Введение к работе
Актуальность темы. Как известно, живая чумная вакцина (ЖЧВ) на основе аттенуированного штамма Yersinia pestis EV линии НИИЭГ успешно применяется для специфической профилактики чумы у людей и животных на протяжении более 70 лет в нашей стране и в ряде стран СНГ (Салтыкова, Файбич, 1975; Айкимбаев с соавт., 2003; Feodorova, Corbel, 2009). До настоящего времени эта вакцина остается наиболее эффективным и единственным лицензированным профилактическим противочумным препаратом (Салтыкова, Файбич, 1975; Russell et al., 1995; Titball, Williamson, 2001, 2004; Медуницын, 2004; Бывалов, Кутырев, 2011; Книрель с соавт., 2011; Feodorova, Motin, 2011 и др.). Важным преимуществом ЖЧВ является ее способность уже после однократной прививки относительно быстро (в течение 3-4 дней) индуцировать специфический иммунитет против основных форм (бубонной и легочной) чумной инфекции (Самойлова, 1963; Исупов, Белобородов, 1995).
Выращивание экспериментально-производственного вакцинного штамма EV НИИЭГ для производства ЖЧВ на рутинных питательных средах in vitro, равно как и длительное масштабированное культивирование в биотехнологии производства противочумных профилактических препаратов зачастую обеспечивает выраженное снижение его иммуногенности (Салтыкова, Файбич, 1975; Алимов, 1984; Дятлов, 1986). Это связывают, как правило, с быстрой адаптацией чумных бактерий к условиям существования вне чувствительного макроорганизма и утрата так называемой «остаточной вирулентности» штамма, непосредственно обеспечивающей его иммуногенность (Салтыкова, Файбич, 1975; Анисимова с соавт., 2002; Промышленный регламент № 01897080-01-04 на производство «Вакцины чумной живой»). Восстановление иммуногенности проводится путем анимализации – многократного пассирования субкультур штамма EV НИИЭГ через организм морской свинки (Прядкина, Журба, 1966; Салтыкова, Файбич, 1975; Промышленный регламент № 01897080-01-04), что требует длительного времени, большого количества лабораторных животных и не поддается стандартизации ввиду использования в работе аутбредных биомоделей. Другой важной биотехнологической задачей при экспериментально-производственном выращивании штамма-продуцента ЖЧВ является разработка режимов, обеспечивающих высокий выход бактериальной массы (Шеремет с соавт., 1987). Согласно нормативной документации (Промышленный регламент № 01897080-01-04), для приготовления вакцины EV НИИЭГ микробные клетки данного штамма культивируют in vitro при температуре 28 оС на обычных бактериологических средах, производных гидролизатов Хоттингера (ГХ) или казеина. Однако биосинтез ряда важных для индукции специфического иммунитета антигенов Y. pestis наблюдается при температуре 37 оС, требует наличия в среде выращивания ряда дополнительных питательных компонентов и, в случае их отсутствия, сопровождается при выращивании микробных клеток в рутинных условиях in vitro заметным снижением активности роста чумных бактерий (Алутин, 1974; Наумов, Кондрашин, 1980; Brubaker, 1991). В литературе существуют многочисленные доказательства активизации пролиферации чумных бактерий при температуре 37 оС в условиях in vivo в организме чувствительных к чуме млекопитающих (Бахрах с соавт., 1969; Алутин, 1974; Perry, 1997). Очевидно, что заложенный в биотехнологию производства ЖЧВ режим выращивания штамма-продуцента принципиально отличается от условий внутренней среды макроорганизма млекопитающего, где на стадиях бактериемии и септицемии наблюдается наиболее бурное размножение микробных клеток. Сообщалось об определенных модификациях антигенной структуры чумного микроба в этот период, в частности, снижении продукции капсульного антигена Ф1, как у вирулентных штаммов возбудителя чумы, так и у бактерий Y. pestis EV76 – «прародителя» вакцинного штамма EV НИИЭГ (Burrows, Bacon, 1956; Brubaker, 1991). Остается неизвестным, имеет ли место изменение биосинтеза и других антигенов возбудителя чумы, задействованных в реализацию вирулентности и иммуногенности данного патогена – активатора плазминогена (Pla), «мышиного» токсина (Ymt) и липополисахарида (ЛПС). Вместе с тем, модификация продукции антигенов может объяснить относительно невысокую нейтрализующую активность противочумных антител, образующихся в макроорганизме вакцинируемого в результате иммунизации клетками вакцинного штамма EV НИИЭГ после их выращивания в регламентированном режиме при температуре 28 оС ввиду отсутствия в условиях in vivo на поверхности чумного микроба антигенов, синтезируемых in vitro на обычных бактериологических средах и невозможности индукции к этим антигенам протективных антител. Следовательно, оптимизация композиции протективных антигенов в препарате ЖЧВ должна способствовать повышению ее относительно невысокой иммуногенности.
Цель работы – разработка оптимальных биотехнологических режимов выращивания экспериментально-производственного вакцинного штамма EV НИИЭГ, обеспечивающих повышение его иммуногенности благодаря созданию эффективной антигенной композиции препарата живой чумной вакцины.
Задачи исследования:
-
Разработать оптимальные биотехнологические режимы выращивания in vitro бактерий экспериментально-производственного вакцинного штамма EV НИИЭГ для увеличения выхода микробной биомассы с единицы объема среды и повышения иммуногенности в лабораторных испытаниях (в сравнительных экспериментах с применением регламентированных питательных сред).
-
Исследовать влияние режимов выращивания на биосинтез и иммунореактивность основных специфических полипептидов и ЛПС вакцинного штамма EV НИИЭГ.
-
Исследовать биосинтез антигенов Ф1, Pla, Ymt и ЛПС штаммом-продуцентом ЖЧВ при выращивании в биотехнологических режимах, имитирующих условия паразитирования чумных бактерий в организме чувствительного млекопитающего in vivo.
-
Изучить в сравнительных экспериментах пролиферативную активность, биосинтез и иммунореактивность вакцинного штамма EV НИИЭГ, его изогенных вариантов, авирулентных и вирулентных штаммов чумных бактерий, выращенных в различных биотехнологических режимах.
-
Разработать более эффективную антигенную композицию препарата ЖЧВ.
-
Разработать модель экстрацеллюлярной среды млекопитающих in vitro для практического применения в биотехнологии производства ЖЧВ.
Научная новизна. Впервые разработаны и детально изучены биотехнологические режимы выращивания экспериментально-производственного штамма EV
НИИЭГ, основанные на имитации in vitro условий паразитирования чумных бактерий in vivo в сравнении с регламентированными питательными средами. С помощью специфических антител показано, что выращивание микробов вакцинного штамма EV НИИЭГ в биотехнологическом режиме, приближенном к внутренней среде макроорганизма хозяина, сопровождается у штамма-продуцента модификацией биосинтеза Ф1, Pla, Ymt, ассоциированных с ними фенотипических активностей и ЛПС. Аналогичный феномен обнаружен при культивировании в сходном биотехнологическом режиме природных вирулентных и авирулентных штаммов Y. pestis, несущих хотя бы одну из двух плазмид, видоспецифических для чумного микроба, но не изогенных вариантов EV НИИЭГ. Разработанный биотехнологический режим выращивания вакцинного штамма EV НИИЭГ с применением синтетической среды RPMI-1640 (RPMI), симулирующей экстрацеллюлярную среду чувствительных к чуме млекопитающих, обеспечивал значительное повышение иммуногенности штамма-продуцента (не менее 80% выживших от экспериментальной чумы аутбредных мышей) по сравнению с регламентированным режимом культивирования штамма-продуцента (не более 45,5% выживших биомоделей). Новыми являются сведения о направленном биосинтезе бактериями вакцинного штамма EV НИИЭГ в указанных условиях in vitro антигенов с м.м. 44,2±2 и 83,1±2 кДа, способных на мышиной модели индуцировать высокий уровень специфического иммунитета к экспериментальной чуме. По данным иммунохимического анализа указанные полипептиды были локализованы на поверхности микробных клеток EV НИИЭГ и могли активно секретироваться в среду культивирования, обладали серологическим родством с антигеном белковой природы вирулентного штамма Y. pestis 231 с м.м. 26,3-28,8 кДа, но продуцировались бактериями экспериментально-производственного штамма EV НИИЭГ в меньших количествах (в 2-4 раза) по сравнению с клетками вирулентного штамма.
Перспективным является также возможность повышения иммуногенности вакцинного штамма EV НИИЭГ (до 70% выживших мышей) при выращивании его в биотехнологических режимах с применением регламентированных бактериологических сред на основе ГХ, дополненных ионами Са2+ (2,5 мМ).
Разработана модель экстрацеллюлярной среды чувствительных к чуме млекопитающих. Показана принципиальная возможность имитирования in vitro ранней стадии взаимодействия чумных бактерий с макроорганизмом хозяина до контакта с клеткой-мишенью. Приоритетными являются сведения о развитии в этот период капсулонезависимого типа резистентности чумного микроба к фагоцитозу, которые могут служить основополагающим фундаментом усовершенствования ЖЧВ на основе вакцинного штамма EV НИИЭГ равно как и конструирования новых эффективных профилактических противочумных препаратов. Полученные данные являются перспективным для разработки оптимальной антигенной композиции новой субъединичной вакцины для быстрого купирования чумной инфекции у привитых в ранние сроки после заражения путем использования вышеуказанных антигенов.
Практическая значимость работы. Разработаны эффективные биотехнологические режимы выращивания бактерий экспериментально-производственного вакцинного штамма EV НИИЭГ, позволяющие почти четырехкратно повысить выход микробной биомассы в условиях in vitro. Благодаря оптимизации продукции вакцинным штаммом известных полипептидов с иммуногенной активностью, Ф1, Pla, Ymt, эндотоксина (ЛПС) и ряда других антигенных субстанций, а также направленной индукции биосинтеза белков с м.м. 44,2±2 и 83,1±2 кДа, выявленных только в условиях, приближенных к экстрацеллюлярной среде млекопитающих, и обладающих, по-видимому, высокой протективной активностью, указанный биотехнологический подход позволил почти в два раза повысить иммуногенность и в восемь раз иммунореактивность штамма-продуцента.
По материалам диссертации разработаны и утверждены директором ГНУ Саратовский НИВИ Россельхозакадемии (от 16 марта 2012 г.) «Методические рекомендации по оптимизации биотехнологического режима выращивания бактерий штамма Y. pestis EV НИИЭГ – продуцента живой чумной вакцины для повышения выхода клеточной биомассы».
Материалы исследований используются при чтении курса лекций по биотехнологии и микробиологии ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ».
Связь работы с научными программами. Настоящая работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 03-04-48067 «Молекулярная организация и структурно-функциональная характеристика биомолекул, детерминирующих вирулентность патогенных иерсиний», проектов BII/ISTC #3853 «Живые бактериальные вакцины: сравнительный анализ иммунного ответа человека и биомоделей» и «Изучение антибактериального иммунитета» (Университет Техаса, г. Галвестон, UTMB, субконтракт No. 11-082), а также Федеральной Целевой Программой по теме «Разработка когерентно-оптических биосенсоров на генетическом, клеточном и организменном уровнях организации» (соглашение № 14.В37.21.0563).
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Разработаны и оптимизированы биотехнологические режимы выращивания бактерий экспериментально-производственного штамма EV НИИЭГ, основанные на имитации in vitro условий паразитирования возбудителя чумы in vivo в организме чувствительных млекопитающих и позволяющие существенно (в 3,5-4,2 раза) повысить клеточный урожай ЖЧВ.
2. Выращивание штамма EV НИИЭГ, продуцента ЖЧВ, в биотехнологических режимах с применением регламентированной среды бульон Хоттингера (БХ), дополненной ионами Са2+ (2,5 мМ) в сочетании с 0,1% глюкозы или только ионами Са2+ (2,5 мМ), обеспечивает больший (в 2,8-3,7 раза) выход биомассы вакцинного штамма EV НИИЭГ, чем при использовании той же среды без указанных ингредиентов.
3. Установлены выраженные различия в составе антигенной композиции и иммуногенности ЖЧВ на основе вакцинного штамма EV НИИЭГ в зависимости от режима его культивирования in vitro.
4. Выращивание штамма-продуцента EV НИИЭГ в биотехнологическом режиме in vitro, приближенном к экстрацеллюлярной среде макроорганизма хозяина in vivo, обусловливает модификацию биосинтеза специфических антигенов чумного микроба – Ф1, Pla, Ymt, изменение фенотипических активностей, ЛПС и направленную продукцию протективных полипептидов с м.м. 44,2±2 и 83,1±2 кДа. Более эффективная композиция вакцинного препарата позволила существенно (с 45% до 80%) повысить иммуногенность и в восемь раз иммунореактивность штамма EV НИИЭГ.
5. Применение синтетической среды RPMI на основных стадиях биотехнологического процесса приготовления чумной вакцины EV НИИЭГ (этапах подготовки маточной культуры, посевного материала, накопительной культуры и т.д.) в перспективе позволит стандартизировать биотехнологию ее масштабированного производства, направленного на приготовление готового препарата с высокой иммуногенной активностью.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на: Научно-практической конференции «Природно-очаговые ООИ на юге России, их профилактика и лабораторная диагностика», (Астрахань, 2001); Первой региональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой», (Саратов, 2002); III конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины, (Москва, 2004); Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология – XXI век», (Саратов, 2004); Научно-практической конференции, посвященной 70-летию Противочумного центра «Противочумные учреждения России и их роль в обеспечении эпидемиологического благополучия населения страны», (Москва, 2004); II конференции студентов, молодых ученых и специалистов «Современные проблемы науки и образования», (Хургада, Египет, 2005); VI межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях», (Волгоград, 2005); Международном Вакцинном Конгрессе, (Амстердам, Нидерланды, 2007); Германо-Российском форуме по биотехнологии, (Новосибирск, 2009); Международной научно-практической конференции «Современные проблемы инфекционной патологии человека», (Минск, Беларусь, 2009); VI международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» в рамках IV Российского медицинского форума, (Москва, 2009); III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инфекции, обусловленные иерсиниями», (Санкт-Петербург, 2011).
Личный вклад соискателя заключается в самостоятельном проведении экспериментальных исследований, обработке и интерпретации полученных результатов. Постановка задач исследований осуществлялась научными руководителями д-ром мед. наук, профессором В.А. Федоровой, канд. биол. наук В.Л. Мотиным.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (2 главы), собственных исследований (4 главы), заключения, выводов и списка использованных литературных источников, включающего 416 источников, из них зарубежных – 148. Работа изложена на 200 страницах, содержит 10 таблиц и 16 рисунков.
