Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Синтез липолитических ферментов микроорганизмами.... 10
1.2. Характеристика свойств микробных липаз
1.2.1. Выделение и очистка препаратов липаз 13
1.2.2. Физико-химические свойства и особенности строения нативных липаз 17
1.2.3. Специфичность действия микробных липаз 24
1.3. Иммобилизация липолитических ферментов 29
1.3.1. Физико-химические свойства иммобилизованных липаз. 34
1.4. Практическое использование липолититческих
ферментов 37
1.5. Заключение 41
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Объекты исследований 42
2.2. Методы определения липолитической активности
2.2.1. Определение активности титриметрическим методом 42
2.2.2. Определение активности липазы рН-статным методом... 43
2.3. Методы определения активности сопутствующих ферментов 43
2.4. Метод количественного определения содержания белка... 44
2.5. Получение препаратов липазы различной чистоты 44
2.6. Электрофоретическое исследование препаратов липазы... 46
2.7. Определение молекулярной массы липаз
2.7.1. Метод гель-фильтрации 46
2.7.2. Метод электрофореза в полиакриламидном геле
в присутствии SDS 47
2.8. Изоэлектрическое фокусирование липаз 47
2.9. Определение аминокислотного состава липаз 47
2.10. Модификация липазы специфическими ингибиторами.... 48
2.11. Методы иммобилизации липазы 48
2.12. Инфракрасная спектроскопия препаратов липазы 50
2.13. Определения содержания свободных жирных кислот в маслах в процессе гидролиза 50
2.14. Определение состава фракции свободных жирных кислот в масле 51
2.15. Анализ продуктов гидролиза триглицеридов методами тонкослойной и высокоразрешающей жидкостной хроматографии 52
2.16. Методы исследования клейковины теста из пшеничной муки, пшеничного крахмала 53
2.17. Статистическая обработка результатов 54
ГЛАВА 3.ПОЛУЧЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ ЛИПАЗЫ RH1ZOPUS ORYZAE 1403, ИЗУЧЕНИЕ ИХ ФРАКЦИОННОГО СОСТАВА И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ
3.1. Получение технических препаратов липазы 55
3.2. Получение высокоочищенных ферментных препаратов.... 62
3.3. Исследование некоторых физико-химических свойств изоферментов - Липазы I и Липазы II
3.3.1. Исследование аминокислотного состава липаз 67
3.3.2. Влияние рН и температуры на активность изоферментов.. 68
3.4. Заключение 70
ГЛАВА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ НЕКОТОРЫХ КАТАЛИТИЧЕСКИХ И КИНЕТИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК ЛИПАЗЫ I RHIZOPUS ORYZAE 1403
4.1. Исследование кинетических характеристик гидролиза трибутирина Липазой I
4.1.1 Влияние концентрации фермента на гидролиз трибутирина
2. Определение кинетических констант гидролиза трибутирина 71
3. Исследование влияния температуры и рН на кинетические константы гидролиза трибутирина 77
4. Определение рК функциональных групп активного центра Липазы I 79
Исследование функциональных групп активного центра Липазы I
1. Идентификация имидазольной группы Липазы I фотоокислением 79
2. Модификация Липазы I диэтилпирокарбонатом 83
3. Модификация Липазы I и-хломеркурибензоатом 88
4. Модификация Липазы I фенилметилсульфонилфторидом. 90
5. Механизм действия Липазы 1 93
Исследование специфичности действия липазы
Rhizopus oryzae 1403 и определение кинетических характеристик ферментативного гидролиза триглицеридов
1. Субстратная специфичность препарата липазы Г10Х 97
2. Кинетические параметры гидролиза триглицеридов Липазой 1 97
3. Специфичность Липазы I к жирным кислотам 102
4. Позиционная специфичность Липазы 1 103
Заключение 105
ИММОБИЛИЗАЦИЯ ЛИПАЗЫ RHIZOPUS ORYZAE 1403 И ИССЛЕДОВАНИЕ ЕЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ
Адсорбция липазы на неионогенном носителе 107
1. Выбор оптимальных условий сорбции 108
5.1.2. Физико-химические свойства иммобилизованной липазы... 110
5.2. Иммобилизация липазы путем связывания с анионном АВ-17-2П ПО
5.2.1. Метод иммобилизации липазы наанионите 112
5.2.2. Изучение физико-химических свойств липазы иммобилизованной на АВ-17-2П 113
5.2.3 Исследование характера взаимодействия липазы с
анионитом АВ-17-2П методом ИК-спектроскопии
5.2.4. Исследование кинетических характеристик гидролиза трибутирина 119
5.3. Непрерывный гидролиз растительного масла в реакторе с иммобилизованными липазами 123
5.4. Заключение 124
6. НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ЛИПАЗЫ RHIZOPUS ORYZAE 1403 В ХЛЕБОПЕЧЕНИИ
6.1. Динамика потребления глюкозы дрожжевыми клетками в присутствии масла и продуктов его гидролиза 127
6.2. Влияние гидролизованного масла на свойства клейковины пшеничного теста.... 133
6.3. Изучение свойств пшеничного крахмала под действием гидролизованного масла
144
6.3.1. Влияние масла на вязкость крахмальных растворов
6.3.2. Исследование пластической прочности крахмального студня
6.4. Заключение 149
ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ 150
ЛИТЕРАТУРА 151
ПРИЛОЖЕНИЯ 180
- Синтез липолитических ферментов микроорганизмами....
- Объекты исследований
- Получение технических препаратов липазы
Введение к работе
Актуальность темы. Липолитические ферменты всегда вызывали интерес ученых в связи со своими уникальными свойствами. Это действие на поверхности раздела фаз, разнообразие субстратной специфичности, способность катализировать как гидролиз триглицеридов, так и обратные реакции в микроводных условиях.
Ферментативный гидролиз жиров имеет несомненные преимущества по сравнению с химическим расщеплением. Помимо физиологического значения он используется человеком для получения глицерина и жирных кислот, удаления жировых примесей. С помощью позиционно-специфичных липаз можно осуществить избирательный гидролиз, который позволяет получать моно- и диглицериды, а также изменять функциональные свойства природных жиров, что важно для некоторых технологий. Исследования в области ферментативного катализа, реакций этерификации открыли новые возможности использования липаз.
Таким образом, липолитические ферменты представляют ценность для многих отраслей промышленности (олеохимической, текстильной, кожевенной, пищевой), для медицины и как биохимические реагенты.
Однако, внедрение липаз в производство сдерживалось в связи с их высокой стоимостью. Возможность иммобилизации ферментов в большей части решило эту проблему. Поэтому в последнее десятилетие исследования липаз развернулись в большем масштабе.
Несмотря на множество работ, посвященных липазам, трудно назвать такие, в которых они охарактеризованы достаточно полно с точек зрения свойств и структуры белка, строения активного центра, каталитического действия, специфичности, кинетических и термодинамических характеристик. Поэтому проблема глубокого изучения свойств нативных и иммобилизованных препаратов липолитических ферментов и разработка научно-обоснованных подходов к их применению является актуальной в теоретическом и практическом отношении.
Настоящая работа выполнялась в соответствии с тематикой научных исследований кафедры микробиологии и биохимии ВГТА, соответствующих плану госбюджетной НИР на 2001-2005 гг. (№ гос. регистрации 01930004491) по проблеме «Изыскание оптимальных условий биосинтеза микроорганизмами биологически активных веществ и изучение их физико-химических свойств». Данная проблема включена в координационный план РАН по программе «Микробиологический синтез и научные основы микробиологического получения практически ценных веществ».
Цели и задачи исследования. Цель работы - получение препаратов липазы Rhizopus oryzae 1403, иммобилизация фермента, исследование физико-химических свойств нативной и иммобилизованной липазы, изучение некоторых аспектов практического использования липазы в хлебопечении..Для достижения поставленной цели решались следующие задачи. S разработка технологии получения ферментных препаратов липазы с различной степенью очистки; V установление фракционного состава липолитического комплекса продуцента; •S исследование некоторых свойств изоферментов липазы; S изучение каталитических свойств Липазы I:
идентификация функциональных групп активного центра;
определение кинетических характеристик гидролиза три-глицеридов;
изучение специфичности действия.
•S иммобилизация липазы химическим и физическим способами;
•S исследование физико-химических и кинетических характеристик реакции гидролиза трибутирина иммобилизованными липазами;
проведение непрерывного гидролиза растительного масла в реакторе с иммобилизованными липазами;
S изучение роли гидролизованного масла в технологии хлебопечения (влияние на жизнедеятельность дрожжей, клейковину пшеничного теста и пшеничный крахмал).
Научная новизна. Установлено, что липолитический комплекс гриба Rhizopus oryzae 1403 состоит из двух изоформ.
На основе анализа кинетических параметров гидролиза трибутирина Липазой I при различных значениях рН, а также в присутствии специфических ингибиторов, установлено, что в акте катализа принимает участие гистидин и она относится к сериновым ферментам. В поддержании активной конформации фермента определенную роль играют SH-группы.
Выявлено, что Липаза I обладает 1,3-позиционной специфичностью; селективно гидролизует связи, образованные жирными кислотами со средней длиной цепи и содержащими не более двух двойных связей.
Исследованы некоторые свойства и установлены кинетические параметры гидролиза трибутирина липазой, иммобилизованной различными способами.
Практическая значимость работы. Разработаны технологические стадии производства препаратов липазы различной степени чистоты, предложена схема получения изоферментов липазы. Осуществлена иммобилизация ацетоноса-жденного препарата липазы на гидрофобном сорбенте и анионите АВ-17-2П. Показана возможность непрерывного гидролиза растительного масла в установке с иммобилизованной липазой. Доказана целесообразность использования гидролизованного растительного масла в хлебопечении на основании того, что оно интенсифицирует процесс потребления углеводов дрожжевыми клетками, улучшает свойства клейковины и пшеничного крахмала.
Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались и обсуждались на Международных научных конференциях: «Пищевые продукты XXI века» (Москва, 2001); «От фундаментальной науки к передовым технологиям» (Москва, Тверь 2001); «Биотехнология на рубеже третьего тысячелетия» (Саранск, 2001); 6-ой Международной научной конференции памяти В.М. Горбатова «Биотехнологические процессы переработки сельскохозяйственного сырья» (Москва, 2002); 2-ой Всероссийской научно-технической конференции «Современные достижения биотехнологии» (Ставрополь, 2002); 7-ой Пущин-ской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пу щино, 2003); Международном форуме «Аналитики и аналитика» (Воронеж, 2003); Всероссийском симпозиуме «Биотехнология микробов» (Москва, 2004); ежегодных научных конференциях Воронежской государственной технологической академии 1999-2002 г.г. и др.
Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 5 статьях, 1 патенте и 6 тезисах докладов.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, основных выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 203 страницах машинописного текста, содержит 52 рисунка и 14 таблиц. Список литературы включает 281 наименование, в том числе 165 на иностранных языках.
Автор выражает глубокую благодарность кандидату технических наук, доценту кафедры микробиологии и биохимии Воронеэюской государственной технологической академии СВЕТЛАНЕ АЛЕКСЕЕВНЕ ШЕЛАМОВОИ, при непосредственном консультировании которой была выполнена настоящая диссертационная работа.
Работа выполнялась на базе кафедры микробиологии и биохимии Воронежской Государственной Технологической Академии. Автор искренне благо- ч# дарит научного руководителя доктора технических наук, профессора Григорова
В. С. за оказанную помощь в выполнении данной диссертационной работы, а также выражает признательность коллективу кафедры за доброжелательное отношение при выполнении работы и содействие при её оформлении.
Синтез липолитических ферментов микроорганизмами
Согласно современным представлениям липазы (триацилглицеролазы, К. Ф. 3. 1. 1.3)- это ферменты, способные гидролизовать длинноцепочечные триацилглицерины [239].
В настоящее время липазы активно исследуются во всем мире. По последним статистическим данным они составляют 25 % всех ферментов, используемых в биотехнологии. Это связано не только с их биологической ролью в метаболизме липидов, но и использованием в качестве биокатализаторов для решения широкого спектра практических задач. Все возрастающие потребности народного хозяйства в липолитических препаратах с высокой активностью и низкой себестоимостью делают наиболее перспективным их производство с помощью микробного синтеза. Преимущество такого способа заключается в том, что на доступных питательных средах за короткие сроки можно получить препараты с высокой активностью и разнообразными свойствами [31].
Как показывают исследования, липазы способны синтезировать многие микроорганизмы, выделяемые из самых различных источников - окаменевшых смол, почвы, водных бассейнов, плодов растений, пищевых продуктов [227, 271, 220]. Как правило, липолитические ферменты являются внеклеточными, что во многом упрощает технологию получения препаратов.
Можно выделить наиболее ценные для биотехнологии продуценты липаз. Это Rhizomiicor miehei [158], Rhizopiis niveus [185], Rh. oiyzae [129], Rh. arrhizus [256], Rh. delemar [256], Geotrichum candidum [208], Humicola lanuginosa [146], Penicillium roqueforti [202], P. camambertii [276], Candida rugosa [130, 131], С antarctica [231].
Эти ферменты глубоко изучены, промышленностью выпускаются соответствующие препараты в растворимом и иммобилизованном виде: Novozyme 435 {Candida antarctica) [232], Amano Enzyme Ltd {Candida rugosa) [238], Lipozyme ЇМ 20 (Rhizomucor miehei) [144]. Они используются преимущественно в масло-жировой промышленности.
Интерес к липазам из Geotrichum candidum [163], Penicillium roqueforti [202], P. camambertii [276], P. expansum [250], P. candidum [136, 237], P. cyclopium [137], P. simphlissimum [253], P. citrinum [188] связан с их уникальной способностью гидролизовать жир в молочных продуктах, отщепляя определенные жирные кислоты. Таким образом создается специфический вкус и аромат сыра, масла.
Активно синтезируют липазы дрожжи. Самыми известными в этом отношении являются Candida rugosa [130], С. antarctica [273], С. parapsilosis [133], Yarrowia lipolytica [190]. Изучена структура этих ферментов, субстратная специфичность [159, 209, 279]. Препараты липазы из С. antarctica широко используются для синтеза самых разнообразных эфиров [273].
Изучение липолитических ферментов бактерий диктуется разносторонними проблемами, с которыми сталкивается человек. У некоторых видов — Propionibacterium acnes, Staphylococcus epidermis [245], S. aureus [215, 246], S. simulans [240], Pseudomonas aeruginosa [234] липазная активность в сочетании с другими ферментами является фактором патогенности. Эти липазы изучаются с точки зрения биологической эволюции. Многие из них клонированы и экспрес-сированы в клетках других бактерий, изучена их первичная и третичная структура. Но и в практической деятельности человека бактериальные липазы занимают далеко не последнее место. Хорошо известен продуцент липазы Chromatobacterium viscosum [251], выделенный из почвы. Важной особенностью этого фермента является способность гидролизовать липиды с высокой температурой плавления [257].
В последние годы появились работы, посвященные экстремальным видам микроорганизмов, липазы которых активны в щелочной зоне рН 9-10, при низких (от минус 2 С до +10 С) и высоких температурах (50-60 С). Это бактерии из родов Alcaligenes, Acinetobacter, Fusarium, Pseudomonas [222, 225, 254]. Из Bacillus stearothermophilus выделена липаза, проявляющая высокую активность
Объекты исследований
В качестве продуцента липазы как объекта исследований использовали микроскопический гриб Rhizopus oryzae (japonicus) 1403 из Всероссийской коллекции микроорганизмов.
Этот микроорганизм способен синтезировать липазу с активностью на уровне известных в настоящее время продуцентов и имеет перспективы промышленного применения [106, 108, 110].
Чистую культуру гриба поддерживали на среде следующего состава, (%): соевая мука - 2; кукурузный экстракт - 0,6; (NH4)2HP04 - 0,4; олеиновая кислота - 0,3; глюкоза - 1; агар - 2. Продуцент выращивали при температуре 30 ± 2 С в течение 6-7 сут и затем хранили при 4 ± 1 Для биосинтеза липазы использовали глубинный способ культивирования на лабораторной качалке (скорость вращения 1,7-1,8 с"1) в колбах Эрленмейера объемом 500 см3, содержащих 100 см3 питательной среды. При оптимальных условиях [106]: температура 30-32 С, продолжительность 60 ч. Питательная среда имела следующий состав (%): соевый жмых - 2,0; кукурузный экстракт -0,6; (NH4)2HP04 - 0,4; олеиновая кислота - 0,3; начальное значение рН 7,0. Засев среды производили споровой суспензией гриба в количестве 1 % об., что соответствовало 2,5x106 спор на 100 см3 среды [107, 109].
Методы определения липолитической активности
Определение активности липазы титриметрическим методом
Липолитическую активность в культуральной жидкости и ферментных препаратах определяли модифицированным методом Yamada и Machida [258].
В качестве субстрата использовали 0,1 М эмульсию субстрата в 2 % растворе поливинилового спирта. Реакционная смесь содержала 2,5 см3 эмульсии, 2 см3 0,05 М фосфатно-цитратного буфера с определенным значением рН и 0,5 см культуральной жидкости или раствора фермента. Время инкубации составляло 30 мин. После этого для прекращения реакции добавляли 15 см3 смеси этанол-ацетон (1:1 об/об) и 10 см3 0,05 М NaOH. Титрование образовавшихся свободных жирных кислот (СЖК) проводили 0,05 М НС1. Контрольный опыт осуществляли так же, но титрование проводили сразу после добавления культуральной жидкости или раствора фермента.
За единицу ферментативной активности липазы принимали такое количество фермента, которое освобождает I цмоль жирной кислоты за 1 мин.
Определение активности липазы рН-статным методом
Метод рН-статирования [74] использовали в опытах по определению кинетических характеристик гидролитического расщепления субстратов под действием нативной и иммобилизованной липазы.
Постоянство концентрации ионов водорода в реакционной среде поддерживали с помощью прибора для автоматического титрования.
Реакционную смесь вносили в термостатируемую ячейку с мешалкой, туда же опускали электроды от рН-метра и включали магнитную мешалку. Реакционную смесь нагревали до 37 С, рН доводили 0,1 М NaOH до величины 7,0, после этого приливали I см ферментного раствора, включали титратор и поддерживали постоянство рН дозированной подачей 0,05 М раствора NaOH. Отсчитывали по бюретке объем, пошедший на титрование за определенные промежутки времени, и вычисляли скорость гидролиза в цМ жирных кислот в мин. Начальную скорость рассчитывали по тангенсу угла наклона начального линейного отрезка кинетических кривых накопления СЖК от продолжительности гидролиза.
Получение технических препаратов липазы
Цель настоящей работы состояла в усовершенствовании технологии получения ферментного препарата липазы Rhizopus oryzae 1403 с использованием современных методов концентрирования и фракционирования.
На первом этапе проводилось концентрирование фильтрата культуральной жидкости продуцента, для чего использовали ультрафильтрацию. Начальное содержание сухих веществ в фильтрате культуральной жидкости (КЖ) составляло — 1,5 %, белка - 3,6 мг/см , активность липазы - 40,5 ед/см , удельная активность -11,55 ед/мг белка. В качестве субстрата использовали оливковое масло.
Ультрафильтрацию культуральной жидкости продуцента осуществляли на установке плоскокамерного типа циклического действия при температуре 20±1 С с использованием ацетатцеллюлозных мембран марки УАМ («Влади-пор» г. Владимир). Ацетатцеллюлозные мембраны широко используются для ультрафильтрации ферментов [111, 115]. Успешные результаты достигнуты Т. А. Григорьевой и др. [25] при ультрафильтрации липазы из Penicillium sp. Процесс осуществляли в два этапа. На первом освободили раствор липазы от высокомолекулярных веществ, при помощи ацетил целлюлозных мембран с размером пор 220 нм. На втором использовали те же мембраны с размером пор 50-100 нм, а также мембраны винилового ряда, для концентрирования раствора липазы, и одновременного удаления низкомолекулярных белков. Степень концентрирования достигла 1,2-1,3 раза.
Подбор мембраны нами был произведен по таким специфическим при-знакам, как проницаемость (G, л/м -ч) и селективность (R, %), характеризующим скорость процесса и степень задерживания концентрируемого вещества.
В основном фермент удерживался мембраной, но незначительная активность была обнаружена и в фильтрате - потери её составили 1,3 %.
Таким образом, проведенные исследования показали, что для ультрафильтрации фильтрата культуральной жидкости может быть использована аце-татцеллюлозная мембрана УАМ-30.
При помощи ультрафильтрации удалось сконцентрировать раствор фермента в 2,5 раза по СВ, происходила и его частичная очистка, о чем свидетельствует повышение удельной активности в 1,75 раза. Потери при ультраконцентрировании были минимальными и составляли 1,5-2,0 %.
Предварительно сконцентрированный ферментный раствор подвергали вакуум-сублимационной сушке.
Процесс замораживания - неотъемлемая часть технологии вакуум-сублимационного обезвоживания, поэтому представляло интерес исследование влияния низких температур на специфическую активность.
При замораживании ферменты ведут себя по-разному, сохраняя или теряя свою активность, что зависит от природы белка [43, 71]. Для выбора рациональных режимов охлаждения было изучено влияние скорости и температуры замораживания на активность исследуемой липазы (рис. 3.1. а, б). Установлено, что при понижении температуры от 0 до минус 5 С активность фермента несколько снижается, а в интервале минус 15-20 С увеличивается на 15-35 % по сравнению с исходной.
