Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы
1.1 Фенотипические проявления старения 12-17
1.2 Причины и механизмы старения: основные гипотезы 18—27
1.3 Метаболические основы возрастных изменений липидного спектра крови и старение 27-34
1.4 Дислипидемии: ассоциации с сердечно-сосудистыми заболеваниями и смертностью в пожилом и старческом возрасте 34-40
1.5 Молекулярно-генетические основы старения 41-44
Глава 2 Материалы и методы исследования
2.1 Материалы исследования 45-46
2.2 Методы исследования
2.2.1 Методы определения концентраций липидов в сыворотке крови 47-48
2.2.2 Фенотипирование дислипидемии 49
2.2.3 Выделение ДНК из венозной крови человека 50
2.24 Амплификация полиморфных ДНК-локусов 50-53
2.2.5 Электрофорез амплифицированных фрагментов ДНК... 54-55
2.3 Статистическая обработка результатов исследования 56
Глава 3 Результаты исследования
3.1 Анализ липидного спектра сыворотки крови в разных возрастных группах 57-74
3.2 Полиморфизм в экзоне 4 гена АРОЕ в популяции татар: ассоциации с возрастом и концентрацией липидов 74-84
3.3 Полиморфизм Q192R гепа. PON1 в популяции татар: ассоциации с возрастом и концентрацией липидов 85-94
3.4 Полиморфизм 1405Vгена СЕТР в популяции татар: ассоциации с возрастом и концентрацией липидов 94-103
Глава 4 Обсуждение результатов исследования 104-130
Выводы 131
Практические рекомендации 132
Библиографический список цитированной литературы
- Фенотипические проявления старения
- Метаболические основы возрастных изменений липидного спектра крови и старение
- Методы определения концентраций липидов в сыворотке крови
- Анализ липидного спектра сыворотки крови в разных возрастных группах
Введение к работе
Актуальность исследования
К концу 20 века наметилась тенденция к увеличению доли людей пожилого и старческого возраста среди населения экономически развитых и развивающихся стран. По прогнозам ООН, к 2025 году число людей старше 60 лет достигнет 1.2 млрд. человек (15% всего населения планеты), при этом ожидается увеличение численности людей в возрасте старше 80 лет. Доля людей старшего поколения (пожилого и старческого возраста) в структуре населения России составляет в среднем более 20 % (в 36 регионах достигла 27 %), и, как ожидается, к 2015 году каждый третий из них будет относиться к возрастной группе 75 лет и старше [16, 51]. Процесс демографического старения необратим, носит глобальный характер, и в первой половине XXI века его темпы увеличатся.
Всемирная ассамблея ООН в 2002 году приняла программу по исследованию старения в XXI веке. Медико-биологические исследования с участием пожилых, старых людей и долгожителей признаны необходимыми для выявления факторов, маркеров риска и подходов к адекватной терапии возраст-ассоциированных заболеваний, разработки стратегии увеличения продолжительности жизни и улучшения ее качества в пожилом и старческом возрасте, поиска предикторов потенциального возраста дожития, а также для развития фундаментальных представлений о самом феномене старения.
Одной из актуальных задач является исследование особенностей липидного спектра крови в старших возрастных группах населения. Липиды (в частности, холестерин, триглицериды, жирные кислоты) играют значительную роль в пластическом и энергетическом метаболизме, они необходимы для построения мембран клеток, синтеза гормонов и других биологически активных соединений. В гипотезах о механизмах старения липидам уделяют существенное внимание [56]. С нарушениями липидного гомеостаза сопряжены атерогенез и высокий риск развития сердечно-сосудистых и нейродегенеративных заболеваний. По мере увеличения возраста риск развития этих заболеваний нарастает.
Пожилой возраст в целом характеризуется полиморбидностью; наиболее серьезными проблемами этой возрастной группы являются артериальная гипертен-зия, ишемическая болезнь сердца, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона.
Результаты целого ряда исследований свидетельствуют в пользу того, что в наследственную предрасположенность к развитию дислипидемий, заболеваний сердечно-сосудистой и нервной систем вносит вклад полиморфизм генов, кодирующих белки, участвующие в метаболизме липидов [84, 95, 96, 255]. Однако подавляющее большинство таких работ было проведено на лицах зрелого возраста, и лишь немногие - в старших возрастных группах, в том числе у стариков и долгожителей [76, 238, 275, 282, 310]. Возрастные ассоциации аллель-ных вариантов генов-кандидатов дислипидемий, старения и "заболеваний старшего возраста" практически не исследованы, и сведения о полиморфизме этих генов в популяциях разных народов мира ограничены. Вместе с тем современный подход к проблеме управления здоровьем и долголетием и профилактике заболеваний в пожилом и старческом возрасте предполагает обязательный учет особенностей конкретных популяций (климато-географические особенности региона проживания, этнические, культурные и популяционно-генетические характеристики населения). При исследовании отдельных выборок населения Республики Башкортостан ранее было показано, что маркерами риска сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), в числе прочих, являются ал-лельные варианты генов аполипопротеина Е, параоксоназы 1, белка-переносчика эфиров холестерина [38]. Вместе с тем комплексных исследований, посвященных анализу липидного спектра сыворотки крови и полиморфизма генов-кандидатов старения и возраст-ассоциированных заболеваний в пожилом и старческом возрасте у населения Республики Башкортостан, до сих пор не проводилось, что и определило цель настоящей работы.
Цель исследования: выявление особенностей липидного спектра крови и распределения частот генотипов и аллелей полиморфных локусов генов-кандидатов дислипидемий у людей пожилого и старческого возраста.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
Сбор и анализ демографических и медико-анамнестических сведений у лиц, включенных в исследование; формирование коллекции образцов ДНК и сыворотки крови лиц разного возраста, включая пожилых и стариков.
Анализ возраст-ассоциированной динамики параметров липидного спектра крови - сывороточной концентрации триглицеридов, общего холестерина, холестерина липопротеинов низкой и высокой плотности, величины прогностического коэффициента атерогенности (КА), частоты и фенотипа дислипидемии (ДЛП).
Анализ возрастных ассоциаций частот аллелей и генотипов по полиморфным маркерам генов аполипопротеина Е (АРОЕ), параоксоназы 1 (PON1) и белка-переносчика эфиров холестерина (СЕТР).
Анализ ассоциаций аллельных вариантов генов АРОЕ, PON1, СЕТР с параметрами липидного спектра сыворотки крови.
Разработка рекомендаций для организации гериатрической помощи на основании полученных данных.
Научная новизна исследования
Впервые проведено комплексное исследование липидного спектра сыворотки крови и полиморфизма генов-кандидатов дислипидемии в обширной этнически однородной группе жителей Республики Башкортостан в широком возрастном диапазоне (от 14 до 98 лет). Показано, что возрастная динамика сывороточной концентрации липидов, наряду с возрастанием концентрации ОХС, ХС ЛПНП и ТГ, характеризуется относительной стабильностью уровня ХС ЛПВП; в старческом возрасте и у долгожителей наблюдается существенное снижение содержания ТГ, ОХС и ХС ЛПНП. Начиная с пожилого возраста, наблюдается существенное возрастание частоты ДЛП, главным образом, гипер-холестеринемии.
Получены статистические оценки частот генотипов и аллелей по полиморфизму генов-кандидатов дислипидемии и ССЗ АРОЕ, PON1, СЕТР в разных
возрастных группах, включая пожилых, стариков и долгожителей. Обнаружено, что полиморфизм этих генов вносит вклад в вариабельность концентраций липидов в сыворотке крови. В старческом возрасте повышены частоты аллеля АРОЕ*3 и генотипа АРОЕ*3/*3, понижены частоты аллеля PONl*R и генотипа PON1 *R/*R Среди женщин-долгожительниц повышена доля носителей аллеля CETP*V.
Практическая значимость работы обусловлена гериатрическими аспектами исследования факторов риска нарушений липидного гомеостаза. Полученные в настоящем исследовании данные могут быть использованы как исходные для формирования региональных референтных показателей липидного спектра сыворотки крови в пожилом и старческом возрасте. Возможно использование полученных результатов для прогнозирования течения и исхода заболеваний, в частности, ССЗ, в старших возрастных группах, планирования и организации адекватных лечебных и профилактических мероприятий и поддержания успешного долголетия.
Основные положения, выносимые на защиту:
Возрастная динамика сывороточной концентрации липидов характеризуется увеличением концентрации ОХС, ХС ЛПНП, ТГ и относительной стабильностью уровня ХС ЛПВП. В старческом возрасте и у долгожителей наблюдается существенное снижение содержания ТГ, ОХС и его фракций. В пожилом и старческом возрасте повышается частота ДЛП, главным образом за счет увеличения доли лиц с гиперхолестеринемией.
В вариабельность концентраций липидов в сыворотке крови вносит вклад полиморфизм генов АРОЕ, PON1, СЕТР.
В старческом возрасте наблюдаются изменения в распределении частот генотипов и аллелей: повышаются частоты аллеля АРОЕ*Ъ и генотипа АРОЕ*3/*3, понижаются частоты аллеля PONl*R и генотипа PONl*BJ*R. Среди женщин-долгожительниц возрастает доля носителей аллеля CETP*V.
Внедрение результатов исследования
Индивидуальные показатели липидного спектра сыворотки крови используются для планирования и мониторинга лекарственной терапии медицинскими учреждениями по месту жительства лиц — участников проведенного исследования. Данные, полученные в ходе исследования, применяются в учебном процессе кафедр лабораторной диагностики ИПО, биологии, биологической и биоорганической химии ГОУ ВПО "Башкирский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития РФ".
Апробация работы
Основные результаты диссертационного исследования были представлены на V съезде Российского общества медицинских генетиков (Уфа, 2005), Российской научной конференции с международным участием "Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии" (Курск, 2006), VI European congress "Healthy and active ageing for all Europeans" (Saint-Petersburg, 2007), школе-семинаре молодых ученых УНЦ РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии "Биомика - наука XXI века" (Уфа, 2007), III научно-практической геронтологической конференции с международным участием, посвященной памяти Э.С. Пушковой (Санкт-Петербург, 2007), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), совместном научном заседании кафедр лабораторной диагностики ИПО, биохимии, и Отдела геномики Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН (Уфа, 2009).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 2 - в журналах, рецензируемых ВАК.
Объем и структура диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, глав результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и приложения. Список литературы включает 69 отечественных и 270 иностранных источников. Работа изложена на 168 страницах компьютерного текста, иллюстрирована таблицами и рисунками.
Фенотипические проявления старения
Старение человека характеризуют как сложный биологический непрерывный и необратимый процесс, который с неизбежностью приводит к состоянию старости и затем к смерти. Старение протекает гетерохронно и сопровождается развертыванием компенсаторно-старческих процессов, т.е. витаукта (от лат. vita - жизнь, anctum - увеличивать). От темпов и интенсивности процессов старения зависит характер и время наступления состояния старости. Фенотипические признаки старения проявляются как отражение возрастных комплексных многообразных изменений структурно-функциональной организации всех систем организма [31, 64].
К важнейшим признакам наступления старости относят снижение способности адаптироваться к действию разнообразных факторов среды (температурных, пищевых, эмоциональных, социальных и др.), снижение репродуктивной функции. В старческом возрасте в тканях снижается уровень метаболической активности. У людей, достигших старческого возраста, грубые нарушения обмена веществ отмечаются в 70% случаев. Замедляется деление клеток, снижается способность тканей к регенерации. В большинстве тканей развиваются процессы атрофии клеток, происходит жировое перерождение клеток или замещение клеток тканей клетками соединительной ткани, в клетках накапливаются инертные потенциально опасные вещества. В частности, в центральной нервной системе формируются белковые (бета-амилоидные) скопления, в сердечной мышце накапливается липофусцин, в кровеносных сосудах возрастает количество атеросклеротических бляшек [112, 145, 213].
Более чем у 90% лиц в старческом возрасте происходит, снижение функциональных возможностей головного мозга (нарушения памяти, мышления, депрессии, нарушения структуры сна). Вследствие происходящих при старении изменений в центральной нервной системе снижаются эффективность всей системы терморегуляции, функциональные свойства сенсорных систем. Ослабевают зрение (снижается упругость и прозрачность хрусталика, диапазон аккомодации, световая, цветовая и контрастная чувствительности), слух (старческая тугоухость), восприятие запахов, болевая, температурная, тактильная, вибрационная и соматическая чувствительности, уменьшается число вкусовых луковиц, затрудняется понимание речи [41].
В старости наблюдается уменьшение числа эластических волокон легочной ткани, снижение растяжимости и упругости легких, морфологическое преобразование легочной ткани (увеличение размера альвеол, уменьшение количества легочных капилляров и эластических волокон и др.), возрастание сопротивления дыхательных путей потоку воздуха, что приводит к ограничению функции легких [14].
В сердце происходит частичное замещение мышечных волокон соединительной тканью, в результате чего масса мышечных волокон уменьшается. С возрастом утолщается эндокард. Наблюдаются изменения проводящей системы сердца, что приводит к функциональным нарушениям сердечных сокращений. Нарушения сердечного ритма, заметные по ЭКГ, отмечаются более чем у 50 % пожилых людей и стариков. Стареющие артерии становятся менее упругими в связи с тем, что в них эластические волокна и гладкая мускулатура постепенно замещаются коллагеном [65].
В старческом возрасте кожные покровы становятся дряблыми, сухими, морщинистыми, в них появляются клоны мутантных клеток в виде пигментных пятен и формируется неоднородная пигментация кожи, происходят облитерация артериол и дилатация вен, что ухудшает их кровоснабжение. Также изменяется структура волос и наблюдается их депигментация [6].
По мере старения уменьшается минерализация костной ткани, что приводит к истончению костей скелета, развитию сенильного остеопороза. Вследствие уплотнения хрящевой ткани межпозвоночных дисков длина тела становится короче. Искривление позвоночника приводит к кифозу. В глубокой старости происходит деформация суставов и, как следствие, искривление нижних конечностей. У людей, достигших 70-летнего возраста, в 85% развиваются заболевания опорно-двигательного аппарата [40]. Изменения в костной ткани в совокупности с нарушениями нервной регуляции приводят к нарушению координации движений (шаткая и неуверенная походка) и к тремору (дрожанию головы и кистей рук). Особенно выражены такие признаки при развитии в старческом возрасте болезни Паркинсона [10].
Возрастные изменения затрагивают систему образования форменных элементов крови. К 40-60 годам снижается общий объем активного костного мозга вследствие замещения костного мозга жировой и соединительной тканями. В результате в старческом возрасте существенно (почти в два раза) уменьшается число активных клеток костного мозга. Наблюдается ослабление эри-тропоэза, которое проявляется снижением количества ретикулоцитов и эритроцитов в периферической крови, причем в эритроцитах падает содержание гемоглобина и АТФ. Развивается дефицит кобаламина, фолиевой кислоты и железа, которые являются важными факторами кроветворения. Содержание гло-булиновой фракции белков в крови повышается, а альбуминовой понижается. Увеличивается скорость оседания эритроцитов (СОЭ). Возрастает содержание фибриногена, фактора VIII и в целом активность свертывающей системы крови [17,61].
При старении развиваются существенные изменения в иммунной системе. В значительной степени страдает клеточный иммунитет, а гуморальный иммунитет изменяется мало. Т-клетки представляют собой наиболее чувствительный к старению компонент иммунной системы, а В-клетки функционируют относительно нормально. Ослабление функции Т-клеток с возрастом происходит параллельно инволюции вилочковой железы (тимуса). Также наблюдается повышение активности естественных киллеров, понижается содержание иммуноглобулинов классов А и G. В целом же происходит ослабление системы иммунного надзора, что приводит к увеличению концентраций циркулирующих в крови аутоантител и комплексов "антиген-антитело".
Метаболические основы возрастных изменений липидного спектра крови и старение
Метаболизм и транспорт липидов в сосудистом русле тесным образом связан с распределением энергетических и пластических субстратов в организме, с метаболическими процессами в жировой ткани, печени, кишечнике, клетках иммунной системы (макрофагах). Метаболические пути ХС, ТГ, свободных жирных кислот (ЖК) входят в сложную сеть метаболизма энергетических субстратов, которая объединяет липидный и углеводный обмен [29].
В форме ТГ транспортируются и запасаются вещества, которые являются источником энергии в организме - глицерол и ЖК. Известно, что значительная часть глюкозы, поступившая в печень, расходуется на синтез насыщенных ЖК и глицерола. Из эндогенных насыщенных ЖК (олеиновая и стеариновая кислоты) и глицерола синтезируются ТГ, которые в цитоплазме гепатоцитов связываются с аполипопротеином В-100. Образовавшиеся липопротеиновые частицы (ЛПОНП) секретируются в кровь. ТГ в составе ЛПОНП гидролизуются липо-протеинлипазой и печеночной липазой, что приводит к высвобождению в кровь свободных ЖК. В комплексе с альбуминами ЖК транспортируются к клеткам тканей и метаболизируются в митохондриях. В жировой ткани глюкоза полностью расходуется для синтеза ТГ как запасного энергетического субстрата. Экзогенные насыщенные ЖК поступают в организм с пищей. Часть таких ЖК (короткоцепочечные, Ce-u) поступает в печень, где из них синтезируются эндогенные олеиновая и стеариновая кислоты. С участием экзогенных олеиновой и стеариновой кислот в цитоплазме энтероцитов образуются ТГ, которые в агрегации с аполипопротеином В-48 в составе хиломикронов (ХМ) транспортируются в лимфу, а затем в кровь. В кровотоке ТГ гидролизуются и ЖК высвобождаются в пул свободных ЖК. При неполном гидролизе ТГ остаточные (рем-нантные) частицы поступают в печень через рецептор-опосредованный транспорт. Таким образом, ТГ в составе липопротеидных частиц (ЛПОНП и ХМ) транспортируются из печени, тонкого кишечника и жировой ткани в кровь, где из них образуется пул свободных ЖК (в основном пальмитиновой, олеиновой, стеариновой, линолевой, арахидоновой ЖК).
Существует сложная система регуляции пула свободных ЖК в крови, в которой принимают участие инсулин, лептин, гормон роста, ферменты и рецепторы жировой ткани. Важное физиологическое значение имеет соотношение пальмитиновой и олеиновой кислот в общем пуле ЖК кровотока. Источником олеиновой ЖК в крови является жировая ткань. Комплекс пальмитиновой кислоты с альбумином индуцирует секрецию инсулина бета-клетками поджелудочной железы, комплекс олеиновой кислоты с альбумином индуцирует секрецию ТГ гепатоцитами. Эти ЖК выступают также как антагонисты при индукции апоптоза. Олеиновая кислота нейтрализует апоптический эффект пальмитиновой кислоты на клетки [167, 206]. Высвобождение ЖК из жировой ткани регулируется инсулином, гормоном роста. Инсулин ингибирует липазу жировой ткани (гормон-чувствительную липазу — ГЧЛ), что приводит к усилению липогенеза. Гормон роста, напротив, активирует ГЧЛ и гидролиз ТГ в жировом депо. Лептин (гормон жировой ткани) регулирует уровень бета-окисления ЖК в клетках. Этот гормон активирует пальмитоил-карнитин-ацил-трансферазу-1, который связывает пальмитиновую кислоту с карнитином, что способствует переносу ЖК через мембрану митохондрий. Секреция лептина изменяется в связи с уровнем инсулина и глюкозы в крови. Она возрастает в ответ на увеличение притока глюкозы в жировую ткань [206, 242, 323]. При старении организма первично развивается резистентность к лептину. Клетки теряют способность утилизировать ЖК в прежних количествах, возрастает пул свободных ЖК в крови. В жировой ткани постепенно накапливаются ТГ, что приводит к развитию резистентности к инсулину [56, 75].
Роль ХС в организме значительна. ХС входит в состав мембран клеток, из него синтезируются стероидные гормоны и желчные кислоты. Транспорт ХС в кровотоке характеризуется тремя направлениями. Из свободного ХС, ненасыщенных ЖК (линолевой, арахидоновой), фосфотидилхолина синтезируются на частицах ЛПВП эфиры ХС (ЭХС), которые частично переносятся на ЛПНП. ЛПНП взаимодействуют с рецептором LDLR, а ЛПВП с рецептором SRB1B в гепатоцитах. ЛПВП и ЛПНП доставляют ЭХС в печень, где они используются для синтеза желчных кислот и ТГ. Свободный ХС, находящийся в ЛПВП, поступает в желчь, затем в составе желчи - в кишечник, а после реабсорбции из кишечника в кровь. Поскольку ХС необходим для синтеза желчных кислот и сам входит в состав желчи, которая важна для переваривания жиров, ХС можно рассматривать как участника жирового обмена. В связи с тем, что к ХС в организме человека присоединяются полиненасыщенные ЖК, из которых синтезируются регуляторы иммунной системы, ХС (как носитель полиненасыщенных ЖК в виде ЭХС) играет важную роль в обеспечение функционирования иммунной системы. ЛПНП перемещают ЭХС в макрофаги, где после распада ЭХС полиненасыщенные ЖК используются для синтеза медиаторов иммунной системы (тромбоксанов, простациклинов, простагландинов), а ХС экспонируется на клеточной мембране и захватывается ЛПВП. ЛПНП взаимодействуют с неспецифическим рецептором CD36 макрофагов. Также, ЛПВП переносят ЭХС к стероидогенным тканям, в которых ХС используется для синтеза половых гормонов. Интенсивность транспорта ЭХС в печень и в стероидогенные ткани регулируется эстрогенами. При нарушении такого транспорта ЭХС аккумулируются в цитоплазме макрофагов. С возрастом в макрофагах накапливается больше ЭХС, что является одной из причин развития возрастного атеросклероза [29].
Методы определения концентраций липидов в сыворотке крови
Концентрацию ТГ и ОХС в сыворотке крови определяли энзиматическими методами, содержание ХС ЛПВП - двухстадийным седиментационным методом; для определения использовали стандартные наборы реагентов "Новохол-А", "Триглицериды-Ново" и "ЛПВП-Холестерин-Ново" (фирма "Вектор-Бест", г. Новосибирск). Исследование проводили на автоанализаторе CORMAY LIVIA, ежедневный контроль качества исследований осуществляли с использованием аттестованных контрольных сывороток БИОКОНТ ("Агат", Москва) и HUMATROL (Германия).
Концентрация ОХС определялась ферментативным методом по конечной точке в несколько этапов: а) гидролиз эфиров ХС с образованием жирных кислот и свободного ХС (под действием ХС-эстеразы): ЭХС - ЖК + ХС, б) окисление свободного ХС с образованием холестен-3-она и перекиси во дорода (под действием ХС-оксидазы): ХС + 02 — холестен-3-он + Н202 , в) распад перекиси водорода с окислением хромогенных веществ (4 аминоантипирина и фенола) и образованием окрашенных продуктов розово го цвета (под действием пероксидазы):
Н202 + хромоген —» хинонимин. Концентрация ТГ также определялась ферментативным методом по конечной точке в несколько этапов: а) разрушение сывороточных ЛП (под действием детергентов), б) гидролиз ТГ до свободных ЖК и глицерола (под действием липазы): ТГ — ЖК + глицерол в) взаимодействие глицерола с АТФ и образование глицерол-3 -фосфата (под действием глицеролкиназы): глицерол + АТФ - глицерол-3-фосфат + АДФ , г) окисление глицерол-3-фосфата с образованием дигидроксиацетон фосфата и перекиси водорода (под действием глицеролфосфат-оксидазы): глицерол-3-фосфат + ( — дигилроксиацетон-фосфат + Н2О2, д) распад перекиси водорода с окислением хромогенных веществ (3,5 дихлор-2-гидроксибензолсульфоната и 4-аминоантипирина) и образованием хинониминового красителя красного цвета (под действием пероксидазы):
Н2О2 + хромоген -» хинонимин. Концентрация ХС ЛГЮП определялась седиментационным методом: после добавления к сыворотке крови осаждающего агента (гепарин + хлорид марганца) и центрифугирования апо-В-содержащие ЛП (ЛПНП, ЛПОНП) преципи-тируют и выпадают в осадок. В надосадочнои жидкости определяют концентрацию ХС ферментативным методом по конечной точке (см. выше).
Концентрация ХС ЛПНП определялась расчетным путем по формуле Фридвальда [168], рекомендованной для скрининговых исследований в случаях, когда содержание ТГ не превышает 4,5 ммоль/л: ХС ЛПНП = ОХС - ХС ЛПВП - ТГ / 2,2. 1. Коэффициент атерогенности (КА) расчитывался по формуле: КА = (ОХС - ХС ЛПВП) / ХС ЛПВП [29].
Для оценки уровня ОХС, ХС ЛПНП, ХС ЛПВП и ТГ принимали во внимание возрастные критерии, предложенные в Национальной образовательной программе по холестерину [23, 24, 252, 253]. Для констатации ДЛП, кроме концентрации основных липидных компонентов, учитывали результаты теста на наличие хил омикронов (внешний вид сыворотки после отстаивания при температуре +4 С в течение 16-20 часов) и результаты электрофореза сыворотки крови в полиакриа-мидном геле [29, 59]. Образцы сыворотки крови предварительно окрашивали насыщенным раствором судана черного В в этиленгликоле; 10 мкл сыворотки наносили в ячейку геля и после 15 минутного префореза проводили ЭФ (125 V, 18-24ч, 10С).
Фенотипирование ДЛП проводили по классификации, предложенной Frederickson D.S. et al. (1967), одобренной и расширенной Всемирной Организацией Здравоохранения (1970) [59, 166]. Рекомендуемые референтные значения концентраций липидов, общие критерии диагностики основных типов дислипидемий и классификация ДЛП представлены в таблицах 1-6 приложения.
Кроме нормолипидемии (НЛП), определялись следующие фенотипы ДЛП [29, 166]: гипер-альфа-ЛП-емия, гипо-альфа-ЛП-емия, ГЛП типа Па, ГЛП типа Пб, ГЛП типа IV.
Тотальную ДНК выделяли из венозной крови человека стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции [286]. В качестве антикоагулянта использовали 0.5 мл 0.5 М раствора этилен-диамин-тетрауксусной кислоты (ЭДТА). Для получения фракции клеточных ядер к 8 мл венозной крови человека добавляли 45 мл лизирующего буфера (0.32 М сахароза; 5 мМ MgCl2; 1% тритон Х-100; 10 Мм трис-HCl, рН=7.5), инкубировали 5 мин во льду и центрифугировали
15 мин при температуре 4С и 2500g. Полученный осадок промывали в ТЕ-буфере с рН=7.5-8.0 (10 мМ трис НС1, 1 мМ ЭДТА). После этого осадок ресус-пензировали в 3 мл буфера, содержащего 10-20 мМ трис-HCl рН=8.0, 2.5 мМ ЭДТА, 0.5% додецилсульфат натрия (ДСН или SDS - sodium dodecyl sulfate) и 100 мкг/мл протеиназы К, и инкубировали при температуре 37 С в течение 10 16 часов. Из полученного лизата выделяли ДНК. Для этого проводили две экстракции по 10 мин смесью фенол-хлороформ (1:1) и одну экстракцию хлороформом в течении 10 мин. ДНК осаждали двумя объемами 96% этилового спирта в присутствии 100 мМ ацетата натрия (рН=4.8). Осадок промывали 70% этанолом, подсушивали на воздухе и растворяли в 1 мл ТЕ-буфера с рН=8.0. Выход ДНК составлял 50-100 мкг на один мл образца крови.
Анализ липидного спектра сыворотки крови в разных возрастных группах
Результаты исследования показали, что в региональной популяции этнических татар концентрации липидов в сыворотке крови и величины КА варьируют в широких пределах, выходящих за границы референсных величин. У значительной части лиц, принявших участие в исследовании, выявлены ДЛП. Поэтому, в соответствие с задачами исследования, особенности липидного спектра у пожилых и стариков анализировали в сравнении с другими возрастными группами как по содержанию липидов при нормолипидемии (НЛП), так и по частотам обнаружения ДЛП.
На рисунках 4 и 5 отображена возрастная динамика анализируемых показателей при НЛП (статистические оценки значимости различий между возрастными группами по содержанию липидов и величине КА представлены в таблице 7 приложения). Очевидно, что концентрации ОХС, ХС ЛПНП, ТГ и величина КА изменяются в связи с возрастными особенностями, содержание же ХС ЛПВП не претерпевает каких-либо выраженных флуктуации в широком возрастном диапазоне. Возрастная динамика концентраций ОХС, ХС ЛПНП, ТГ, величины КА имеет характер параболической кривой. Другими словами, происходит их постепенное нарастание, как у мужчин, так и у женщин, начиная от младшего возраста, с выходом на плато в среднем и пожилом и понижением в старческом возрасте (рисунок 5).
Обозначения и примечания: 1 - младшая, 6 - пожилая возрастные группы, 2, (21 - 29 лет), 3 (30 - 39 лет), 4 (40 -49 лет) и 5 (50-55 лет) группы относятся к среднему возрастному периоду, 7 — группа лиц старческого возраста и 8 - долгожители; ВП - величина показателя (концентрация липидов в моль/л, КА - в относительных единицах).
В младшей возрастной группе при НЛП содержание ОХС характеризуется величиной 3.29 ммоль/л при минимальных и максимальных значениях 2.11 ммоль/л и 4.60 ммоль/л (таблица 4). Концентрация ХС ЛПНП в среднем составляет 2.11 ммоль/л, наименьшие и наибольшие ее значения - 0.39 ммоль/л и 4,46 ммоль/л. Для концентрации ХС ЛПВП эти статистики равны соответственно 1.18 ммоль/л, 0.89 ммоль/л и 1,74 ммоль/л, ТГ - 0.61 ммоль/л, 0.13 ммоль/л и 1.37 ммоль/л, а для величин КА - 1.85, 0.45 и 3.69. Достоверных различий в связи с тендерными особенностями в младшей возрастной группе не обнаружено.
ДЛП в младшей возрастной группе выявлены в 45.02% случаев, из которых 38.86% представлены фенотипом гипо-альфа-ЛП-емией, 6.16% - ГЛП Иа-фенотипа. Частоты ДЛП среди мужчин и женщин младшего возраста схожи (таблица 5). Таким образом, в данной возрастной группе высока частота обнаружения ДЛП, в спектре которых преобладают гипо-альфа-ЛП-емии.
Средняя возрастная группа включает в себя лиц в возрасте от 21 до 55_ лет. В этом возрастном периоде, как было показано выше, наблюдается динамика анализируемых показателей. Среди лиц в возрасте 21-29 лет концентрации ОХС, ХС ЛПНП, ТГ и величина КА достоверно выше (Р 0.001), чем в младшей возрастной группе. Как следует из материалов таблицы 6, содержание ОХС в этой группе варьирует от 2.89 ммоль/л до 5.15 ммоль/л и характеризуется средней величиной 4.25 ммоль/л; концентрация ХС ЛПНП в среднем составляет 2.81 ммоль/л, а наименьшее и наибольшее из ее отмеченных значений - 1.38 ммоль/л и 3.85 ммоль/л; концентрация ХС ЛПВП оценивается величиной 1.26 ммоль/л, при минимальном и максимальном значениях 0.92 ммоль/л и 1.83 ммоль/л, а концентрация ТГ - соответственно величинами 0.86 ммоль/л, 0.19 ммоль/л и 1.54 ммоль/л; минимальные, максимальные и средняя величины показателя КА составляют 1.02, 4.22 и 2.47. У женщин в возрасте 21-29 лет по сравнению с мужчинами того же возраста достоверно
У 19.66% лиц в возрасте 21-29 лет выявлены ДЛП (таблица 5). В этой группе спектр ДЛП представлен Па- (7.69%), ПЬ- (5.98%) фенотипами ГЛП и гипо-альфа-ЛП-емией (5.98%); статистически значимых различий по частотам ДЛП между группами мужчин и женщин не обнаружено.
В возрасте 30-39 лет концентрации ОХС, ХС ЛПНП, ТГ, достоверно выше, чем в предыдущих возрастных группах (Р 0.001), но ниже (Р 0.001), чем в возрасте 40-49 лет (табл. 7, таблица 7 приложения ). Содержание ОХС у лиц 30-39 лет составляет в среднем 4.60 ммоль/л при наименьшем и наибольшем из наблюдаемых в группе значений 3.17 ммоль/л и 5.2 ммоль/л; соответственно, для концентрации ХС ЛПНП эти статистики равны 3.13 ммоль/л, 1.61 ммоль/л и 4.16 ммоль/л, ХС ЛПВП - 1.26 ммоль/л, 0.93 ммоль/л, и 1.80 ммоль/л, ТГ - 1.03 ммоль/л, 0.26 ммоль/л и 2.72 ммоль/л, КА - 2.25, 1.11 и 4.83. Между мужчинами и женщинами в возрасте от 30 до 39 лет выражены различия по содержанию ХС ЛПНП (2.99 ммоль/л и 3.33 ммоль/л, Р=0.047) и величине КА (2.54 и 2.90, Р=0.023).
В возрастной группе 30-39 лет ДЛП выявлены в 12.07% случаев, из их числа Па-, ПЬ- фенотипы ГЛП соответственно у 4.31%, 3.45%, гипо-альфа-ЛП-емия у 4.31% лиц этого возрастного периода (таблица 5). По частотам ДЛП группы мужчин и женщин схожи.
Статистически значимых различий по концентрациям липидов и величинам КА между возрастными группами 40-49, 50-55, 56-74 лет не прослеживается (таблица 8, 9, 10, таблица 7 приложения). В то же время каждая из них характеризуется сравнительно более высокими значениями анализируемых показателей относительно других возрастных групп (таблица 4, 6, 7, таблица 7 приложения).
