Содержание к диссертации
Список сокращений 2
ВВЕДЕНИЕ 7
ГЛАВА1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
1.1. В-клеточный хронический лимфолейкоз. Факторы прогноза..
Доброкачественная форма ХЛЛ 13
Пол и возраст 15
Время удвоения лимфоцитов 15
Морфология клеток 17
1.1.5 Тип инфильтрации костного мозга 17
Иммунологические факторы прогноза 19
|32-микроглобулин 20
Цитокины 21
Цитогенетические и молекулярно-биологические 22 маркеры, как факторы прогноза
1.2. Мутационный статус генов вариабельного региона 24
иммуноглобулинов
Организация и перестройка генов вариабельного региона 24 иммуноглобулинов. Формирование В-клеточного репертуара...
Соматическая гипермутация 30
Изучение V-генов при лимфатических опухолях 33
1.3. Изучение профиля экспрессии генов при В-клеточном 37
хроническом лимфолейкозе
1.3.1. Исследования экспрессионного профиля с помощью 37
микрочипов
1.3.2. ПЦР в реальном времени 39
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 44
2.1. Пациенты 44
Выделение, селекция и активация клеток 44
Выделение РНК и обратная транскрипция 45
ПЦР в реальном времени 45
Анализ генов IgVH 47
Статистический анализ 49
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ 50
Характеристика пациентов 50
Выбор контрольного гена 52
Экспрессия LPL, DMD, ZAP70 и ZBTB20 в неселектирован- 53 ных МПК В-ХЛЛ, С019-селектированных клетках В-ХЛЛ и нормальных субпопуляциях клеток крови
Корреляция уровней экспрессии генов LPL, DMD, ZAP70 и 55 ZBTB20 с мутационным статусом IgVH
Корреляция уровня экспрессии LPL и DMD с выживаемостью 57 и другими прогностическими факторами
Экспрессия SEPT 10, ADAM29, SLAM, LPL в неселекти- 59 рованных МПК В-ХЛЛ и корреляция ее с мутационным статусом генов вариабельного региона иммуноглобулинов
Экспрессия LPL, ZAP70 и IL-lb в CD3+, CD38+ и CD38- 61 клетках
3.8. Связь экспрессии LPL и факторов транскрипции 62
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ 64
Мутационный статус генов IgVH и другие факторы прогноза 64 В-ХЛЛ
Сравнение прогностической значимости мутационного 67 статуса генов IgVH и экспрессионного профиля исследованных генов
Липопротеинлипаза. Ее функции и причины экспрессии в 69
норме и в клетках В-ХЛЛ :
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 75
ВЫВОДЫ , 76
БЛАГОДАРНОСТИ 77
Список публикаций по теме диссертации 77
Список литературы 78
Введение к работе
Одной из наиболее распространенных лимфатических опухолей является В-клеточный хронический лимфолейкоз (В-ХЛЛ). Существуют разные формы этого заболевания, различающиеся по клинической картине. В одних случаях болезнь быстро прогрессирует, а в других — годами не требует лечения. Общая выживаемость варьирует от нескольких месяцев до 20 лет и более.
В прогнозировании течения В-ХЛЛ могут иметь значение клинические, морфологические, цитогенетические, молекулярные и серологические параметры. Основным критерием, позволяющим прогнозировать течение В-ХЛЛ, является мутационный статус перестроенного гена иммуноглобулина в опухолевом клоне. Наличие мутаций (или, иными словами, высокая степень дифференцировки В-клетки) коррелирует с благоприятным прогнозом, отсутствие мутаций - с неблагоприятным. Однако, определение мутационного статуса трудо- и ресурсоемко и, по-видимому, не может быть использовано в качестве рутинного анализа. В то же время высокая распространенность В-ХЛЛ, а также появление новых возможностей лечения, требует ранней оценки прогноза заболевания с тем, чтобы как можно раньше начать лечение, адаптированное к риску прогрессии заболевания у каждого конкретного больного.
Альтернативным способом оценки прогноза В-ХЛЛ может быть анализ уровня мРНК генов, экспрессирующихся по-разному при вариантах В-ХЛЛ с различным мутационным статусом. В последние годы в экспериментах с микрочипами было найдено несколько десятков генов, экспрессия которых существенно различается у больных различными типами В-клеточного хронического лимфолейкоза. Различия в экспрессии некоторых из этих генов (LPL, ZBTB20, ZAP-70 и др.) по результатам экспериментов с микрочипами довольно велики и относительно постоянны. Мы предположили, что эти гены могут использоваться в качестве альтернативных маркеров,
заменяющих мутационный статус. Сам по себе экспрессионный анализ с помощью микрочипов вполне решает проблему прогнозирования течения В-ХЛЛ. Однако этот анализ еще более трудоемок, дорог и не всегда надежен.
В то же время, мы считаем, что выборочная оценка уровня экспрессии наиболее значимых генов методом ПЦР в реальном времени при адекватных контролях представляет собой разумную альтернативу этому важному методу и может стать мощным оружием диагноза и прогноза. Кроме того, детальный анализ этих генов может открыть неизвестные пока аспекты патогенеза В-ХЛЛ.
В данной работе нами изучен характер экспрессии генов LPL, ZAP-70, ZBTB20, DMD, SEPT 10, SLAM, ADAM29 методом ПЦР в реальном времени у больных различными типами В-ХЛЛ и здоровых доноров в различных субпопуляциях клеток крови. Выявлена достоверная корреляция уровня экспрессии генов LPL, DMD, SEPT 10, SLAM, ADAM29 с мутационным статусом генов вариабельного региона иммуноглобулинов. В исследовании продемонстрировано, что оценка уровня экспресии LPL методом ПЦР в реальном времени может быть новым надежным прогностическим маркером при В-ХЛЛ.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ
Выяснить прогностическое значение уровня экспрессии, определенного с помощью ПЦР в реальном времени, генов, экспрессия которых различается при разных вариантах В-клеточного хронического лимфолейкоза.
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Определение мутационного статуса генов вариабельного региона иммуноглобулинов на ретроспективной выборке больных.
Определение уровня экспрессии генов LPL, ZAP-70, ZBTB20, DMD, SEPT 10, SLAM, ADAM29 методом ПЦР-РВ у данной выборки больных, в разных субпопуляциях клеток крови больных и доноров.
Оценка корреляции уровня экспрессии вышеуказанных генов и мутационного статуса генов вариабельного региона иммуноглобулинов, а также других прогностических признаков В-ХЛЛ.
Определение прогностической значимости уровня экспрессии генов LPL, ZAP-70, ZBTB20, DMD, SEPT 10, SLAM, ADAM29 при В-ХЛЛ.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ
Проведено определение уровня экспрессии генов LPL, ZAP-70, ZBTB20, DMD, SEPT 10, SLAM, ADAM29 на большой коллекции образцов мононуклеаров периферической крови больных В-ХЛЛ и в отдельных субпопуляциях клеток крови. Проведен статистический анализ корреляции уровня экспрессии исследуемых генов с клиническими данными больных В-ХЛЛ. Установлена значительная корреляция относительной экспрессии генов LPL, DMD, SEPT 10, SLAM, ADAM29 с мутационным статусом генов вариабельного региона иммуноглобулинов. Показано, что увеличение уровня экспрессии LPL не связано со статусом активации клеток и не зависит от уровня экспрессии известных транскрипционных факторов. Предложен новый маркер прогноза при В-клеточном хроническом лимфолейкозе.
ЗНАЧЕНИЕ ДЛЯ ТЕОРИИ И ПРАКТИКИ
Измерение уровня экспрессии LPL методом ПНР в реальном времени может предсказать прогноз на ранних стадиях В-ХЛЛ, что даст возможность своевременно назначить лечение, адаптированное к риску прогрессии заболевания, у каждого конкретного больного. Кроме того, детальный анализ генов, экспрессия которых коррелирует с мутационным статусом генов
вариабельного региона иммуноглобулинов, может открыть неизвестные пока аспекты патогенеза В-ХЛЛ.
ПУБЛИКАЦИИ
По материалам диссертации опубликованы 7 работ, в т.ч. 2 работы в изданиях, рекомендованных ВАК. Материалы диссертации доложены на III международной конференции, посвященной лечению лимфатических заболеваний (Палермо, 2006г.), на VI съезде гематологов и трансфузиологов республики Беларусь (Минск, 2007г.), на XII международном симпозиуме по ХЛЛ (Лондон, 2007), на XI Российском онкологическом конгрессе в рамках VI конкурса молодых ученых по онкологии (Москва, 2007).
СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ
Диссертация изложена на 90 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 12 рисунков и 6 таблиц. Список цитированной литературы включает 108 наименований.
ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ
Липопротеинлипаза - эффективный маркер течения болезни при В-клеточном хроническом лимфолейкозе. Измерение уровня экспрессии LPL методом ПЦР в реальном времени предсказывает прогноз на ранних стадиях В-ХЛЛ, и может быть использовано при выборе терапии, адаптированной к риску.
