Введение к работе
Актуальность проблемы. Вирус гепатита С (ВГС) вызывает одно из наиболее распространенных и опасных заболеваний человека. По данным ВОЗ этим вирусом инфицировано около 170 млн человек. Геном ВГС представляет собой (+)-цепь РНК, содержащую одну рамку считывания, кодирующую единственный полипротеин. В результате его процессинга образуется четыре структурных (белок капсида (C), гликопротеины Е1 и Е2, белок р7) и шесть неструктурных белков (протеиназы NS2 и NS3, РНК-зависимая РНК-полимераза NS5B, регуляторные белки NS4A, NS4B и NS5A). У 80% инфицированных ВГС заболевание переходит в хроническую форму и характеризуется высоким риском развития тяжелых патологий печени, таких как цирроз, фиброз и гепатоклеточная карцинома, а также способствует развитию у больных заболеваний крови (криоглобулинемия и неходжскинская лимфома), почек (глорумелонефрит) и иммунной системы (диабет). В настоящее время терапия хронического гепатита С основана на применении интерферона альфа комбинации с рибавирином, однако данный вид лечения малоэффективен - не более 40% инфицированных ВГС отвечает на терапию. В 2011 г в клиническую практику было введено два ингибитора протеиназы, применение которых в сочетании с интерфероном и рибавиринов позволило повысить эффективность терапии. К настоящему моменту несколько ингибиторов РНК-зависимой РНК-полимеразы и протеиназы NS3 вируса находятся на последних стадиях клинических испытаний. Стоит подчеркнуть, что все эти лекарственные препараты направлены на борьбу непосредственно с вирусом гепатита С, но не на терапию тяжелых патологий, характерных для хронического гепатита С.
В настоящее время одной из возможных причин развития тяжелых сопутствующих заболеваний, характерных для хронического гепатита С, считается окислительный стресс (ОС). Известно, что ВГС вызывает ОС в инфицированной клетке, что может являться причиной трансформации гепатоцитов. Точный механизм возникновения окислительного стресса при инфекции ВГС до сих пор не выяснен, вклад в этот процесс индивидуальных вирусных белков также не изучен. Несмотря на то, что за последние годы появилось много данных, свидетельствующих о связи ряда вирусных заболеваний с ОС, влияние соответствующих вирусов на систему защиты от стресса до сих пор мало изучено. В связи с этим изучение влияния ВГС и его белков на систему защиты клетки от окислительного стресса, а также более детальное изучение механизмов возникновения последнего и ответа на него представляет собой актуальную задачу.
Биогенные полиамины спермин (Spm), спермидин (Spd) и их предшественник путресцин (Put) присутствуют в клетках в миллимолярных и субмиллимолярных концентрациях и выполняют различные функции, в том числе участвуют в защите клетки от окислительного стресса. Однако о влиянии последнего на метаболизм полиаминов известно мало, а взаимосвязь между инфекцией ВГС и метаболизмом биогенных полиаминов, а также активностями ферментов-регуляторов этого метаболизма ранее вообще не рассматривалась. Соответственно, исследование этих вопросов также представляется весьма актуальным.
Цели и задачи исследования.
Целью работы являлось изучение влияния белков вируса гепатита С на регуляцию окислительного стресса и метаболизм биогенных полиаминов. Для достижения данной цели в работе были сформулированы следующие задачи:
-
Оценить вклад индивидуальных белков ВГС в индукцию окислительного стресса и изучить механизмы возникновения последнего при экспрессии белков, влияющих на эту индукцию в наибольшей степени.
-
Выявить белки ВГС, активирующие систему защиты клетки от окислительного стресса, и рассмотреть детальные механизмы активации этой системы при экспрессии данных белков.
-
Изучить влияние экспрессии белков ВГС на метаболизм биогенных полиаминов.
-
Оценить возможность применения регуляторов метаболизма полиаминов для подавления репликации РНК ВГС в клеточных системах.
Научная новизна и практическое значение работы.
В работе показано, что белки NS5A, NS4B, E1, E2, а также белок капсида ВГС вызывают окислительный стресс в клетках гепатомы человека Huh7, и последний является наиболее активным индуктором стресса. Впервые продемонстрировано, что N-концевой домен белка капсида активирует экспрессию NADPH-оксидаз, что приводит к усилению продукции супероксид-радикала, тогда как его C-концевой домен 37-191 вызывает активацию экспрессии цитохрома Р450 2Е1 (CYP 2E1) и оксидоредуктина эндоплазматического ретикулума (Ero1) – источников супероксид-радикала и пероксида водорода, соответственно.
Установлено, что белки, E1, E2, NS4B, NS5A и белок капсида активируют систему защиты клетки (Nrf2/ARE каскад) от активных форм кислорода (АФК) по нескольким независимым механизмам. Все эти белки вызывают усиленную экспрессию «ферментов II фазы защиты» путем фосфорилирования фактора транскрипции Nrf2 протеинкиназой С (PKC) по АФК-зависимому механизму. Белок капсида и белок NS5A способны также активировать фактор Nrf2 по механизму, не зависящему от концентрации АФК, при участии фосфоинозитид-3-киназы (PI3K) и казеинкиназы 2 (CK2). Наиболее активным регулятором Nrf2/ARE каскада также является белок капсида, N-концевой домен которого отвечает за индукцию АФК-независимого, а С-концевой – АФК-зависимого механизмов активации системы защиты клетки от окислительного стресса.
Продемонстрировано, что в клетках гепатомы человека Huh7 окислительный стресс, вызванный химическими агентами, приводит к повышению уровней биогенных полиаминов Spm и Spd вследствие усиления экспрессии орнитиндекарбоксилазы (ODC) и спермидин/спермин-N1-ацетилтрансферазы (SSAT), опосредованного факторами транскрипции Nrf2 и NF-kB. ОС, вызванный белком NS5A и белком капсида вируса гепатита С, также вызывает активацию транскрипции генов ODC и SSAT, что, однако, сопровождается снижением активности кодируемых ими ферментов и падением уровня полиаминов.
Впервые показано, что клетки Huh7, несущие полноразмерный репликон ВГС, обладают пониженным уровнем биогенных полиаминов и активностей ферментов их метаболизма, а повышение концентрации спермина и спермидина при помощи низкомолекулярных соединений приводит к ингибированию репликации ВГС и снижению уровня геномной РНК вируса.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 16th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses (Nice, France. October 2009), 17th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses (Pacifico Yokohama, Japan, September 2010), VIII Annual Conference of New Visby Network on Hepatitis C (Vilnius, Lithuania, February 2011), Polyamine Gordon Research Conference (Waterville Valley, New Hampshire, USA, June 2011), 18th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses (Seattle, Washington, USA, September 2011), IX Annual Conference of New Visby Network on Hepatitis C (St. Petersburg, Russia, April 2012).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 5 статей в научных журналах и 5 тезисов докладов в материалах конференций.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на _____ страницах, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего _____источников. Материал иллюстрирован _____рисунками и _____таблицами.
