Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Принципы конструирования иммуноанализа 17
Глава 2. Характеристика возбудителя хламидиоза собственные исследования
Глава 3. Объекты, материалы и методы исследований 60
3.1. Биомодели для получения препаративного количества специфических хламидииных антител 60
3.2. Клинический материал от овец 60
3.3. Антигены 61
3.4. Методы получения специфических хламидииных антител (иммуноглобулинов) 61
3.4.1. Иммунизация биомоделей 61
3.4.2. Получение и выделение специфических иммуноглобулинов из иммуноасцитической жидкости мышей и сыворотки крови кроликов 62
3.4.3. Определение чистоты выделенных иммуноглобулинов. 64
3.5. Методы изучения диагностической значимости
полученных хламидииных антител и сконструированных на их
основе экспериментальных вариантов иммуноанализа для
выявления возбудителя хламидиоза овец 65
3.5.1. Определение титра полученных мышиных и кроличьих хламидииных антител 65
3.5.2. Определение диагностической значимости экспериментальных хламидииных антител 66
3.5.3. Бактериоскопические исследования клинического материала от овец 66
3.6. Методы приготовления конъюгата антихламидийных
иммуноглобулинов с коллоидным золотом 67
3.6.1. Получение раствора коллоидного золота 67
3.6.2. Определение «золотого числа» 67
3.6.3. Конъюгирование антихламидийных иммуноглобулинов с наночастицами коллоидного золота
3.6.4. Концентрирование иммунозолотого конъюгата 68
3.7. Молекулярно-генетические методы 69
3.7.1. Выделение ДНК из клинического материала от овец 69
3.7.2. Проведение ПЦР-амплификации 69
3.7.3. Детекция продуктов ПЦР-амплификации 76
3.8. Оборудование, материалы и реактивы 77
3.8.1. Оборудование 77
3.8.2. Основные материалы 78
3.8.3. Реактивы и растворы 79
3.9. Статистические методы и компьютерная обработка результатов 81
ГЛАВА 4. Разработка экспериментальной биотехнологии получения специфических хламидииных антител как основы иммунотестов для выявления возбудителя хламидиоза овец 82
4.1. Оптимизация получения специфических антител к стандартному орнитозному антигену С. psittaci («С-аг-1») с использованием в качестве биопродуцентов кроликов и инбредных мышей 84
4.1.1. Получение специфических кроличьих антител к стандартному орнитозному антигену С. psittaci («С-аг-1») 85
4.1.2. Получение специфических мышиных антител к стандартному орнитозному антигену С. psittaci («С-аг-1») 90
4.2. Оптимизация получения мышиных специфических антител к комбинации антигенов к С. trachomatis и С. psittaci («С-аг-2»). 94
4.3. Получение препаративного количества специфических хламидийных антител, выделение и оптимизация способов хранения иммуноглобулиновой фракции 96
4.4. Изучение диагностической значимости отдельных экспериментальных серий моноспецифических хламидийных антител с использованием расширенной панели клинических образцов от овец 102
ГЛАВА 5. Конструирование и апробация экспериментальных вариантов иммуноанализа для экспресс-диагностики хламидиоза овец 107
5.1. Приготовление конъюгата моноспецифических антихламидийных иммуноглобулинов и коллоидного золота с диаметром наночастиц 20 и 40 нм 108
5.2. Конструирование вариантов ДИА на основе экспериментальных серий иммунозолотых конъюгатов «Ig4 4 Au20», «Ig4-Au40», «Igl5-Au20» и «Igl5-Au40» 110
5.2.1. Изучение влияния способов инкубирования НЦМ с нанесенными клиническими образцами в иммунозолотом конъюгате на результаты иммунотеста
5.2.2. Изучение влияния твердой фазы на результаты иммуноанализа 113
5.2.3. Изучение влияния способов фиксации клинического материала на твердой фазе при постановке ДИА с использованием экспериментальных серий иммунозолотого конъюгата на количество ложноотрицательных и ложноположительных ответов 115
5.2.4. Оптимизация интенсивности цветного сигнала в ДИА
путем концентрирования иммунозолотых конъюгатов 116
5.2.5. Изучение влияния способов блокировки свободных сайтов НЦМ на результаты ДИА 118
5.2.6 Изучение диагностической значимости и апробация экспериментального ДИА40/15 на клинических образцах от овец 121
5.3. Конструирование экспериментального варианта иммунохроматографического анализа с использованием «Ig4 Au20», «Ig4-Au40», «Igl5-Au20» и «Igl5-Au40» 121
5.3.1. Подбор аналитических мембран для оптимизации активности иммунозолотого конъюгата и изучения эффективности формирования цветного сигнала 122
5.3.2. Сравнительное изучение методов фиксации иммуноглобулинов на аналитической мембране 124
5.3.3. Изучение влияния блокировки свободных сайтов аналитической мембраны на визуализацию результатов иммунохроматографического анализа 127
5.3.4. Выбор мембран для фиксации иммунозолотого конъюгата 128
5.3.5. Изучение влияния тест-буферов на эффективность индикации возбудителя хламидиоза овец иммунохроматографической тест-системой 130
5.3.6 Изучение диагностической значимости и апробация экспериментального варианта иммунохроматографической тест-системы на клинических образцах от овец 133
ГЛАВА 6. Разработка системы валидации иммунотестов для экспресс-диагностики хламидиоза овец с использованием современных молекулярно-генетических методов 135
6.1. Выявление ДНК С. trachomatis в клиническом материале от овец с применением коммерческих ПЦР тест-систем 135
6.2. Определение геновара ДНК С. trachomatis, присутствующей в клинических образцах от овец 137
6.3. Изучение изменений в геноме С. trachomatis из клинического материала от овец с использованием праимеров на плазмидные и хромосомные мишени 140
6.3.1 Изучение изменений в криптической плазмиде
С. trachomatis при помощи праимеров на гены ог/2 и ог/8 141
6.3.2. Детекция ДНК С. trachomatis с использованием в качестве мишени хромосомного гена ібЗрибосомального
белка С. trachomatis (16SRB) 142
6.3.3 Определение нуклеотидной последовательности и изучение полиморфизма гена ompl С. trachomatis в
клинических образцах от овец 143
6.3.4. Выявление в клиническом материале от овец новых «шведских» вариантов С. trachomatis с делецией в плазмиде 150
Заключение 153
Выводы 164
Список сокращений и условных обозначений 165
Список литературы
- Получение и выделение специфических иммуноглобулинов из иммуноасцитической жидкости мышей и сыворотки крови кроликов
- Конъюгирование антихламидийных иммуноглобулинов с наночастицами коллоидного золота
- Получение специфических кроличьих антител к стандартному орнитозному антигену С. psittaci («С-аг-1»)
- Сравнительное изучение методов фиксации иммуноглобулинов на аналитической мембране
Получение и выделение специфических иммуноглобулинов из иммуноасцитической жидкости мышей и сыворотки крови кроликов
Реакция нейтрализации (РН) основана на способности антител нейтрализовать вирусы, бактерии, экзотоксины и эндотоксины. РН проводят путем введения смеси антиген — антитело животным или в чувствительные тест-объекты (культура клеток, куриные эмбрионы). Отсутствие у животных и тест-объектов признаков повреждающего действия микроорганизмов или их антигенов и токсинов говорит о нейтрализующем действии иммунной сыворотки и, следовательно, о специфичности взаимодействия комплекса антиген-антитело. Основным недостатком данной реакции отмечали ее большую продолжительность (от 2-3 суток до нескольких недель) (Перадзе, Халонен, 1985; Титов, 2008; Бурова и др., 2009).
Реакция связывания комплемента (РСК) считалась более сложной реакцией, чем РА и РП, т.к. в ней задействованы две системы (бактериолитическая и гемолитическая). Бактериолитическая система состоит из трех компонентов: бактерийного антигена, специфического для него антитела и свободного комплемента. С комплексом антиген-антитело взаимодействует комплемент, и, при добавлении гемолитической системы, включающей эритроциты и специфический к ним гемолизин, лизис не происходит, поскольку для этой реакции нужен комплемент, который уже связался с комплексом антиген-антитело. Если комплекс не образовался на первом этапе, то произойдет лизис эритроцитов (Михин, Леонов, 1938; Розанов, 1952; Перадзе, Халонен, 1985; Титов, 2008). Данная реакция достаточно долго занимала лидирующие позиции в лабораторной диагностике инфекционных заболеваний благодаря своей более высокой чувствительности по сравнению с предыдущими вариантами иммуноанализа, несмотря на относительную сложность ее постановки. Однако, разрешающая способность РСК оказалась недостаточной и не позволяла со 100% уверенностью ставить окончательный лабораторный диагноз. Так, например, при исследовании сывороток крови от больных хламидиозом чувствительность данного метода составила не более 57.9% (Козлова, Пухнер, 2003; Луцук и др., 2009).
В 1950 году Куне (Coons А.Н.) и Каштан (Kaplan М.Н.) нашли способ мечения антител флуоресцентными красителями без утраты способности первых реагировать с антигеном. На основании этого открытия была разработана новая серологическая реакция, сочетающая в себе чувствительность и специфичность иммунологических реакций с топографической точностью микроскопии (Кэтти,1991; Coons., Kaplan, 1950), которая впоследствии была названа реакцией иммунофлуоресценции (РИФ). Различают прямую и непрямую РИФ (метод Кунса). В прямой РИФ специфические антитела, меченные флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ), взаимодействуют непосредственно с антигеном, а в непрямой РИФ -меченные ФИТЦ антивидовые антитела связываются со специфическим комплексом антиген-антитело. Данная реакция считается «золотым стандартом» в иммунодиагностике многих инфекционных заболеваний, в частности, при хламидиозе (Гранитов, 2002), поскольку обладает относительно высокой специфичностью (50-98%) и чувствительностью (54 22
95%) по сравнению с РА и РСК (Ощепков., Катаман, 2001). В то же время, данные методы не могут быть полностью стандартизованы, поскольку основаны на визуальном учете результатов и являются субъективными, а для постановки реакции зачастую используются антитела, полученные от аутбредных животных, или поликлональные сыворотки, которые сложно стандартизировать. Указанные недостатки существенно влияют на чувствительность и специфичность метода. Также значительным недостатком метода является потребность в дорогостоящем оборудовании, таком как флуоресцентный микроскоп, и высококвалифицированном персонале (Зыкин и др., 2011).
Большинство вышеуказанных недостатков иммуносерологических методов было минимизировано с появлением в 1971 году иммуноферментного анализа (ИФА), который был разработан почти одновременно двумя независимыми группами ученых - Е. Engvall с Р. Perlmann и В. Van Weemen с A. Schuurs (Engvall., Perlmann, 1971; Van Weemen, Schuurs, 1971; Hro, Ленхофф, 1988). В основу данного метода детекции антигенов или антител положено выявление специфического комплекса с применением антивидового конъюгата, меченого ферментом, с последующей регистрацией цветного сигнала, опосредованного добавлением специального субстрата. Среди основных преимуществ данного метода следует считать значительное повышение чувствительности и специфичности по сравнению с другими вариантами анализа. Это обеспечивается ферментом, одна молекула которого катализирует несколько молекул хромогенного субстрата, а также автоматизированными (объективными) методами учета реакции. Не менее важным является возможность анализировать в ИФА микрообъемы тестируемых образцов, в т.ч. при массовом скрининге; простота постановки и учета результатов как визуально, так и с применением оптических ридеров; отсутствие специальных требований к устройству лаборатории и квалификации персонала. Все это позволило ИФА в короткие сроки стать неотъемлемой частью лабораторной иммунодиагностики инфекционных заболеваний как у нас в стране, так и за рубежом, а также занять данному методу ведущие позиции при проведении фундаментальных исследований в различных областях молекулярной иммунологии и иммунобиологии (Bidwell et al., 1976; Nicolai-Scholten et al., 1980; Самуилов, 1999; Hyde, 2006; Пальцев, 2009).
За прошедшие 40 лет было разработано множество различных модификаций ИФА, направленных на дальнейшее повышение чувствительности и специфичности, а также максимальное упрощение процедуры постановки и учета результатов анализа (Но et al., 2009).
Поскольку за это время произошло расширение сферы применения ИФА равно как и других серологических методов, позволяющих теперь не только проводить исследование сывороток крови или выступать в качестве иммунодиагностикумов, но также выполнять и аналитические задачи, в частности, для аналитической химии, биохимии, иммунологии и т.д., данные реакции были объединены в иммуноанализ (Коллинз, 1991).
В настоящее время не существует единой классификации всех предложенных вариантов ИФА, хотя их можно условно разделить на две группы: гомогенные и гетерогенные.
Гомогенным называют модификации ИФА, все стадии которого, включая ферментативную, происходят в растворе и не требуют отмывки компонентов, не связавшихся со специфическим иммунным комплексом. Основным преимуществом считается экспрессность анализа - возможность получения результата реакции в течение пяти минут, что, к сожалению, сопровождается существенным снижением чувствительности по сравнению с гетерогенным ИФА (Фримель, 1987; Егорова и др., 1991).
Конъюгирование антихламидийных иммуноглобулинов с наночастицами коллоидного золота
Наиболее часто в экспериментальной биологии используются частицы золота размером 20 и 40 нм, поскольку их применение обеспечивает высокую чувствительность сконструированных тестов на НЦМ со стандартными диаметром пор (0,22; 0,45 мкм) без дополнительной оптимизации твердой фазы. Также существенным преимуществом данного варианта иммуноанализа можно считать возможность учета результатов без специального оборудования, так как полученные результаты в виде цветного окрашенного пятна на светлом фоне НЦМ легко учитываются визуально (Dykman, Bogatyrev, 2000; Дыкман, Богатырев, 2007; Дыкман и др., 2008), а сама мембрана может долго храниться (недели, месяцы и даже годы) без потери интенсивности окрашивания цветного сигнала. Не менее важным можно считать и то, что иммунотесты с применением в качестве метки наночастиц коллоидного золота можно использовать при исследовании органов и тканей с высоким уровнем эндогенной пероксидазы в отличие от вариантов ТИФА с пероксидазной меткой. Также значительно сокращается продолжительность анализа, которая, например, в прямом варианте составляет от 1 до 15 минут, поскольку метка коллоидным золотом исключает необходимость применения дополнительного субстрата, в отличие от ТИФА с другими метками. Следовательно, тесты с «идеальным маркером» обладают широкими перспективами для ветеринарной и медицинской практики (Любавина и др., 2004). Основными недостатками их применения считают: относительно низкую чувствительность тестов с золотой меткой по сравнению с другими вариантами ТИФА, возможную агрегацию коллоидного раствора при неправильном хранении конъюгата (например, при многократном замораживании и оттаивании), потребность в специальном разрешении для работы в лаборатории с коллоидным золотом, как и другими драгоценными металлами. Однако для конечных пользователей тест-системами с золотыми наночастицами таких ограничений не предусматривается, поэтому данные тесты получают все более широкое распространение (Ла et al, 2010).
Одним из вариантов ТИФА с применением НЦМ в качестве твердой фазы является иммуноблоттинг, предложенный в 1979 году Дж. Ренартом (Renart et al, 1979), представляющий собой сочетание двух методов - электрофореза в денатурирующих условиях и рутинным ТИФА на НЦМ по стандартному протоколу. Среди основных преимуществ данного метода отмечают более высокую чувствительность и информативность по сравнению с другими модификациями ТИФА. Это обеспечивается постановкой ТИФА с мономерными формами сложных антигенов или бактериальных взвесей, предварительно фракционированных при электрофоретическом разделении и последующим переносом и иммобилизацией на НЦМ в виде реплик (отпечатков) соответствующих биомолекул (Пастер и др., 1989). В настоящее время разработаны и пользуются большой популярностью коммерческие и экспериментальные киты на основе иммуноблота для определения антител или антигенов бактериальной природы, такие, как например, Комплект helicobacter Pylori ViraBlotIgA, Комплект Yersinia ViraBlotIgA Комплект Yersinia ViraBlotIgG производства Viramed Biotech AG (Германия) (Петрова, 2006; Кокорина и др., 2011). Основным недостатком метода следует считать большую продолжительность анализа в лабораторных условиях (до 1-2-х суток), хотя коммерческие варианты отличаются относительной экспрессностью (от 30 мин. до 1,5-2 часов), а также достаточно высокой стоимостью теста.
В 1994 году Федоровой В.А. (Федорова, 1994; Федорова, Девдариани, 1998) было предложено комбинирование блоттинга и метода тонкослойной хроматографии с фракционированными компонентами кора бактериального липополисахарида (ЛПС) вместо электрофореза в денатурирующих условиях для изучения эпитопной специфичности МКА, меченных коллоидным золотом. Данный подход имеет большие перспективы в фундаментальных исследованиях бактериальных липополисахаридов.
В конце 20-го века появилось новое направление, позволяющее использовать протеомные технологии при разработке лабораторных методов диагностики как соматических, так и инфекционных болезней. Данное направление связанно с поиском диагностических маркеров заболевания, так называемое обнаружение определенных молекул или их комплексов, которые присутствуют только в пораженных тканях или клетках. В качестве объектов исследования возможно использовать любые (в зависимости от заболевания) биологические жидкости организма, клетки, материал, полученный путем биопсии, а также протеомы микроорганизмов — возбудителей заболеваний (Anderson, Anderson, 2002; Дынник, Залесский, 2006; Титов и др., 2007; Китаєва и др., 2010).
Среди протеомных методов, наиболее часто используемых для обнаружения биомаркеров, применяют двумерный электрофорез с последующей масс-спектрометрической идентификацией белков. Метод двумерного электрофореза позволяет разделять белки в одном направлении путем изоэлектро фокусирования, а в другом - по молекулярной массе посредством общепринятого гель-электрофореза, основанного на денатурации додецилсульфатом натрия. Изоэлектрофокусирование разделяет белки в градиенте рН, где каждый белок движется в геле до тех пор, пока не достигнет значения рН, соответствующего его изоэлектрической точке. В настоящее время используют иммобилизированные в геле градиенты рН очень узкого диапазона (до 0,2), что позволяет разделять белки с близкими значениями рН и, соответственно, увеличивать разрешение. При выявлении биомаркеров сравнивают интенсивность пятен на геле путем вырезания их из геля и идентификации масс-спектрометрически, либо при помощи сканирования и анализа геля в компьютерной программе, например, в Melanie III («GeneBio», Швейцария). (Говорун, Арчаков, 2002; Власова и др., 2005; Гоуфман и др., 2006). Помимо классического двумерного электрофореза предложено использовать его модификации, такие как дифференциальный электрофорез в геле (DIGE), в котором белковые экстракты из пораженных и здоровых тканей метятся двумя разными флуоресцентными зондами и смешиваются. Затем, после обычного двумерного электрофореза, для каждого пятна измеряют интенсивность флуоресценции и рассчитывают разницу в интенсивности между двумя флуоресцентными метками. Подобный подход позволяет достичь полной идентичности условий проведения электрофоретического исследования и максимально повысить воспроизводимость результатов. (Unlii et al., 1997; Zhou et al., 2002; Власова и др., 2005). Основным преимуществом метода двумерного электрофореза является возможность его совмещения с масс-спектрометрией для определения аминокислотной последовательности белков. Несмотря на то, что протеомный анализ является информационным, высокочувствительным методом у него есть и существенные недостатки, ограничивающие его практическое применение. К основным недостаткам относят его трудоемкость и плохую воспроизводимость, из-за чего сложно получить достаточный для статистической обработки объем данных.
Получение специфических кроличьих антител к стандартному орнитозному антигену С. psittaci («С-аг-1»)
В основе ПЦР детекции лежит многократная амплификация определенного фрагмента ДНК, который является маркерным для данного патогена. С помощью ПЦР можно обнаружить плазмидную ДНК хламидий, фрагменты хромосомной ДНК, кодирующие основной белок внешней мембраны (от англ. Major Outer Membrane Protein, MOMP), рибосомальную РНК и др. К преимуществам этого метода относятся высокая чувствительность (70 - 95 %) и специфичность (97 - 99 %), а также возможность одновременного тестирования большого числа образцов, быстрота и автоматизация (Stary, 2001). Однако наибольший успех с точки зрения чувствительности и специфичности анализа достигнут при использовании ПЦР в реальном времени, особенно в системе TaqMan (Schachter, 2010).
В последнее время появились сообщения о разработке новых методов протеомики с использованием микрочипов, которые по своей чувствительности и специфичности должны значительно превосходить все существующие аналоги (Teng et al, 2012).
Молекулярно-генетические методы имеют большое значение для своевременной и качественной диагностики хламидиозов. Данные методы позволяют более подробно изучать генетическую структуру и свойства микроорганизма для создания на основе полученных результатов новейших методов диагностики с учетом всех возможных серовариантов возбудителя, также они имеют большое значение для развития фундаментальной науки и построения филогенетического дерева возбудителей хламидиозов (Эйделыптейн, 2004; Tomic, 2013).
Однако данные методы требуют создания специализированных лабораторий и использования дорогостоящего оборудования, расходных материалов и высококвалифицированных специалистов. В силу определенных обстоятельств, не все ветеринарные лаборатории способны организовать у себя ПНР-лаборатории, и многие хозяйства не могут позволить себе такие дорогостоящие тесты даже при наличии подобной лаборатории. Таким образом, наблюдается потребность в недорогих, высокочувствительных тестах, использование которых не потребует специального оборудования и сможет выполняться ветеринарным специалистом на месте содержания животных.
Разработка подобных тестов для диагностики хламидийной инфекции у сельскохозяйственных и домашних животных является одной из приоритетных задач современной ветеринарии (Бакиров, 2007). Сложности при выполнении этой задачи связаны, в первую очередь, с особенностями жизненного цикла возбудителей хламидиозов.
Известно, что хламидии являются грамотрицательными бактериями и имеют на клеточной поверхности несколько антигенов, например, МОМР, термостабильные пептиды hsp60 и hsp70 (от анг. heat-shock protein), (Zhong, Brunham,1992; Birkelund, 1992; Comanducci et al., 1994; Kawa, Stephens, 2000), Pgp3, детерминируемый третьей рамкой считывания (ORF3) плазмиды, присутствующей в геноме штаммов только С. trachomatis (Birkelund, 1992; Comanducci et al, 1994; Жданов и др., 1996; Морс и др., 1998), родоспецифический термостабильный антиген гликопептидной природы или специфический орнитозный антиген (Nurminen et al.,1983; Sillis et al.,1992). He так давно появились сообщения о появлении новых «шведских» вариантов, nvCT, с делецией в 377 п.н. в гене orfl и вставкой в 44 п.н. в 5 конце гена ог/3 криптической плазмиды. Поскольку на детекцию orfl были нацелены большинство коммерческих ПЦР тест-систем, причем один из праймеров как раз попадал в район делеции, обнаружение nvCT поначалу было проблематичным (Stothard et al, 1998; Ripa, Nilsson, 2006, 2007; Unemo etal.,2007).
Известно две клеточные формы существования возбудителя. В высокоинфекционной форме он представлен не проявляющими метаболической активности элементарными тельцами (ЭТ), а в вегетативной форме - репродуктивными внутриклеточными ретикулярными тельцами (РТ). ЭТ диаметром 0,2 - 0,3 мкм окруженны ригидной малопроницаемой клеточной стенкой, резистентной к факторам внешней среды. Попадая в организм животного, ЭТ прикрепляются к чувствительным клеткам -мишеням (эпителию урогенитального тракта, слизистым оболочкам дыхательной и пищеварительной систем, слизистой зрительного аппарата) (Караваев и др., 1999; Хамадеев и др., 2005; Равилов, 2010; Zhong, 2010; Обухов, 2013; Фомченко, Наконечный, 2013) и поглощаются ими с формированием внутриклеточной вакуоли (т.е. проникают в клетку хозяина путем рецептор-обусловленного эндоцитоза с образованием эндосомы) (Рисунок 2, стадия 1, 2). Через 8-20 часов ЭТ реорганизуются в метаболически активные неинфекционные внутриклеточные формы - РТ (диаметром 0.6-1.5 мкм), пластичные сферические клетки с диффузной укладкой ДНК нуклеоида и обводненным протопластом, содержащим рибосомы. РТ начинают усиленно размножаться путем бинарного деления, используя для этого субстраты клетки-хозяина для синтеза РНК, различных протеинов, так как не способны синтезировать энергетические субстраты -АТФ, ГТФ, являясь, по словам Moulder J.W., "энергетическими паразитами" (Рарра, 2006; Хмылов, 2009; Zhong, 2010) (Рисунок 2, стадия 3).
Известно, что под влиянием неблагоприятных факторов, например, при дефиците питательных веществ, воздействии теплового шока на инфицированные клетки, проведениии неадекватной антибиотикотерапии развитие хламидий может задерживатся на стадии персистенции (Рисунок 2, стадия 4В) на неопределенный период (дни/месяцы). Хламидий трансформируются в L-формы, которые обладают очень слабой способностью к антигенному раздражению иммунокомпетентных клеток и могут длительно находиться в клетке-мишени. При делении инфицированной эпителиальной клетки хламидий передаются дочерним клеткам. Это и приводит к длительной персистенции возбудителя в организме и хроническому течению процесса (Гранитов, 2002; Обухов, Васильев, 2003; Rohdeetal.,2010).
Сравнительное изучение методов фиксации иммуноглобулинов на аналитической мембране
Аналитическая мембрана является основной частью ИХТ, на которой происходит реакция связывания антигена и антитела. В соответствии с рекомендациями некоторых исследователей (Biagini et al., 2006; Челобанов и др., 2007; Shim Won-Bo et al, 2007; Laberman et al., 2008; Krajaejun et al., 2009) и опираясь на собственный опыт использования НЦМ в рамках настоящего исследования, мы остановили выбор на хорошо зарекомендовавших себя НЦМ фирмы BioRad, поскольку в литературе имеются указания на использование НЦМ в качестве аналитической мембраны (Sharma et al, 2005; Biagini et al., 2006; Chen et al, 2009). Параллельно мы проводили их сравнительный анализ с другими видами НЦМ, имеющих ряд положительных отзывов об успешном применении данных мембран для конструирования ИХТ (Любавина и др., 2004; Willis et al, 2009; Jin et al., 2006; Яковлева и др., 2011; Яковлева, 2013). Так, в последующих экспериментах мы использовали полисульфоновую мембрану GE Water & Progress Technologies с размером пор 8,0 микрон, и НЦМ Hi-Flow Plus 90 и Hi-Flow Plus 240. На каждую мембрану наносили контрольную линию с антимышиными Ig. Тест-полоска, опущенная в раствор конъюгата, должна была вбирать жидкость, которая, двигаясь вдоль мембраны, обеспечивает формирование сигнала в виде широкой полосы темно-красного цвета. Как видно на рисунке 16 (А), при использовании НЦМ BioRad иммунозолотой конъюгат продвигался по НЦМ медленно и не смог достигнуть контрольной линии.
На Hi-Flow Plus 240 и полисульфоновой мембране контрольная линия окрашивалась не равномерно и визуально делилась на две линии, а на месте нанесения контрольных Ig наблюдался эффект «прозоны» (Рисунок 16 (В)). В случае применения мембраны Hi-Flow Plus 90 эффекта «раздвоения» не наблюдалось, контрольную линию было видно четко (Рисунок 16 (С)).
Поскольку эффективность ИХТ напрямую зависит от свойств используемого сенситина (Кэтти, 1991), то в первую очередь нами были отработаны варианты связывания контрольных Ig с твердой фазой.
Основываясь на литературных источниках (Фомичева, 1996; Любавина и др., 2005; Wu Jian-xiang et al, 2010) и полученных на предыдущем этапе выполнения диссертационного исследования данных о влиянии на специфичность и чувствительность ДИА различных способов фиксации Ig на НЦМ, мы пришли к выводу, что в зависимости от свойств наносимого на аналитическую мембрану вещества (Ig, антигены) следует использовать различные способы его фиксации на мембране. Это позволило нам выбрать для исследования три основных способа фиксации Ig: при комнатной температуре, при повышенной (+110С+200С) температуре - так называемой термофиксации (Фомичева, 1996), и фиксации в этаноле.
В первом случае на верхнюю треть аналитической мембраны наносили 2 мкл коммерческих антивидовых Ig, оставляли при комнатной температуре на 30 минут или на 24 часа, а затем опускали мембрану нижней частью в рабочее разведение иммунозолотого конъюгата и наблюдали за его движением вверх по аналитической мембране. Как видно на рисунке 17 (А), при фиксации антител на аналитической мембране в течение 30 минут при комнатной температуре границы контрольной линии были не четкие, хотя саму тестовую линию было хорошо видно. Более длительная (24 часа) фиксация при комнатной температуре позволила получить четкую контрольную линию с относительно сильным фоновым окрашиванием, в связи с чем визуализация контрольной линии была возможна, хотя и несколько затруднена (Рисунок 17 (В)).
Результаты фиксации антивидовых иммуноглобулинов на аналитической мембране при комнатной температуре в течение 30 минут (А) и 24 часов (В); М.Н. - место нанесения антивидовых иммуноглобулинов Во втором случае мы использовали метод термофиксации, наиболее часто применяемый в ДИА (Банникова, 2004). На аналитическую мембрану наносили антивидовые Ig, а затем фиксировали их в сухожаровом шкафу при +110С или при +200С в течение 10 минут. Как видно на рисунке 20 (А), термофиксация при температуре +110С не обеспечивала четкость контрольной линии, фоновое окрашивание самой аналитической мембраны было неравномерным. Также следует отметить, что пластиковая основа деформировалась. После того как мы увеличили температуру фиксации до +200С без изменений продолжительности термофиксации (10 минут) цвет линии с Ig изменился на желтый, и последующее инкубирование теста с иммунозолотым конъюгатом этого не изменило (Рисунок 18 (В)). Судя по всему, высокая температура, возможно, нарушила структуру аналитической мембраны так, что меченные золотом Ig не смогли не только достигнуть контрольной линии, но даже войти в мембрану, поскольку не наблюдалось даже минимального фонового окрацивания. Следует отметить, что несущая пластиковая подкладка под мембрану также значительно деформировалась.
