Введение к работе
Одной из принципиальных проблем современной клеточной биологии является изучение различных уровней упаковки ДНК в хромосоме и, в частности, петлевой организации ДНК. Без выяснения взаимосвязи структурной и функциональной организации генома невозможно понимание всего многообразия процессов, происходящих при реализации генетической информации.
Гены так называемой 768 РНК хирономид, локализованные в кольцах Бальбиани - гигантских пуффах политенных хромосом из слюнных желез личинок, являются уникальным объектом для изучения всего пути от кодирования генетической информации до функционирования продуктов работы этих генов - секреторных белков личинки. Особые преимущества генов 758 РНК для исследования пространственной организации ДНК в пуффе обусловлены гигантскими размерами этих генов, повышающими относительную разрешающую способность цитологических методов. К моменту начала настоящей работы структура транскрипционного домена (петли) генов 758 РНК была частично изучена. Установлено, что ДНК между соседними молекулами РНК полимераз имеет диаметр около 5 нм, а при достаточно большом расстоянии между полимеразами может быстро компактизоваться до фибриллы диаметром 10 нм и далее до 30 нм (Andersson et al., 1980, 1982, Bjorkroth et al., 1988). Была исследована структура растущей РНП частицы (Skogiund et al., 1983, 1986). Детально была изучена ультраструктура ДНП фибриллы, примыкающей t 3* и б' концам гена (Ericsson et al., 1989). Однако, попытки реконструировать пространственную организацию целой транскрипционной петли оканчивались безрезультатно. Трудность такого рода работы обусловлена наличием в политенной хромосоме большого числа сложно переплетенных копий активно работающего гена, что практически не позволяет проследить путь отдельной петли. Для решения этой задачи необходим был новый подход. Было очевидно, что реконструкция петли генов 758 РНК in situ, т.е. в составе фиксированной клетки, также невозможна из-за наличия структур ядерного матрикса, затрудняющих анализ электронно- микроскопического изображения. Предполагалось использовать для данной цели изолированные политенные хромосомы, поскольку было показано, что они сохраняют большую
степень нативности (BJorkroth at al., 1888). С другой стороны, мы полагали, что уменьшить количество копий ДНК можно за счет использования хромосом низкой степени политении. Однако, ко времени начала настоящей работы не существовало метода изолирования таких хромосом.
Таким образом, основной целью настоящей работы являлось исследование принципов пространственной организации ДНК в состоянии высокой транскрипционной активности с использованием новых методических подходов.
В конкретные задачи работы входило:
разработка метода приготовления электронно-микроскопических препаратов изолированных хромосом низкой степени политении;
- реконструкция трехмерной организации транскрипционных петель в кольцах Бальбиани;
количественный анализ полученных результатов и выявление основных закономерностей процесса транскрипции генов 75S РНК;
применение метода электронно-микроскопической компьютерной томографии для получения компьютерных образов реконструированных петель;
апробирование метода Миллера для приготовления препаратов распластанных хромосом малой степени политении для получения материала, пригодного для статистического анализа.
Актуальность подобного исследования обусловлена тем, что создание адекватной модели транскрипционного процесса невозможно без учета изменений в способе упаковки ДНК и ее укладки в пространстве. Следует подчеркнуть, что высокие уровни организации ДНК, такие как фибриллярный и хромомерный, остаются до сих пор слабо изученными, и исследование изменений в структуре ДНК при транскрипции является актуальным и для выяснения общих принципов упаковки ДНК в ядре.
К основным результатам проделанного исследования можно отнести описание пространственной организации целых трансрипционных петель генов 75S РНК и определение количественных характеристик расположения РНП гранул на петле. Было строго показано, что петли ДНК являются "открытыми", т.е. незамкнутыми в основании. В целом они в значительной степени
отрелаксированы и содержат не более 1-2 супервитков по всей гигантской длине ДНК. Анализ расположения РНП гранул вдоль ДНК показал, что , петли могут находиться в разной степени транскрипционной активности, при этом увеличение активности транскрипции связано с удлинением петли. Особенностью этого процесса является то, что при посадке каждой молекулы РНК-полимеразы петля дозированно удлиняется, а по окончании транскрипции ДНК быстро компактизуется в 80 ем фибриллу. При использовании метода Миллера нам не удалось получить хороио расправленных транскрипционных петель, однако, было, обнаружено и описано значительное . количество полирибосом, предположительно содержащих 75S РНК. В частности, показано наличие двух классов полирибосом, отличающихся по присутствию на 3' конце группы рибосом без видимой полипептидной цепи. В результате сформулирована задача для продолжения исследований в рамках использованных методик с применение иммунной электронной микроскопии.
Научная новизна. В данной работе впервые проведен качественный и количественный анализ целой транскрипционной петли, позволивший сформулировать основные принципы организации ДНК пуффа в активном состоянии. Морфологическое по сути исследование позволило получить данные, характеризующие динамику молекулярных процессов, получение которых, по-видимому, затруднено или даже невозможно при использовании стандартных "молекулярно- биологических" методик.
Практическая ценность. Разработан оригинальный метод приготовления электронно-микроскопических препаратов изолированных политенных хромосом, позволяющий значительно сократить время между изолированием и фиксацией хромосом. В результате появилась возможность исследовать хромосомы малой степени политении, недоступные для исследования традиционными методами. Показано, что при изолировании хромосом длина транскрипционной петли сокращается, что необходимо учитывать при проведении количественного анализа результатов, получаемых при работе с изолированными хромосомами.
Апробация работы. Методические - аспекты и результаты работы докладывались на VIII Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Пущино, 1984), на Всесоюзном
симпозиуме "Эволюция, видообразование и систематика хирономид" (Новосибирск, 1985), на V Всесоюзном совещании "Структура и функции хромосом" (Пущино, 1985), на III и IV рабочих совещаниях по кольцу Бальбиани (Ладвиг, Швеция, 1987 и Браунвальд, Швейцария, 1989, соответственно), на I, II и III симпозиумах по клеточной и молекулярной биологии Каролинского Института (Скоклостер, Швеция, 1989, 1990 и 1991, соответственно).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 сообщения и 1 статья находится в стадии подготовки к печати.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материалы и методы, две главы с результатами исследований и обсуждением соответствующих результатов), заключения, общих выводов и списка литературы. Работа изложена на 80 страницах машинописного текста и иллюстрирована 15 рисунками. В списке литературы приведено 123 источника.
