Содержание к диссертации
П. КРАТКИЙ ОБЗОР ДОСТИЖЕНИЙ И ПРОБЛЕМ; В ИССЛЕДОВАНИЙ ОРГАНИ
ЗАЦИИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА.. 8
I.. Геном и гены 9
I.I. Сателлитная ДНК II
1,2* Обращенные повторы 13
1.3. Умеренно повторяющиеся последовательности 14
1.4* Семейства генов 17
1.5* Уникальные гены 20
I.6.. Организация нуклеотидных последовательностей....... 22
2.. Структурная организация хромосом 25
2.1. Нуклеосомы 25
2.2* Нуклеомерный уровень организации 30
2.3. Петлевой уровень организации 32
2.4 * Липидный компонент хроматина 36
2.5* Единый ли принципі организации хромосом у эукариот?. 38
Ш. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 42
I.. Выделение ядер 42
2* Нуклеазная обработка ядер 42
3* Получение сегментированного хроматина 43
4. Выделение ДНК, прочно ассоциированной с остовными
структурами; ядра 44
5 * Выделение ДНК. 45
-
сегментирование ДНК ферментами рестрикции. 45
-
Электрофорез хроматина в полиакриламидном геле 48
8* Электрофорез ДНК 49
9. Электрофорез РНК. и полинуклеотидов 51
10. Электрофорез белков в sds -системе 51
II* Окраска белков в полиакриламидном геле с использовани-
ем азотнокислого серебра 52
12* Количественная оценка тотальной и остаточной ДНК в
препаратах интерфазных хромосом 53
13* Выделение общих липидов хроматина и остаточного
ядерного материала печени крыс 54
14» Определение общелипидного фосфора.... 54
15* Двумерная хроматография фосфолипидов 55
16* Получение метиловых эфиров жирных кислот фосфолипидов 56 17. Газожидкостная хроматография метиловых эфиров жирных
кислот 57
18* Определение гликолипидных компонентов хроматина 57
17. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСЖДЕНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.. 59 I.. Использование высокочувствительного "серебряного" метода для детектирования нуклеиновых кислот в ПААГ.... 59 2* Зондирование петлевого уровня организации хромосом
у позвоночных 63
3* Исследование фрагментов остовной ДНК .*. 67/
3.1. Рестриктазный анализ остовной ДНК 67
3.2* Нуклеосомная организация остовной ДНК млекопитающих 74 4* Анализ липидного состава петлевых элементов интерфаз~ ных хромосом и остаточного ядерного материала печени
крыс. 77
5* Многообразие структурных форм хромосом и особенности их эволюции: моделирование и теоретические заключения 82
5 Л* Некоторые дополнения об эволюции хромосом 82
5.2* Геометрическое моделирование структурных типов
хромосом 89
5.3* Возможные причины особенностей эволюции хромосом.. 94
У. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 99
УІ* ВЫВОДЫ 106
УЛ.. ЛИТЕРАТУРА
- 4 ~
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
Биоакриламид - ц,ы' - метиленбисакриламид
ДНП - дезоксирибонуклеопротеид
кбп - тысяча нуклеотидных пар
трис - трис-(гидроксиметил) .- аминометан
ТЕМЕД - n, N, и1, N1- тетраметилэтилендиамин
ПААГ - полиакриламидный гель
Na2 ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
(натриевая соль)
SDS - додецилсульфат натрия
Введение к работе
Хромосома, как целое, является трудным объектом для исследования из-за сложности ее структурной организации и необходимости сочетания биохимических и электронномикроскопических методов. Наиболее изученными среди хромосом .оказались метафазные хромосомы человека. В структурной организации их выделяют по крайней мере три уровня: нуклеосомный, нуклеомерный и петлевой. По поводу первых двух уровней можно заметить, что они, по-видимому, универсальны, ибо обнаруживаются в хромосомах как высших, так и низших организмов» Что касается завершающих: структурных уровней, то ряд цитохимических и биохимических данных свидетельствует об отсутствии единого принципа укладки хроматиновых фибрилл в хромосомы. О различиях в структурной организации хромосом можно предполагать, к примеру, в случае хромосом экстремальных размеров у животных. Их можно ожидать и при сравнении хромосом высших животных и растений из-за существования различий в коэффициенте компак-тизации ДНК. в хромосомах и диаметре последних. Поэтому представляется интересным, анализ, возможных эволюционных структурных типов хромосом, что может быть сделано экспериментальными методами и с помощью- геометрического моделирования хромосом.
Изучение различий структурных типов хромосом в отдельных таксонах животных и растений представляет интерес и в связи с особенностями изменения кариотипа и генома, а также со скоростью эволюции хромосом в крупных таксонах* Рассмотрение эволюционирования интегральных характеристик генома и хромосом во взаимосвязи со структурным типом хромосом еще не предпринималось.
Попрежнему не ясно, какими нуклеотидными последовательное- - б - тями в петлевых структурах хромосом млекопитающих концы петель крепятся к остову хромосомы - специфическими или случайными. Не исключено, что удивительная регулярность образования петель в структуре эукариотических хромосом определяется короткими повторяющимися последовательностями по длине ДНК, Анализ этой проблемы возможен с помощьюз различных, подходов, например, посредством изучения кинетики! peaceоциации фрагментов остовной ДНК, либо воздействием на них различными рестриктазами.
Сведения о структурно-функциональной роли липидов в хроматине, в целом, немногочисленны» Известно, что в интерфазном ядре хроматиновые фибриллы находятся в тесном контакте с внутренним слоем ядерной мембраны. Большинство ранних подходов выделения интерфазного хроматина отличалось жестким, механическим воздействием на ядерную) мембрану, что могло привести к ее повреждению), фрагментации и переходу в водную фазу вместе с хроматином. Это создавало трудности для выяснения, каковы особенности: липид-ных компонентов самого хроматина и ядерных мембран* По-видимому, использование щадящих приемов выделения интерфазного хроматина позволит снизить присутствие участков ядерных мембран в хромати-новом экстракте и более точно охарактеризовать липидный компонент хроматина.
Целью, настоящей диссертационной работы явилось следующее: I* Определить биохимическим методом размеры петлевых элементов в интерфазных хромосомах различных позвоночных. 2. Исследовать с помощью рестриктаз особенности нуклеотидных последовательностей фрагментов остовной ДНК и выявить, организованы ли они по нуклеосомному принципу. 3* С; помощью; геометрического моделирования проанализировать возможные структурные типы метафазных хромосом. Ч* На основе накопившихся данных об эволюции геномов и кариотипов выяснить, не определяются ли особенности эволюции последних типом структурной организации их хромосом. 5* Исследовать липиды "петлевых" элементов интерфазного хроматина.
Диссертационная работа включает экспериментальные исследования интерфазных хромосом печени позвоночных и теоретический анализ накопившихся многочисленных данных по эволюции геномов и хромосом животных и растений» ~ 8 -
П. КРАТКИЙ ОБЗОР ДОСТИЖЕНИЙ И ПРОБЛЕМ, В ИССЛЕДОВАНИИ ОРГАНИЗАЦИИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА
В своей монографии "Синтез ДНК" один из создателей молекулярной биологии А.Корнберг делит историю; изучения ДЖ на три периода.. Хотелось бы обратить внимание на характеристику, данную Корнбергом современному, третьему периоду. По его мнению, в этот период общепринятые концепции, структуры и функции ДНК не пересматривались, не было сделано никаких кардинальных открытий. С того времени, когда были написаны эти строки, минуло почти 10 лет, и за этот период мы стали свидетелями большого числа интереснейших открытий по структурной организации ДНК, которые заставили; пересмотреть многие концепции структуры и функции ДНК. Среди них - открытие левой спирали ДНК /202/, разорванность нук-леотидных последовательностей многих генов эукариотических организмов /7, 14/, сюрпризы митохондриального генетического кода /43/, расшифровка полной нуклеотидной последовательности генома самых различных вирусов, большого числа генов и отдельных протяженных локусов геномов про- и эукариот, выяснение структурных-типов хромосом» Перечень достижений молекулярной биологии за последние годы можно было бы продолжить, но хотелось бы отметить, что им не в малой степени способствовало обращение исследователей не к обычным экспериментальным объектам, а к организации самых различных уровней эволюционной иерархии. Так, с представления' ми об универсальности генетического кода, казавшимися в течение долгого времени незыблемыми, пришлось, расстаться после расшифровки! митохондриального кода низших и высших организмов. Выявление особенностей митохондриального генетического кода служит при- ~ 9 - мером тому, что не следует на основе данных, полученных на одном или группе организмов, делать обобщения, возводя их в каноны. Очевидно, сравнительно-эволюционный подход позволит избежать поспешных заключений и обобщений, которые столь часто имели место в короткой истории молекулярной биологии.. Вместе с тем, именно молекулярная биология имеет прекрасные примеры фундаментальных обобщений,, основанных на привлечении огромного числа фактов как по низшим, так и по высшим животным, и растениям в сравнительно-эволюционном аспекте. Здесь имеются в виду прежде всего данные начального периода развития молекулярной биологии по нуклео-тидному составу ДНК или же данные по организации; нуклеотидных последовательностей генома-
Поскольку цель данной диссертационной работы - сравнительный анализ некоторых особенностей хромосом, то в этом разделе, посвященном краткому обзору достижений в изучении структурной организации хромосом, хотелось бы рассмотреть эти данные преимущественно в сравнительно-эволюционном аспекте. Если исходить из иерархии уровней организации генетического материала, то, по-видимому, можно было бы рассматривать их в последовательности ге-ны-хромосомы-геном.. Однако мы отступим: от этой последовательности, начав изложение с организации генома. Такое отступление представляется, по нашему мнению, оправданным, отчасти потому, что позволяет перейти от более интегральных характеристик генома к отдельным его структурным- единицам.
