Молекулярно-генетические механизмы эволюции вируса гепатита C Калинина, Ольга Викторовна

Введение к работе

Актуальность проблемы

По данным Всемирной Организации Здравоохранения, в мире более 150 млн. человек (около 3% населения планеты) инфицировано вирусом гепатита С (ВГС), ежегодно более 350 тыс. человек умирает от болезней печени, ассоциированных с вирусным гепатитом С (ГС) [Инф. бюлл. № 164, ВОЗ, 2012]. За последнее десятилетие число зарегистрированных больных хроническим гепатитом С (ХГС) в Российской Федерации увеличилось вдвое и достигло 40,9%ооо [Вирусные гепатиты в РФ, под редакцией Онищенко Г., Жебрун А., 2010]. По тяжести течения заболевания, причиняемому экономическому ущербу ГС занимает одно из ведущих мест в инфекционной патологии человека. Это обусловлено высокой генетической вариабельностью ВГС, которая обеспечивает «ускользание» вируса от факторов иммунной защиты организма человека, что способствует значительной хронизации заболевания (до 70%) и затрудняет разработку эффективных методов специфической профилактики и лечения ГС [Шахгильдян И., Михайлов М., Онищенко Г., 2003]. В связи с этим и учитывая тот факт, что предотвращение распространения возбудителя является основным направлением борьбы с данным заболеванием, исследование природных популяций и эволюции ВГС приобретает особую актуальность в современных условиях.

Вирус гепатита С, один из наиболее динамично эволюционирующих патогенов вирусной природы, был открыт в 1989 г и отнесен к семейству Flaviviridae, род Hepacivirus [Choo Q. et al., 1989]. Современная классификация ВГС включает 6 генотипов и более 300 субтипов вируса, при этом постоянно появляются сообщения о выявлении новых вариантов вируса [Simmonds P. et al., 2005]. Долгое время генетическое разнообразие ВГС связывали только с высокой частотой мутаций, накапливаемых в геноме. Другой фундаментальный механизм изменчивости - рекомбинации, происходящие между геномами вирусов различных генотипов/серотипов, считали несвойственными ВГС или полагали, что образующиеся рекомбинанты являются «нежизнеспособными». Сравнение результатов генотипирования, выполненных на основании различных участков генома изолятов ВГС за более чем десятилетний период не выявило генетических рекомбинаций у данного возбудителя [Simmonds P. et al., 1999]. В то же время, в немногочисленных образцах сыворотки крови было обнаружено одновременное присутствие нескольких изолятов ВГС, принадлежавших к различным генотипам [Львов Д. с соавт., 1997; Jarvis L. et al, 1994; Gournay J. et al., 1995; Sheng L. et al., 1995; Viazov S. et al, 2000). Таким образом, вопрос о возможности формирования новых вариантов ВГС за счет рекомбинации между геномами изолятов различных генотипов оставался открытым, поэтому неполными оставались и представления о механизмах эволюции ВГС, понимание которых является крайне важным как в теоретических, так и прикладных областях исследований: для мониторинга глобальной и локальной популяций ВГС, для прогнозирования развития эпидемического процесса и научно-обоснованного выбора стратегии профилактических, лечебных и противоэпидемических мероприятий.

Изложенное определило цель и задачи настоящей работы.

Цель исследования

Изучить генетические механизмы изменчивости ВГС и оценить их вклад в формировании структуры современной популяции ВГС.

Задачи работы

1. Доказать с использованием молекулярно-генетических методов
исследования и филогенетического анализа наличие явления рекомбинации в
эволюции вируса гепатита С.

1. Изучить механизм формирования природного рекомбинанта RF12k/lb на основе анализа первичной и вторичной структур генома.

2. Оценить значение природного рекомбинанта RF12k/lb как модели для изучения молекулярно-генетических механизмов резистентности ВГС к противовирусным препаратам на примере резистентности к интерферону.

3. Оценить значимость природного рекомбинанта RF12k/lb в формировании современной структуры популяции ВГС.

4. Изучить роль синонимических мутаций в core области генома ВГС в формировании вариантов вируса с измененным белковым профилем.

Научная новизна

Впервые в мире доказано существование явления природной генетической рекомбинации ВГС и установлена его роль в эволюции ВГС.

Идентифицирован природный рекомбинант ВГС RFl_2k/lb, определена нуклеотидная и аминокислотная последовательность открытой рамки считывания рекомбинантного генома.

Впервые на основе анализа вторичной структуры «родительских» геномов и генома рекомбинанта предложена модель формирования природных рекомбинантов ВГС. Обоснована значимость природного рекомбинанта ВГС RF12k/lb для изучения молекулярно-генетических механизмов, обуславливающих формирование резистентности к интерферону.

Получены данные о распространенности природного рекомбинанта ВГС RF12k/lb в современной мировой популяции ВГС.

Показано значение синонимических мутаций в core области генома ВГС в эволюции ВГС при формировании вариантов с повышенным уровнем экспрессии core+1/ARFP белка, обуславливающего атипичный профиль антител к ВГС у лиц, инфицированных такими изолятами.

Практическая значимость исследования

Нуклеотидные последовательности изученных изолятов ВГС депонированы в международный компьютерный банк данных GenBank, что позволяет участвовать в международных исследованиях распространения природного рекомбинанта RF12k/lb и глобальной эпидемиологии ВГС; осуществлять мониторинг структуры популяции ВГС в различных географических зонах; проводить эпидемиологическую диагностику случаев спорадической и вспышечной заболеваемости вирусным гепатитом С (идентификация источника, путей и

факторов передачи, и благодаря этому - принятие адресных мер профилактики); расследование случаев завоза вариантов ВГС из других географических зон мира.

Картирование природного сайта рекомбинации легло в основу последующего создания in vitro успешных химерных рекомбинантов ВГС для изучения значения различных участков генома ВГС в морфогенезе вируса, в том числе, для изучения молекулярно-генетических механизмов, обуславливающих формирование резистентности к противовирусным препаратам.

В клинической практике доказательство инфицирования пациента природным рекомбинантом RF12k/lb позволит своевременно выбрать стратегию противовирусной терапии.

Полученные результаты могут быть использованы в деятельности клинико-диагностических лабораторий, учреждений Госсанэпиднадзора и здравоохранения, в научных учреждениях, при разработке целевых программ; в учебном процессе в медицинских вузах.

Положения, выносимые на защиту

1. Геном вируса гепатита С подвержен природной рекомбинации. Рекомбинация является одним из механизмов эволюции ВГС.

2. Природный рекомбинант RF12k/lb сформировался в результате гомологичной рекомбинации геномов lb и 2к по механизму непроцессивной смены матрицы.

3. Природный рекомбинант RF12k/lb обладает селективным преимуществом, обеспечивающим ему значимую роль в эпидемическом процессе по сравнению с «родительским» изолятом субтипа 2к.

4. Синонимические точечные мутации в core области генома вируса гепатита С могут приводить к формированию изолятов с измененным белковым профилем.

Апробация работы

По теме диссертации опубликованы 43 печатные работы, включая 12 статей в журналах списка, рекомендованного ВАК, 9 из них - в зарубежных изданиях.

Основные результаты исследований доложены и обсуждены на 22 российских и международных семинарах, конгрессах и конференциях в 2001-2013 гг.: 8^th International Symposium on Hepatitis С and related Viruses, 2-5 September, Paris, Франция, 2001; VIII Съезд Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, 26-28 марта, Москва, 2002; 5 Baltic Nordic Congress of Infectious Diseases, 22-25 May, 2002, St.Petersburg, Russia; 9^th International Meeting on HCV and Related Viruses, 7-11 July, 2002, San-Diego, USA; XII^th International Congress of Virology, 27 July - 1 August, 2002, Paris, France; 10^th International Meeting on HCV and Related Viruses, December, 2003, Kyoto, Japan; Human Hepatitis С Workshop in the frame of New Visby Program of the Swedish Institute Stockholm, 10 March, 2003; 14th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 1-4 May 2004, Praga, Чехия; 6^th Nordic-Baltic Congress on Infectious Diseases, 3-6 June, Palanga, Lithuania, 2004; 11^th International Meeting on HCV and Related Viruses, October, 2004, Heidelberg, Germany, 2004;

12th International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease. 1-5 July, Paris, Франция, 2006; 3rd HCV Visby Program Workshop: HCV infection- factors associated with persistence, clearance and protection, 13-14 February, Malmo, Sweden 2006; Международная научная конференция в честь 150-летия со дня рождения С.Н. Виноградского «Биоразнообразие и генетика микроорганизмов», 4-5 сентября, Санкт-Петербург, 2006, 4^th Annual New VISBY HCV University Network Meeting, 9-12 February, Stokholm 2007; Confer. Scientif. Internal Du Reseau Internal Des Instituts Pasteur, 26-27 June, Paris, Франция, 2008; 5^th Annual meeting of the New VISBY University Network on hepatitis С Moscow, 31 January - 4 February, 2008; Ha заседании лаборатории микробиологии и иммунологии Пекинского Детского Госпиталя, 9 ноября, 2011, Пекин, Китай; The 8th Annual Conference on Hepatitis C, Vilnius, 13-16 February, Lithvenia, 2011; The 9th Annual Conference on Hepatitis C, St Petersburg, 31 March - 04 April.2012; X Съезд Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, 12-13 Апреля, Москва, 2012; IV Ежегодный Всероссийский Конгресс по инфекционным болезням, 26-28 Марта, Москва, 2012; 10^th Annual Conference of New Visby Network in Hepatitis, 10-13 February, Riga, Latvia, 2013; Международная конференция к 90-летию НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, 5-7 Июня, Санкт-Петербург, 2013.

Внедрение результатов исследований в практику

5. Природный рекомбинант RF12k/lb включен в действующую классификацию вируса гепатита С как отдельная номенклатурная единица, названная циркулирующая рекомбинантная форма CRF 01_lb2k (Kuiken С. and Simmonds P., 2009. Nomenclature and Numbering of the Hepatitis С virus. Chapter 4. Hepatitis C: Methods and Protocols, Second Edition, vol. 510, ed. Hengli Tang).

6. 193 нуклеотидные последовательности депонированы в международный компьютерный банк данных GenBank: 48 фрагментов размером около 550 н. о. из core области генома (JF701908.1-JF701913.1), 130 фрагментов из NS5B области размером 253 н. о. и четыре фрагмента размером 1776 н. о. (HQ641453.1-HQ641455.6), три фрагмента размером 1210 н. о. из E2/NS3 области генома, два фрагмента размером 3620 н. о. (AY070214.1) и 3650 н. о. (AY70215.1) из core/NS3 области, две открытые рамки считывания рекомбинантного генома (AY587845.1 - 9357 н. о.) и «родительского» генома субтипа lb (AY587844.1 -9365 н. о.).

Личное участие автора в получении результатов

Основные результаты получены лично автором. Выделение изолятов ВГС из образцов сыворотки крови пациентов с диагнозом ГС, молекулярно-генетические исследования, компьютерный и статистический анализ проведены автором в Шведском институте по контролю за инфекционными заболеваниями (Стокгольм) при участии проф. L. О. Magnius, Н. Norder, Т. Tallo, С. Jern в рамках совместного научно-исследовательского проекта и в лаборатории молекулярной микробиологии ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера.

Серологические и молекулярно-генетические исследования образцов плазмы крови доноров Королевства Камбоджа, компьютерный и статистический анализ проведены в Парижском Институте Пастера при участии проф. A. Budkowska, Р. Maillard, а также при участии V. Horm и Е. Nerrienet (Институт Пастера, Королевство Камбоджа), A. Kakkanas (Институт Пастера, Греция) в рамках Трансверсального проекта Сети Институтов Пастера (руководитель проекта проф. P. Mavromara, Институт Пастера, Греция), персональных грантов автора от Мэрии Парижа и Национального Исследовательского Агенства по изучению ВИЧ и вирусных гепатитов (ANRS, Франция) и в лаборатории молекулярной микробиологии ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера.

Изучение структуры генотипов ВГС в Санкт-Петербурге в 1999-2003 гг. было проведено совместно с проф. С.Л. Мукомоловым (зав. лаб. вирусных гепатитов ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера). Изучение структуры генотипов ВГС в Москве и молекулярно-генетические исследования, посвященные изучению влияния рекомбинанта RF12k/lb на эффективность противовирусной терапии, выполнены при участии д.м.н. О.О. Знойко (МГМСУ им. А.И. Евдокимова, Москва) и к.х.н. М.Г. Исагулянц (ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России).

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 228 страницах машинописного текста и состоит из введения, 7 глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, 4 главы результатов собственных исследований, обсуждение результатов), выводов и приложения. Иллюстративный материал включает 10 таблиц и 43 рисунка. Список литературы содержит 502 наименования, из них 24 отечественных и 478 иностранных источника.

Похожие диссертации на Молекулярно-генетические механизмы эволюции вируса гепатита C

Конструирование вирусоподобных частиц на основе корового белка вируса гепатита B и M2 белка вируса гриппа как основы новых противогриппозных вакцинБлохина, Елена Александровна

Оценка влияния массовой вакцинации против гепатита В на генетическое разнообразие вируса гепатита В, заболеваемость и неблагоприятные исходы инфекции.Клушкина, Виталина Владимировна

Скрытая инфекция, вызванная вирусом гепатита В: эпидемиологическая, вирусологическая и клинико-морфологическая характеристикаГордейчук, Илья Владимирович

Разработка системы испытаний наборов реагентов на основе ПЦР для выявления ДНК/РНК вирусов гепатитов B и CЭльберт, Елизавета Викторовна

Особенности вируса гепатита C в острой и хронической стадиях инфекции и дифференциация стадийАстраханцева, Ирина Владимировна

Специфические особенности инициации трансляции на РНК вируса гепатита СБочкаева (Адьянова) Занда Владимировна

Вирус гепатита A: генетические особенности изолятов, выявленных в Сибирском регионе, и штаммов, адаптированных к культурам клетокБондаренко, Татьяна Юрьевна

Синтез в растениях поверхностного антигена вируса гепатита B: повышение биологической безопасности трансгенных растенийПучко, Елена Николаевна

Влияние белков вируса гепатита C на регуляцию окислительного стресса и метаболизм биогенных полиаминовСмирнова, Ольга Александровна

Исследование роли гликозилирования белков оболочки вируса гепатита С в вирусном морфогенезе с использованием бакуловирусной системы экспрессии в клетках эукариотОрлова Ольга Владимировна