Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1. Иммуногенетические методы 10
1.1.1. Группы крови овец 10
1.1.2. Генетическая экспертиза достоверности происхождения племенного молодняка 16
1.1.3 Генофонд и генетическая дифференциация различных пород овец по группам крови 20
1.1.4. Генетические маркеры продуктивных признаков сельскохозяйственных животных 31
1.1.5. Подбор родительских пар с учетом иммуногенетиче-ских и иммуннобиологическях параметров 3 8
1.1.6. Иммуногенетические аспекты трансплантации эмбрионов 46
1.2. Молекулярно - генетические методы 50
1.2.1. Методы исследования полиморфизма ДНК 50
1.2.2. Селекция на основе молекулярных маркеров 62
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 67
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 79
3.1. Изготовление иммунодиагностикумов для выявления групп крови у овец 79
3,2. Генофонд и межпородная дифференциация тонкорунных и полутонкорунных пород овец Юга России по группам крови 98
3.2.1. Генофонд тонкорунных пород овец 98
3.2.2. Полиморфизм гена р-лактоглобулина у овец кавказ- * ской породы 108
3.2.3. Межпородная дифференциация тонкорунных пород 110 овец
3.2.4. Генофонд полутонкорунных пород овец 121
3.2.5. Межпородная дифференциация полутонкорунных по- 124 род овец
3.2.6. Межпородная дифференциация тонкорунных и полутонкорунных пород овец 126
3.3. Молекулярно-генетические маркеры признаков продуктивности 131
3.3.1. Продуктивные признаки овец тонкорунных пород с учетом групп крови 132
3.3.2. Продуктивные признаки овец кавказской породы с учетом аллельных вариантов р-лактоглобулина 139
3.4. Подбор родительских пар по генетическим параметрам крови 142
3.5. Эффективность трансплантации эмбрионов в зависимости от генетических параметров крови овец доноров и реципиентов 159
3.6. Достоверность происхождения племенного молодняка 163
3.7. Экономическая эффективность использования молекулярно-генетических методов в овцеводстве 167
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 172
Заключение 213
Выводы 218
Предложения Производству 220
Список литературы 221
Приложения 250
- Генетическая экспертиза достоверности происхождения племенного молодняка
- МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
- Изготовление иммунодиагностикумов для выявления групп крови у овец
Введение к работе
Актуальность темы. Традиционные методы оценки сельскохозяйственных животных, основанные на анализе морфофизиологических и фенотипических признаков, на современном этапе не могут в полной мере удовлетворить требованиям, предъявляемым к селекции. В связи с этим, одной из главных проблем биотехнологии является установление и использование молекулярно-генетических маркеров различных хозяйственно-ценных признаков сельскохозяйственных животных. Преимущество генетических маркирующих тест-систем заключается в том, что они неизменяемы в онтогенезе, независимы от условий внешней среды, имеют кодоминантный характер наследования (В.Н.Тихонов, 1991; САКазановский, 1991; ЛА.Калашникова, 1997; Н.С.Марзанов, 1991, 2002).
Особо актуальным является исследование полиморфизма генетических систем крови, используемое для совершенствования биотехнологии воспроизводства животных.
В теоретическом аспекте оно важно для исследования генофонда различных пород и популяций, установления их генетической структуры и оценки сходства и различий, определения происхождения и эволюции под воздействием условий среды и селекционного давления.
Практическая значимость таких исследований состоит в том, что они, с учетом достижений молекулярной генетики, позволяют решать целый ряд биотехнологических прикладных задач селекции: выявление генетических маркеров, связанных с физиологическими и биохимическими процессами в организме и сопряженных с высокой продуктивностью животного; прогнозирование результатов отбора и подбора по генетическим параметрам крови; проведение генетической экспертизы достоверности происхождения племенного молодняка (А.М.Машуров, 1987; Н.О.Сухова, 1987,2002; ААНовиков, 2001).
Несмотря на очевидные преимущества, методы селекции на основе молеку-лярно-генетических показателей в практике овцеводства используются не в полной мере, в то время как такая проблема весьма актуальна в связи с тем, что овцеводство является одной из важных отраслей животноводства России. Особую значимость эти исследования приобретают на Юге России, поскольку в данном регионе находится более 70 % племенных заводов РФ по разведению тонкорунных и полутонкорунных овец. Исследованиями САКазановского (1983; 1987) и Н.СМарзанова (1981;1984) было начато определение генетической структуры пород овец Юга России. Однако до настоящего времени эта проблема остается недостаточно изученной. В'то же'время"без"объйоивной информации ос гено-
L_ I
фонде овец не представляется возможным судить об особенностях их происхождения и филогенетических взаимоотношений, микроэволюционных процессах, происходящих в них.
Цель и задачи исследований. Целью исследований явилось установление генофонда основных пород овец Юга России по группам крови и использование молекулярно-генетических маркеров в совершенствовании биотехнологии их воспроизводства и селекции.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи как отдельные этапы решения проблемы в целом:
разработать биотехнологию изготовления иммунодиагностикумов для определения групп крови у овец;
изучить генетический полиморфизм эритроцитарных антигенов и гена /?-лактоглобулина у овец тонкорунных и полутонкорунных пород Юга России, провести оценку их генетической структуры на основе популяционно-генетических параметров;
- изучить межпородную дифференциацию, характер филогенетических
взаимосвязей и динамику микроэволюционных процессов в популяциях тонко
рунных и полутонкорунных пород овец;
усовершенствовать биотехнологию трансплантации эмбрионов у овец с учетом генетических параметров крови овец-доноров и реципиентов;
разработать биотехнологические приемы интенсификации селекции и воспроизводства овец с использованием генетических маркеров высокой продуктивности и оптимальных вариантов подбора родительских пар по группам крови.
Научная новизна. Впервые разработана оптимальная биотехнология изготовления моноспецифических сывороток и создан единственный в РФ банк иммунодиагностикумов для определения групп крови у овец.
Впервые установлен генофонд тонкорунных и полутонкорунных пород овец Юга России по шести генетическим системам групп крови и проведена оценка их генетической структуры, межпородной дифференциации, филогенетических взаимосвязей и микроэволюционных процессов.
Впервые определены генетические маркеры высокой продуктивности у овец тонкорунных пород и на их основе разработаны новые приемы подбора родительских пар.
Усовершенствована биотехнология трансплантации ранних эмбрионов с учетом генетических параметров крови овец-доноров эмбрионов и реципиентов;
5 доказана возможность использования групп крови для повышения эффективности этого биотехнологического приема.
Изучены теоретические аспекты, разработаны и предложены приемы усовершенствования биотехнологии воспроизводства и селекции овец Юга России на основе молекулярно-генетических методов.
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты исследований позволили установить генофонд по группам крови основных пород овец, разводимых на Юге России, изучить их филогенез, межпородную дифференциацию, а также направленность микроэволюционных процессов в них. Использование комплекса иммуно- и молекулярно-генетических методов позволило усовершенствовать селекцию и биотехнологию воспроизводства овец.
Определены рациональные схемы использования овец донорского стада (доноров, реципиентов), предложены оптимальные режимы проведения абсорбции поливалентных сывороток. Разработана нормативно-техническая документация на изготовление и применение иммунодиагностикумов для выявления, групп крови у овец (ТУ, наставление по применению иммунодиагностикумов, утвержденные Департаментом животноводства и племенного дела РФ, 2004 г.).
Материалы исследований позволили выявить маркеры высокой шерстной продуктивности у овец тонкорунных пород и рекомендовать для практической селекции метод отбора животных желательного генотипа и прогнозирования их продуктивности в раннем возрасте, а также метод подбора родительских пар по генетическим параметрам крови.
Созданный банк иммунодиагностикумов позволил ввести в практику овцеводства Юга России (27 племенных заводов) метод экспертизы достоверности происхождения племенного молодняка. Аттестовано более 17 тыс. овец и проведена генетическая экспертиза достоверности происхождения более 5 тыс. голов племенного молодняка. На животных с подтвержденной родословной оформлены индивидуальные иммуногенетические паспорта. Существенно расширены возможности практической селекции и биотехнологии овец в овцеводческих хозяйствах Ставропольского края, Ростовской области, в Республиках Карачаево-Черкесия, Калмыкия и Дагестан. Использование методов отбора высокоценных овец по генетическим маркерам крови, подбора родительских пар и генетической экспертизы достоверности происхождения позволило повысить уровень селекционно-племенной работы в овцеводстве, увеличить продуктивность животных и повысить рентабельность овцеводства на 10 - 15 %.
Основные научные положения и практические предложения вошли в «Методические указания по нормам и правилам генетического тестирования овец»
(ВНИИОК, Ставрополь, 1998); «Методические указания по применению имму-ногенетического анализа в селекции овец, коз» (ВНИИОК, Ставрополь, 2001); «Методические рекомендации по подбору родительских пар с учетом генетических параметров крови овец и коз» (СНИИЖК, Ставрополь-Москва, 2003), монографии "Иммуногенетика в селекции овец", 2004; "Биотехнология воспроизводства овец и коз", 2004.
Апробация полученных результатов. Основные научные положения диссертации доложены на ежегодных заседаниях ученого совета ВНИИОК и СНИИЖК 1996-2003 гг.; I научно-практической конференции по биотехнологии Северо-Кавказского региона, Ставрополь (1995), Всероссийских конференциях по биотехнологии, Ставрополь (1996, 1999, 2001), Сочи (2003); на межвузовской научной конференции Ставропольского ГСХА (1997); на координационном совещании и научно-практических конференциях по овцеводству и козоводству, Ставрополь (1995, 1999); на Международной конференции памяти Ф. Ф. Эйсне-ра, Харьков (1996); на Международной научно-практической конференции, Ставрополь-Пятигорск (2003).
Публикации. Основные положения диссертации изложены в 30 научных работах, опубликованных в научных изданиях, в том числе в ведущих рецензируемых журналах, в материалах международных и всероссийских конференций.
На защиту выносятся следующие положения диссертации:
- биотехнология изготовления иммунодиагностикумов для' определения
групп крови у овец;
оценка генетической структуры, межпородной дифференциации, филогенеза и микроэволюции в популяциях овец тонкорунных и полутонкорунных пород Юга России;
выявление генетических маркеров, детерминирующих некоторые хозяйственно-ценные признаки овец;
использование метода оптимального подбора родительских пар по генетическим параметрам крови для интенсификации биотехнологии воспроизводства и селекции овец;
усовершенствование биотехнологии трансплантации ранних эмбрионов на основе использования генетических параметров крови овец - доноров и реципиентов;
обоснование применения молекулярно-генетических методов для усовершенствования биотехнологии воспроизводства и селекции тонкорунных и полутонкорунных пород овец Юга России.
7 Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 250 страницах
машинописного текста, иллюстрирована 43 таблицами и 23 рисунками. Диссертация включает следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты исследований, обсуждение результатов исследований, заключение, выводы, предложения производству и список литературы, включающий 197 работ отечественных и 78 зарубежных авторов.
Генетическая экспертиза достоверности происхождения племенного молодняка
Существующая технология искусственного осеменения в овцеводстве предполагает для выборки маток в охоте использование баранов-пробников. Несмотря на то, что в период выборки применяются необходимые меры для предупреждения спаривания пробников с матками, тем не менее, не исключается возможность получения приплода от малоценных баранов-пробников. Между тем, неконтролируемый процесс воспроизводства практически сводит на нет все преимущества искусственного осеменения в деле успешного ведения целенаправленной селекции.
С расширением исследований по изучению групп крови овец и установления закономерностей их наследования стало реальным проведение генетической экспертизы достоверности происхождения племенного молодняка (С.А.Казановский и соавт., 1982).
В настоящее время достоверность происхождения потомства, определяется путем проведения гемолитического теста путем сопоставления антигенных характеристик отца, матери, потомка
Исключение ложного отцовства, материнства носит абсолютный характер. Если у потомка обнаруживается аллель, отсутствующий как у предполагаемой матери, так и у отца, то его происхождение является недостоверным, а представленная запись племенного учета — ошибочной.
Наличие неправильных записей в родословных племенных животных отмечается в исследованиях как отечественных, так и зарубежных ученых. Так, используя иммуногенетический метод определения достоверности происхождения D.O.Schmid (1972) обнаружил у овец, разводимых в Баварии, 16% недостоверных племенных записей.
Материалы и методы исследований
Исследования проводились в период с 1996 по 2003 гг. в лабораториях иммуногенетики и воспроизводства Всероссийского НИИ овцеводства и козоводства, в последующем Ставропольского НИИ животноводства и кормопроизводства, на опытной станции института, а также в ведущих племенных заводах Ставропольского, Краснодарского краев, Ростовской, Астраханской областей, республик Карачаево-Черкесии, Кабардино-Балкарии, Калмыкии и Дагестана. Объектом для исследований служили клинически здоровые овцы различных пород.Изготовление иммунодиагностикумов для выявления групп крови у овец. Эксперименты проводили на животных донорского стада опытной станции института. В шести циклах иммунизации и трех циклах реимуниза ции в период с 1997 по 2002 гг. было использовано 252 животных, из них 54 донора и Для получения иммунных сывороток проводили направленную изоим ХЩ мунизацию. С этой целью составлялись схемы иммунизации, включающие индивидуальный подбор доноров к реципиентам. При этом следовали основному правилу, которое заключается в том, у реципиента могут образовываться антитела на те антигены, которые у него отсутствуют, но присутст 68 вуют на эритроцитах донора. При составлении схем иммунизации исходили из того, что между антигенным составом эритроцитов донора и антигенным составом реципиента было минимальное отличие (1 — 2 антигена) (табл. 6). Обычно к одному донору подбиралось 2 — 3 реципиента.
Изготовление иммунодиагностикумов для выявления групп крови у овец
Первым и необходимым условием проведения исследований по имму-ногенетике овец является наличие моноспецифических реагентов иммунодиагностикумов — для выявления групп крови. В связи с этим особого внимания заслуживают методы их изготовления. Получение иммунных сывороток (реагентов) проводилось согласно схеме, представленной на рисунке 5. Иммунизация. При формировании иммунного ответа существенную роль играет периодичность и кратность иммунизации.
В связи с этим целью исследований явилось изучение влияния кратности введения эритроцитарных антигенов на активность иммунных сывороток.
В четырех сериях иммунизации было использовано 124 животных донорского стада: 28 доноров, 96 реципиентов. Реципиентам внутримышечной инъекцией вводили 10 мл 40 % взвеси эритроцитов с интервалом 7 дней. Перед каждой последующей инъекцией антигена от реципиентов получали сыворотку для выявления антител и их титра.
Полученные результаты позволили установить, что введение реципиентам антигенов эритроцитов доноров сопровождалось выраженной иммунологической перестройкой с продуцированием иммунных антител. Иммунологическая реактивность реципиентов изменялась в процессе цикла имму-низаторного воздействия.
У большей части животных - 66,6% уже после первой инъекции выявлялись антитела с титром 1:2...1:16. Процесс антителообразования достигал максимума после третьей и четвертой иммунизации. К этому моменту у 63,5% реципиентов отмечалось повышение титра антител в сыворотке доДальнейшее введение антигенов эритроцитов не приводило к возрастанию гемолизинов, а в отдельных случаях приводило к снижению их количества
