - антибиотик, продуцируемый Streptomyces sp. В настоящее время он синтезирован для клинического применения в антираковой терапии. Хотя впервые стауроспорин был описан как ингибитор протеинкиназы С, в настоящее время известно, что он является неселективным ингибитором ряда протеинкиназ. Уникальное свойство стауроспорина состоит в его способности индуцировать апоптоз клеток млекопитающих. Этот антибиотик является классическим индуктором Bcl-2-зависимого апоптоза (Stepczynska et al., 2001). Концентрации стауроспорина в экспериментах- 1 мкг/мл; 50 нг/мл.

Фактор некроза опухолей а (ФНО-а) - цитокин плейотропного действия, который изначально продуцируется активированными макрофагами и лимфоцитами. TNF-a вызывает гибель раковых клеток у животных и множества

клеточных линий in vitro. Хотя он способен индуцировать как апоптоз, так и некроз, биохимические основы цитотоксического действия фактора некроза опухолей все еще во многом не выяснены. Трудность в понимании механизма действия состоит в том, что TNF-G! активирует множество сигнальных молекул и вторичных мессенджеров, включая фосфолипазы, киназы, фосфатазы, кислородные радикалы и транскрипционные факторы (Pastorino et al., 1996). Используемая концентрация rTNF-a в экспериментах составляла 5 нг/мл.

Эметин - ингибитор синтеза белка. Ингибирует только ядерный белковый синтез, не затрагивая митохондриального (Iordanov et al., 2000). Конечная концентрация эметина в экспериментах - 1 мкг/мл.

Ротенон - ингибитор NADH-CoQ-редуктазы (комплекса I) электронтранспортной цепи митохондрий. Участок торможения ротеноном локализаван между FeS^ и CoQ флавопротеинового фрагмента комплекса I (Скулачев, 1989). Конечная концентрация в опытах - 2 мкМ.

Антимицин А - ингибитор СоС^Нг-цитохром с-редуктазы (комплекса III) электронтранспортной цепи митохондрий. Он блокирует перенос электронов с гема Ьь цитохрома b на убихинон. Участок связывания антимицина расположен вблизи внутренней (обращенной в матрикс) поверхности внутренней митохондриальной мембраны (Sanchez-Alcazar et al., 2000). Конечная концентрация в опытах - 2 мкМ.

Миксотиазол - другой ингибитор СоОДІг-цитохром с-редуктазы (комплекса III) электронтранспортной цепи митохондрий. Он блокирует окисление убихинола белком Риске (FeSni-белком), предотвращая формирование убисемихинона (Sanchez-Alcazar et al., 2000). Конечная концентрация в опытах - 1 мкМ.

Олигомицин - антибиотик, ингибирующий фактор F₀ (мембранный компонент) митохондриальной Н⁺-АТР-синтазы (Скулачев, 1989, Щепина и др., 2002). Концентрация в экспериментах - 5 мкг/мл.

Ауровертин В - ингибитор фактора Fi (компонента, обращенного в сторону цитоплазмы) митохондриальной Н⁺-АТР-синтазы (Vazquez-Laslop and Dreyfus, 1990). Концентрация в экспериментах - 10 мкМ.

2-ДезоксиЛ)-глюкоза (ДОГ) - конкурентный ингибитор гликолиза. В клетке фосфорилируется и конкурирует с глюкозо-6-фосфатом (Smith et al., 2000). Конечная концентрация - 5 мМ.

Карбонилцианид-п-трифторметоксифенилгидразон (FCCP) - протонофор, разобщитель окислительного фосфорилирования. Снижает ДдН на внутренней мембране митохондрий (Armstrong et al., 2001). Конечная концентрация в опытах -ЮмкМ.

2,4-Динитрофенол (ДНФ) - протонофор, разобщитель окислительного фосфорилирования (Linsinger et al., 1999). Концентрация в экспериментах - 0,1 мМ.

Оуабаин - специфический ингибитор №⁺/К⁺-АТФазы внешней мембраны животной клетки (Скулачев, 1989). Концентрация в экспериментах - 0,5 мМ.

Циклоспорин А - антибиотик, используемый в клинике как иммуносупрессор для предотвращения реакции отторжения трансплантата. Однако применительно к апоптозу циклоспорин является специфическим ингибитором неселективной поры митохондрий, «permeability transition роге» (РТР) (Sugano et al., 1999). Конечная концентрация - 5 мкМ.

Трифторпиразин - ингибитор фосфолипазы А₂, пролонгирующий действие циклоспорина A (Madesh and Hajnoczky, 2001). Конечная концентрация - 20 мкМ.

zVADfmk - карбобензокси-валил-аланил-аспартил-фторометилкетон. Неселективный ингибитор каспаз. Конечная концентрация - 50 мкМ. Приготовление растворов и сред для культивирования клеток Приготовление фосфатного буфера

Все компоненты фосфатного буфера (ФБ) растворяют в дистиллированной воде. В состав концентрированного в 10 раз ФБ входят: 80 г NaCl, 2 г КС1, 11,05 г Na₂HP0₄, 2 г КН₂Р0₄. Полученный раствор дотитровывают щелочью до рН 7,2-7,4. После этого в ламинаре ФБ фильтруют через фильтр, со вставленной нитроцеллюлозной мембраной с диаметром пор 0,22мкм. Приготовленный стерильный раствор ФБ хранится в холодильнике при 4 С. Приготовление безглюкозной поддерживающей среды Рингера-Кребса

Компоненты среды Рингера-Кребса растворяют в дистиллированной воде. В состав 1 л среды входят: 7,3 г NaCl, 0,286 г MgSCy7H₂0, 0,358 г КС1, 0,163 г КН₂Р0₄, 0,191 г СаС1₂-2Н₂0, 5,96 г HEPES. После растворения компонентов рН

среды доводят до 7,2-7,4, затем среду фильтруют в ламинаре. Приготовленный стерильный раствор хранят в холодильнике при 4 С. Приготовление растворов трипсина и ЭДТА

0,25%-ный раствор трипсина готовится на основе 1-кратного ФБ. После притоговления навески сухого фермента (из расчета 2,5 г на 1 литр ФБ) полученный раствор стерилизуют фильтрацией через нитроцеллюлозню мембрану. 0,02%-ный раствор Na-ЭДТА также готовится на основе ФБ и стерилизуется с использованием нитроцеллюлозной мембраны. Для снятия клеток с подложки используют смесь растворов трипсина и ЭДТА в отношении 1:1. Приготовление питательной среды Игла, модифицированной Дальбекко

Среду Игла, модифицированную Дальбекко (Dulbecco-modified Eagle medium, DMEM) готовят на деионизованной воде, а не на ФБ, поскольку в ее состав уже включены соли, поддерживающие рН-буферную емкость раствора. Сухую среду DMEM (Gibco) растворяют из расчета 13,38 г сухого порошка на 1 л деионизованной воды. Туда же добавляют 49 мл раствора бикарбоната натрия (NaHC0₃) для поддержания буферной емкости и 80 мг антибиотика сульфата гентамицина. рН полученной жидкой среды доводят до 7,2-7,4 с помощью соляной кислоты и стерилизуют через нитроцеллюлозный фильтр. Для проверки на стерильность среду перед использованием выдерживают 3 дня в термостате. Перед использованием в среду добавляют 10% эмбриональной телячьей сыворотки (fetal calf serum, эмбриональная телячья сыворотка (ЭТС), Gibco).

Методы работы Пересев клеток

Линии клеток культивировали в 25-см²-полистирольных культуральных флаконах производства Corning Costar Corporation. Растворы трипсина и версена и питательную среду DMEM перед использованием нагревали в термостате до 37 С. Из флакона с клетками, предназначенными для пересева, стерильно в ламинаре сливали среду инкубации и наливали около 3 мл смеси трипсина с версеном. После этого содержимое флакона сливали. Эту процедуру повторяли два раза. С помощью светового микроскопа определяли момент, когда клетки открепляются от подложки (в этот момент под микроскопом клетки имеют шаровидную форму, при этом нарушаются контакты между клетками). Интенсивно постукивая по стенкам

флакона дожидались момента, когда клетки открепляются от подложки. После открепления клеток во флакон наливали свежую питательную среду DMEM, содержащую 10% ЭТС и сливали часть суспензии клеток. После этого флаконы с клетками помещали в инкубатор (37 С, 5% СОг). Замораживаие и размораживание клеточных культур

Культуру клеток снимали с подложки, повторяя операции, используемые для пересева клеток. После открепления клеток во флакон наливали 2 мл среды для заморозки, состоящей из 50% питательной среды DMEM, 40% ЭТС и 10% ДМСО. Клеточную суспензию встряхивали и переносили в криопробирки. После этого пробирки помещали в морозильную камеру с температурой -70 С, после замерзания пробирки помещали в жидкий азот.

При разморозке суспензию клеток помещали в культуральный флакон, содержащий среду DMEM с 20%-ным содержанием ЭТС. После прикрепления клеток к дну культурального флакона (это занимает примерно 3-4 ч) среду инкубации во флаконе меняли на новую, содержащую 10% ЭТС. Пересев клеток для экспериментов

Суспензию клеток снимали с подложки смесью трипсина и версена и сливали в стерильные пузырьки. Концентрацию клеток определяли с помощью камеры Горяева, после этого суспензию клеток разводили средой для инкубации до нужной концентрации. В каждую культуральную пластиковую чашку Петри, содержащую 4-5 штук разрезанных на 4 части покровных стекол наливали по 2 мл суспензии клеток. Клетки в чашках Петри опускаются на дно, распластываются и начинают делиться. Пересеянные для эксперимента клетки использовали через двое суток с плотностью примерно 60% конфлюентности. Определение концентрации клеток с помощью камеры Горяева

Камера Горяева представляет собой специальное предметное стекло с выемкой определенной глубины и разметкой по дну на большие и маленькие квадраты фиксированного размера. Глубина камеры — 0,1 мм, площадь большого квадрата равна 1/25мм, площадь маленького - 1/400мм. Таким образом налитая суспензия клеток над большим квадратом камеры занимает фиксированный объем, равный 4x10" мл. Суспензию клеток, снятых с подложки, наносили на камеру и при помощи светового микроскопа осуществляли подсчет клеток. Для повышения

достоверности подсчет клеток производили в пяти больших квадратах камеры,

расположенных по диагонали. Концентрацию клеток определяли по формуле:

Х=(пх4000)/80,

где Х-число клеток в 1 мл суспензии;

n-сумма клеток в пяти больших квадратах;

80-количество маленьких квадратов в пяти больших;

4000-пересчетный коэффициент.

Определение жизнеспособности клеток

Жизнеспособность клеток определяли по их способности к восстановлению 3-(4, 5-диметилтиазол-2-ил)-2, 5-дифенилтетразолия бромида (МТТ, Sigma, CIIIA)(Liu et al., 1997). Клетки выращивали на 96-луночных планшетах, после обработки индукторами апоптоза добавляли краситель МТТ до финальной концентрации 0,25 мг/мл на 3 ч. Затем после удаления среды клетки в лунках растворяли с помощью ДМСО. Оптическую плотность измеряли на мультискане фирмы Labsystems Multiscan Plus (LKB, Финляндия) при 540 нм. В этом случае за контроль (100% живых клеток) принимали окрашивание клеток, выращенных в отсутствие индукторов апоптоза.

Определение жизнеспособности клеток с использованием флуоресцентных красителей

Для определения конденсации хроматина, происходящей в клетках при апоптозе, использовали флуоресцентный краситель Hoechst 33342 - (2'-[4-этоксифенил]-5-[4-метил-1-пиперазинл]-2, 5'-би-1Н-бензимидазол) (Sigma, США). Краситель в концентрации 1 мкг/мл добавляли в конце инкубации на 25 минут к живым или фиксированным 4%-ным раствором формалина клеткам, выращенным на покровных стеклах. Фиксированные клетки промывали фосфатным буфером (PBS) и заключали в среду Vectashield (Vector, США). Препараты анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа (Zeiss) при длине волны возбуждающего света 365 нм.

Для определения некроза к нефиксированным клеткам добавляли флуоресцентный краситель пропидий йодид (PI) в концентрации (2 мкг/мл). Красители Hoechst 33342 и пропидий иодид флуоресцируют при разных длинах волн, поэтому возможно одновременное окрашивание клеток обоими красителями.

Процент апоптозных и некрозных клеток определяли с помощью подсчета числа клеток с фрагментированным ядром (с помощью красителя Hoechst 33342) и клеток, проницаемых по пропидию йодиду, соответственно. Определение продукции АФК

Для определения продукции активных форм кислорода (АФК) использовали флуоресцентные красители DCF-DA (2',7'-дихлородигидрофлуоресцеин диацетат) и его аналог 5-(и-6)-хлорметил-2',7'-дихлородигидрофлуоресцеин диацетата ацетиловый эфир (CM-H₂DCFDA) (Molecular Probes). Красители добавляли в питательную среду на 15 минут в концентрациях 5 или 20 мкМ в зависимости от эксперимента. Клетки анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии при длине волны возбуждающего света 490 нм или с помощью флуоресцентно-активируемого клеточного сортера (FACStar, Beckton-Dickinson). В последнем случае клетки выращивали на 40-мм-пластиковых чашках и после их окрашивания DCF-DA и снятия с подложки с помощью смеси трипсина и версена добавляли дополнительно пропидий иодид на 1 минуту.

При определении продукции АФК, вызванной фотодинамической обработкой, клетки окрашивали флуоресцентным красителем хлорметил-Х-розамином (Mitotracker Red) (200 нМ, 15 мин). Этот краситель способен селективно накапливаться в митохондриях под действием Д\|/ и стимулировать продукцию АФК митохондриями клетки после фотооблучения. Для детекции продукции АФК клетки параллельно окрашивали АФК-чувствительным красителем CM-DCFH-DA (5 мкМ, 15 мин).

Для определения АФК, образуемых липидами, к клеткам добавляли флуоресцентный краситель BODIPY-C11 в концентрации 1 мкМ на 30 минут (Рар et al., 1999). При этом анализ осуществляли с помощью конфокального микроскопа с использованием двойного возбуждения (488 нм, аргоновый лазер) и 543 нм (Не-Ne-лазер) (для окисленной и восстановленной форм BODIPY-C11, соответственно). Регистрация дыхания клеток

Скорость потребления кислорода клетками HeLa и HeLa-Bcl-2 измеряли полярографически, используя закрытый Pt-электрод Кларка, в ячейке объемом 0,5 мл при 37 С с постоянным перемешиванием. Для измерения дыхания в ячейку со средой DMEM с низким содержанием глюкозы (5,5 мМ), содержащей 10% ЭТС,

вносили суспензию клеток (около5-7 х 10⁶ клеток/мл). Рассчитывали скорость

дыхания клеток, принимая растворимость кислорода в среде измерения при 37 С

равной 406 нг-атомам кислорода/мл и выражали в нг-атомах кислорода/мин на 10

клеток.

Иммунофлуоренсцентное окрашивание клеток

Клетки, выращенные на покровных стеклах после инкубации с различными добавками, промывали фосфатным буфером и фиксировали 4%-ным раствором формалина. После этого клетки еще раз промывали фосфатным буфером и пермеабилизовывали с помошью 0,1%-го раствора тритона Х-100. Клетки окрашивали моноклональными антителами к цитохрому с (PharMinger) в разведении 1:120 и поликлональными антителами к белку Вах (Rabbit Anti-human Вах) (PharMingen) в разведении 1:120. Затем после отмывки клетки окрашивали с помощью СуЗ- и FITC-конъюгированных вторичных антител (Oregon green goat anti-mouse IgG (H+L) и Texas Red-X goat anti-rabbit IgG (H+L) conjugate) в разведении 1:500. Клетки на покровных стеклах заключали в среду Vectashieid на предметных стеклах. Выход цитохрома с и транслокацию белка Вах анализировали с помощью инвертированной флуоресцентной и конфокальной микроскопии. Регистрация выхода цитохрома с с помощью Western блота

После инкубации с индукторами апоптоза суспензию клеток центрифугировали в пробирках Eppendorf при 4С 10 мин при 960 g. В осадок добавляли буфер для гомогенизации, содержащий 50 мМ K/NaPi, 100 мМ КС1, 1 мМ дитиотрейтола (ДТТ), 1 мМ ЭДТА, 10 мкМ леупетина, 1 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF) и еще раз центрифугировали для промывки. В осадок добавляли еще раз буфер для гомогенизации и клетки разрушали с помощью гомогенизатора при 4С. Далее суспензию центрифугировали 10 мин при 960 g и оставляли супернатант, состоящий из митохондриальной и цитозольной фракций клеток. Супернатант цетнрифугировали при 10000 g 10 минут и таким образом разделяли цитозоль и митохондрии клеток. Образцы выравнивали по концентрации белка с помощью бицинхолиновой кислоты.

Образцы разделяли с помощью электрофореза в денатурирующих условиях (по Лэмми) в 15%-ном акриламидном геле. Далее с помощью аппарата для

блоттинга образцы переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Whatman) в буфере для блотирования (TBS), содержащим 150 мМ NaCl и 50 мМ Tris (рН 7,6). Образцы блокировали в течение ночи при 4С при покачивании в TBSM-буфере (TBS, содержащем 5% обезжиренного сухого молока). После этого мембраны инкубировали с моноклональными антителами к цитохрому с (Pharmingen) в разведении 1:1500. После отмывки буфером TBS, содержащем 0,1% Tween, мембраны инкубировали с конъюгатом вторичных антител с пероксидазой хрена (Calbiochem). Затем мембраны обрабатывали с помощью растворов ECL (enhanced hemiluminescence) в течение 5 минут. Участки связывания антител с цитохромом с выглядели после наложения рентгеновской пленки как засвеченные пятна. Полученные пленки сканировали и обрабатывали в программа Adobe Photoshop. Истощение уровня АТР в клетках и его восстановление

Для снижения уровня АТР клетки инкубировали в среде DMEM с низким содержанием глюкозы (5,5 мМ) в присутствии 5 мМ 2-дезокси-В-глюкозы (ДОГ) в комбинации с одним из митохондриалных ингибиторов (олигомицином, миксотиазолом, или FCCP) в течение 3 ч. После этого среду меняли на DMEM с высоким содержанием глюкозы (25 мМ) с добавлением используемого ранее митохондриального ингибитора.

Для индукции более глубокого падения уровня АТР в клетках вместо среды DMEM с низким содержанием глюкозы была использована солевая безглюкозная среда Рингера-Кребса.

Уровень АТФ в клетках оценивали с помощью люциферин-люциферазного метода с использованием LKB-реагента. Определение концентрации белка проводили с использованием бицинхолиновой кислоты.

Похожие диссертации на Программируемая гибель клеток и окислительный стресс, вызванные ингибиторами митохондриальных функций

Механизмы гибели клеток в экстремальном состоянии и подходы к их коррекцииШнейвайс, Владимир Борисович

Программируемая гибель клеток растений. Ультраструктурные изменения устьичных клеток горохаДзюбинская Елена Валерьевна

Активные формы кислорода и их источники в программированной гибели клеток растений и цианобактерии Anabaena variabilisШестак, Анна Александровна

Сравнительный анализ гибели клеток у цианобактерий и растенийСиницын Сергей Владимирович

Программируемая гибель устьичных клеток гороха Киселевский Дмитрий Борисович

Шапероны в реакции клеток К562 на тепловой стресс Новоселов Сергей Станиславович

Реакция стволовых клеток человека на тепловой стрессАлексеенко Лариса Леонидовна

Влияние полиморфизма гена каталазы на индуцированный окислительным стрессом апоптоз лейкоцитов и клеток меланомы кожиКомина Анна Владимировна

Молекулярные механизмы ответов эндометриальных стволовых клеток человека на окислительный стрессБородкина Александра Васильевна

Окислительный стресс и действие разобщителей. Ультраструктурное исследование на клетках Saccharomyces cerevisiae и Podospora anserinaОжован, Сильвия Михайловна