Введение к работе
Актуальность проблемы. Разработка методов селективного воздействия на определенные нуклеиновое кислоты с целью регуляции их функций в клетке является ванным направлением исследований для создания новых подходов к решению ряда проблем молекулярной биологии и медицины. В практическом плане наиболее важным приложением таких методов является борьба с инфекционными заболеваниями, например, с вирусными инфекциями. Второй важной задачей, которая могла бы быть решена при наличии эффективных методов воздействия на определенные гены, является контроль дифференцировки и пролиферации эукариотических клеток, в первую очередь, как средство борьбы с опухолевыми заболеваниями.
Успехи последних лет в области конструирования и исследования производных олигонуклеотидов позволяют рассматривать их как новый класс биологически активных веществ, избирательно воздействующих на нуклеиновые кислоты и регулирующих экспрессию определенных генов. В связи с этим актуальной задачей в настоящее время является изучение закономерностей взаимодействия олигонуклеотидов и их производных с мРНК на стадии трансляции. Использование для этих целей простых модельных систем трансляции позволяет исключить трудоемкую работу по выбору оптимальной последовательности-мишени в структуре определенной мРНК для олигонуклеотидных воздействий на более сложных системах - на уровне клеток и организма в целом.
Цель работы. Целью настоящей работы являлся поиск последовательностей в структуре мРНК вирусов гриппа и клещевого энцефалита, наиболее чувствительных к олигонуклеотидвим воздействиям In vitro, а также анализ закономерностей процесса ингибирования трансляции с помощью олигонуклеотидов применительно к этим матрицам. Поскольку в клетках ингибирование трансляции олигонуклеотвдами может быть опосредовано активностью РНКазы Н, расщепляющей мРНК в месте образования гетеродуплекса, и зависит от наличия этого фермента, необходимо было исследовать возможность использования реакционноспо-собных производных олигонуклеотидов с целью имитации необратимого повреждения мРНК, вызываемого РНКазой Н.
В задачу исследования входило изучение специфичности действия используемых олигонуклеотидов и их производных на трансляцию определенных мРНК, выбранных в качестве мишеней как в бесклеточной системе так и на культуре клеток.
Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей
работе проведено исследование влияния олигонуклеотидов, комплементарных различным участкам МРНК-М1 вируса гриппа и мРНК, кодирущих белки вируса клещевого энцефалита на их трансляцию в Оесклеточной системе из ретикулоцитов кролика и выявлены. олигонуклеотиды, селективно и наиболее эффективно подавляющие трансляцию соответствующей мРНК. Результаты этого исследования могут быть использованы при конструировании различных производных олигонуклеотидов с целью создания высокоэффективных ингибиторов, подавляющих размножение вирусов в клетках.
Впервые в бесклеточной системе трансляции было показано, что
4-(К-2-хлорэи1л-И-метилашшо)бензиламидное производное олигонукле-
отида, комплементарного мРНК легкой цепи иммуноглобулина G, выде
ленной из миеломных. клеток, является более эффективным ингибитором
трансляции этой матрицы по сравнению с олигонуклеотидом, не содер
жащим реакционноспособной группы. . .
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ. Материалы диссертации были доложены на Международном симпозиуме "Структура, биосинтез и функции молекулярных элементов иммунной системы (Пущино,' 1987), Международном рабочем совещании "Перспективы терапевтического и диагностического применения производных олигонуклеотидов'' (Новосибирск, 1988), Международном совещании "Биосинтез белка" (Пущино,.1991) и на Международном совещании по биологическим эффектам антисмысловых олигонуклеотидов (Франция, 1992).
Структура и объем работы, диссертация изложена на 145 страницах, включающих 28 рисунков, 9 таблиц и список литературы. Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, выводы.
