Введение к работе
Актуальность проблемы. Трансляция мРНК в клетке это сложный процесс, который с точки зрения механизмов обычно разделяют на три стадии: инициацию, элонгацию и терминацию. Лимитирующей стадией процесса биосинтеза белка является в подавляющем числе случаев инициация- стадия, на которой происходит присоединение рибосомы к мРНК и поиск стартового кодона. Регуляция процесса трансляции в эукариотической клетке за редкими исключениями направлена именно на регуляцию стадии инициации. Поэтому неудивительно, что как раз инициация трансляции привлекает внимание ученых, изучающих регуляцию биосинтеза белка, в первую очередь.
В клетках эукариот помимо канонического кеп-зависимого механизма, когда рибосома привлекается на мРНК с помощью метилированного остатка гуанозина на 5'-конце мРНК - кепа (от англ. cap), инициация трансляции может осуществляться за счет посадки рибосомы непосредственно внутри мРНК (так называемые участки внутренней посадки рибосомы или IRES'bi от англ. Internal Ribosomal Entry Site). По кеп-зависимому механизму транслируются если не все, то, по крайней мере, подавляющее большинство всех мРНК эукариот, тогда как IRES-зависимая инициация характерна в первую очередь для мРНК тех вирусов, жизненный цикл которых полностью протекает в цитоплазме. Не имея на 5'-конце собственных мРНК кеп-структуры, они не могли бы эффективно конкурировать за компоненты инициаторного аппарата с клеточными матрицами, не будь у них специальных механизмов инициации трансляции. Считается также, что в некоторых клеточных мРНК также существуют IRES-элементы, однако в последние годы было опубликовано немало работ, ставящих это под сомнение. .
Одним из вирусов, использующих IRES-зависимый механизм инициации для трансляции своей мРНК в клетках, является высокопатогенный вирус гепатита С. В настоящее время по некоторым оценкам им инфицировано более 3% населения Земли (170 млн человек), и как причина смерти гепатит С выступает даже чаще, чем вирус иммунодефицита человека. При заражении вирус в основном поражает клетки печени, но причины такой тканеспецифичности пока неизвестны. Одна из наиболее вероятных гипотез - регуляция жизненного цикла вируса специфическими компонентами клеток печени.
Понятно, что со времени своего открытия в 1989 году вирус гепатита С является одним из самых изучаемых вирусов, однако многие аспекты его жизненного цикла остаются малоизученными в силу отсутствия адекватных in vivo систем, где бы вирус
эффективно реплицировался. Некоторые важные детали трансляции его мРНК также остаются неразгаданными: как осуществляется регуляция трансляции мРНК вируса, какие рибосомные белки участвуют во взаимодействии рибосомы с IRES'ом, какова роль отдельных доменов в 5'-нетранслируемой области и высоко консервативной 3'-нетранслируемой области мРНК, какова причина тропизма вируса к клеткам печени? Все это далеко не полный перечень вопросов, которые до сих пор остаются открытыми. Ответы на них, возможно, позволили бы в перспективе хотя бы снизить риск развития у больных тяжелых заболеваний, таких как цирроз и рак печени. По структуре и функциональной роли 5'- и 3'- нетранслируемых областей РНК HCV уже опубликованы сотни работ. И тем не менее все время остаются неясными некоторые моменты в их организации, механизме взаимодействия с 40 S рибосомными субчастицами и друг с другом. Три части этой диссертационной работы и посвящены отдельным, активно дискутируемым в литературе аспектам организации и функционирования 5'- и 3'-нетранслируемых областей РНК вируса гепатита С. Цели исследования:
Исследование роли рибосомного белка р40 в образовании бинарного комплекса 40S рибосомной субчастицы с IRES'ом мРНК вируса гепатита С.
Определение роли домена I 5'-нетранслируемой области мРНК вируса гепатита С в инициации трансляции.
Определение роли 3' -нетранслируемой области мРНК вируса гепатита С в инициации трансляции
Научная новизна и практическая значимость. В ходе работы было показано, что антитела к рибосомному белку р40, который расположен в районе места связывания IRES'а вируса гепатита С на 40 S рибосомной субчастице, подавляют трансляцию в бесклеточной системе лизата ретикулоцитов кролика. При этом было показано, что добавление антител не влияет на стадию элонгации и терминации трансляции. Эти результаты совместно с результатами наших коллег из Новосибирска являются первыми, указывающими на роль рибосомного белка р40 в кеп-независимой трансляции.
Методом внесения делеционных мутаций в 5'-нетранслируемую область вируса гепатита С было показано, что наличие домена І в 5'-нетранслируемой области мРНК ингибирует трансляцию, направляемую IRES'ом, в 4 раза в клетках печени и в 2 раза - в непеченочных клетках. Причем основной вклад в это ингибирование вносит область между доменом I и доменом II, который уже входит в состав IRES-элемента.
С помощью модельной мРНК, содержащей два инициаторных кодона для одной рамки считывания: AUG-кодон HCV и AUG-кодон люциферазы, было показано, что IRES
вируса гепатита С направляет трансляцию исключительно со «своего» инициаторного код она. При кепировании IRES'а он может направлять инициацию трансляции и по классическому сканирующему механизму. В этом случае инициация может осуществляться как с IRES-ного, так и с расположенного ниже AUG-кодона. Впервые экспериментально показано, что молекула мРНК, содержащая одновременно кеп и IRES-элемент, может направлять трансляцию или по сканирующему, или по IRES-зависимому механизму. Это наблюдение представляет интерес с точки зрения возможных вариантов инициации трансляции в эукариотических клетках, но не имеет прямого отношения к реальной трансляции РНК HCV, которая, как известно, не кепирована. Поэтому данный раздел работы приводится в диссертации, но не в автореферате
Наконец, в ходе исследования специальных химерных конструкций показано, что З'-НТО мРНК вируса гепатита С аналогично поли(А)-последовательности стимулирует как IRES-, так и кеп-зависимую трансляцию in vivo и совершенно не влияет на эффективность трансляции in vitro. Важно отметить, что стимулирующий эффект не является тканеспецифичным.
Полученные данные объясняют наиболее спорные вопросы трансляции на мРНК вируса гепатита С: в частности, вопрос о роли З'-нетранслируемой области и домена 15'-нетранслируемой области мРНК вируса в инициации трансляции. Кроме того, полученные данные впервые указывают на роль рибосомного белка р40 в IRES-зависимой трансляции, и впервые исследован сканирующий механизм на IRES-содержащей РНК и показан его фактический вклад в общую трансляцию на IRES-содержащей мРНК.
Апробация работы. Диссертация была апробирована на заседании кафедры молекулярной биологии Биологического факультета МГУ 14 мая 2010 года. Материалы работы были представлены на международной конференции Ribosomes 2010, Италия, 2010.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 печатные работы.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 75 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и обсуждения, материалы и методы, выводы и список литературы. Материал иллюстрирован 30 рисунками и 1 таблицей. Библиографический указатель включает 200 цитированных работ.
