Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРОБИОТИЧЕСКОГО ПРОИЗВОДСТВА 11
1.1. Развитие пробиотического направления в микробиологии 11
1.2. Требования, предъявляемые к выбору производственных штаммов.. 15
1.3. Развитие и перспективы биотехнологического производства пробиотиков 34
1.4. Критерии оценки качества пробиотиков и разработка методов их контроля 40
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 44
2.1. Объекты исследования 44
2.2. Питательные среды и растворы 45
2.3. Методы исследования 51
2.3.1. Определение количества жизнеспособных клеток (КОЕ/мл) 51
2.3.2. Определение антагонистической активности 52
2.3.3. Определение активности кислотообразования 54
2.3.4. Определение равномерности разлива препарата 54
2.4. Статистическая обработка результатов 54
Глава 3. УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СОСТАВА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВЕННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БИФИДОБАКТЕРИИ И
ЛАКТОБАЦИЛЛ v 56
3.1. Оптимизация состава питательных сред для производственного
культивирования лактобацилл 56
3.1 1. Выбор питательной среды для выращивания производственной биомассы лактобацилл 56
3.1.2. Оценка влияния вносимых изменений в состав среды МРС-1 на ее ростовые свойства 58
3.1.3. Оптимизация состава питательной среды для реакторного культивирования лактобацилл 59
3.2. Усовершенствование состава питательных сред для производственного культивирования бифидобактерий 62
3.2.1. Оценка влияния вносимых изменений в состав среды Блаурокка на ее ростовые свойства 62
3.2.2. Оптимизация состава питательной среды КД-5 для выращивания производствейной биомассы бифидобактерий 65
Глава 4. УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СОСТАВА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА ПРОБИОТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ И ПРОДУКТОВ 70
4.1. Выбор селективных компонентов для оптимизации контрольных питательных сред при определении числа живых бифидобактерий в смешанных культурах 70
4.1.1. Изучение действия налидиксовой кислоты на бифидобактерий и кишечную палочку 70
4.1.2. Оценка селективного действия антибиотиков на бифидобактерий, лактобациллы и термофильные стрептококки в монокультуре и в ассоциациях 76
4.2. Оптимизация методов лабораторного контроля количества жизнеспособных клеток стартерных культур в бифидосодержащих ферментированных кисломолочных продуктах 87
4.2.1. Выбор питательных сред для культивирования и контроля количества жизнеспособных клеток производственных штаммов закваски АТВ-5 в монокультуре 88
4.2.2. Оптимизация состава дифференциальной питательной среды для культивирования и контроля количества жизнеспособных клеток производственных штаммов закваски АТВ-5 90
Глава 5. ПРИМЕНЕНИЕ УНИТИОЛА ДЛЯ СТАБИЛИЗАЦИИ МИКРОБНЫХ БИОМАСС 97
5.1. Изучение бактерицидных и бактериостатических свойств унитиола
на бифидобактерий, лактобациллы и кишечную палочку 97
5.2. Оценка стабилизирующего действия унитиола на бактериальные
биомассы бифидобактерий, лактобацилл и кишечных палочек при
их хранении в разных температурных интервалах 99
5.3. Влияние унитиола на сохранность бифидобактерий 106
5.4. Изучение длительности хранения полуфабрикатов препаратов Бифидумбактерина сухого и Бификола сухого с добавлением унитиола 110
5.5. Оценка возможности применения питательной среды Блаурокка с унитиолом для контроля количества жизнеспособных бифидобактерий и их последующего длительного хранения 112
Глава б. ИЗУЧЕНИЕ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
ЛАКТОБАЦИЛЛ И БИФИДОБАКТЕРИЙ И ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДОВ ЕЕ
ОПРЕДЕЛЕНИЯ 118
6.1. Сравнительная характеристика прямого антагонизма и контрантагонистической резистентности производственных штаммов и свежевыдеденных культур лактобацилл 118
6.2. Сравнительное изучение изоантагонистических и гомо-антагонистических свойств производственных штаммов и свежевыделецных лактобацилл 125
6.3. Оптимизация методов исследования антагонистической активности бифидобактерий в смешанных культурах 132
6.4. Сравнительное изучение уровня антагонистической активности бифидобактерий при их совместном культивировании с шигеллами.. 138
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 157
ВЫВОДЫ 174
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 176
ПРИЛОЖЕНИЕ 207
- Развитие пробиотического направления в микробиологии
- Питательные среды и растворы
- Выбор питательной среды для выращивания производственной биомассы лактобацилл
Введение к работе
Актуальность проблемы. В последние годы на Российском рынке появилось много пробиотических препаратов и БАДов на основе живых микроорганизмов. Характеристика их эффективности представлена в большом потоке научных публикаций (Нисевич Н.И. с соавт., 1999; Лыкова Е.А. с соавт., 2003; Pereira D.I.A. et al, 2002).
Наиболее часто в бактериотерапии, а также при производстве БАДов и продуктов функционального питания используют бифидобактерии и лактобациллы. Эти пробиотики называют классическими, так как их активным началом являются штаммы, выделенные из кишечника человека и доминирующие в нем с первых дней жизни (Sperti G.S., 1971; Hatakka К. et al., 2001). Кроме того, именно лактобациллам и бифидобактериям присуща способность к колонизации эпителиальных тканей (Коршунов В.М. с соавт., 1999; Чумаева Т.В. с соавт., 2002; Jacobsen C.N. et al., 1999; Tuomola E. et al., 2001).
Рекомендованные к применению стандартные рецептуры питательных сред для культивирования производственных штаммов бифидобактерии и лактобацилл, как правило, требуют дополнительной корректировки для придания им желаемых ростовых свойств. Поэтому важной задачей в процессе оптимизации питательных сред является не только выбор доступного и недорогого сырья и полуфабрикатов, но и получение на их основе высококачественных и конкурентоспособных пробиотиков (Блинов Н.П., 1995; Абрамов Н.А. с соавт., 1996; Терновская Л.Н. с соавт., 1996; Андреева М.А. с соавт., 1998).
В процессе биотехнологического производства пробиотических препаратов и продуктов на основе лактобацилл и бифидобактерии значимое место отводится разработке методов поддержания стабильности высококонцентрированных
микробных биомасс (Ильницкая И.Ю. с соавт., 1986; Несчисляев В.А., 1996; Новик Г.Н. с соавт., 1998; Мурашова А.О. с соавт., 2000). Эта проблема в настоящее время очень актуальна, так как этап лиофилизации все еще является дорогостоящим и энергоемким процессом на многих производствах. Поэтому поиску альтернативных путей поддержания стабильности микробных биомасс всегда уделяется особое внимание.
Важное значение на предприятиях биотехнологического производства имеет контроль готовой продукции (Чупринина Р.П. с соавт., 1991; Рыбачок А.В., 1995; Мохов Д.А. с соавт., 2002). Методы микробиологического контроля разнообразной лакто- и бифидосодержащей пробиотической продукции довольно часто трудоемки, требуют специального оборудования, дорогостоящих питательных сред и реактивов, а результаты такого контроля не всегда дают точную информацию. Хотя в последние годы появился ряд новых предложений по их оптимизации (Ганина В.И. с соавт., 1999; Мурашова А.О., 2000; Несчисляев В.А. с соавт., 2002; Арчакова Е.Г., 2004), необходимость разработки новых более совершенных и доступных методов контроля не вызывает сомнений.
Для препаратов, выпускаемых на основе давно известных производственных штаммов, часто возникает проблема постепенного снижения уровня их антагонистической активности, что в конечном итоге отражается на лечебно-профилактической эффективности пробиотика. Таким образом, необходим поиск пути увеличения антагонистической активности подобных штаммов.
Все вышеизложенное свидетельствует о том, что, несмотря на уже имеющиеся достижения в области биотехнологии пробиотиков, задача ее дальнейшего совершенствования остается чрезвычайно актуальной.
7 Цель работы: Цель настоящей работы состояла в усовершенствовании состава
питательных сред для культивирования бифидобактерий и лактобацилл и контроля
качества пробиотических препаратов; изыскании способов стабилизации
бактериальных биомасс и путей повышения уровня антагонистической активности
производственных штаммов.
Задачи исследования:
Оптимизация состава питательных сред для культивирования производственных штаммов Lactobacillus plantaram 8Р-АЗ и Bifidobacterium bifidum 1 и их производственных биомасс.
Усовершенствование лабораторного контроля и разработка селективных сред для количественного учета бифидобактерий в комплексных пробиотических препаратах и молочнокислых заквасках.
3. Изыскание доступных способов стабилизации микробных биомасс и
полуфабрикатов.
Оценка значимости'применения набора методов определения антагонистической активности бифидобактерий и лактобацилл при отборе перспективных производственных штаммов.
Поиск путей повышения уровня антагонистической активности производственных штаммов бифидобактерий.
Научная новизна исследования. Доказана прямая зависимость антагонистической активности и уровня кислотообразования, которая присуща только пробиотическим штаммам лактобацилл.
Предложена методика определения контрантагонистической резистентности бифидобактерий (обратного антагонизма) в смешанных культурах.
**
8 Показано, что антагонистическая активность бифидобактерий повышается в
процессе их совместного культивирования с шигеллами.
Обнаружено, что тиосодержащие органические соединения, способные
замедлять окислительные процессы, в частности, унитиол, способны пролонгировать
сохранность бифидобактерий.
Практическая значимость работы. Усовершенствован состав питательных сред
МРС-1, КД-5, среды Блаурокка и казеиново-дрожжевой среды для выращивания
производственных штаммов бифидобактерий и лактобацилл, лежащих в основе
производства Бифидумбактерина сухого и Лактобактерина сухого. Их прописи
включены в нормативную производственную документацию предприятия
СПбНИИВС (РП № 1547-04 на Бифинорм Бифидумбактерин сухой и РП № 46-96 на
Лактобактерин сухой и ФСП 42-0022-5808-04 на Бифинорм Бифидумбактерин
сухой). Разработан состав среды для селективного выделения бифидобактерий из их смеси с энтеробактериями, которая позволяет выполнить контроль специфической активности препарата Бификол сухой. Оптимизирован состав питательной среды для дифференциации лактобактерий и термофильного стрептококка на основе рецептуры коммерческого продукта фирмы Hi Media из отечественных полуфабрикатов и реактивов. Предложено использование унитиола для стабилизации биомасс бифидобактерий и полуфабрикатов на их основе. Дана оценка целесообразности проведения комплекса методов по контролю антагонистической активности лактобацилл и бифидобактерий, перспективных в качестве производственных штаммов. Предложен метод определения контрантагонистической резистентности бифидобактерий (обратного антагонизма) в смешанных культурах с использованием налидиксовой кислоты. Изложены результаты селекционной работы с целью
9 повышения уровня антагонистической активности исходного производственного
штамма Bifidobacterium bifidum 1 при использовании метода его совместного
культивирования с энтеробактериями.
Основные положения, выносимые на защиту:
Предложен комплекс питательных сред на основе полуфабрикатов собственного производства, оптимизирующий процесс производства и контроля качества бифидо- и лактосодержащих пробиотических препаратов.
Применение унитиола для стабилизации биомассы бифидобактерий достоверно увеличивает сохранность первоначальной концентрации живых микробных клеток в интервале температур от 2 до 20 С.
Изменение уровня антагонистической активности исходного производственного штамма бифидобактерий Bifidobacterium bifidum 1 может быть достигнуто в процессе его пассирования в микст-культурах с тест-штаммами шигелл. Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ. Основные положения работы доложены на юбилейной научно-технической конференции ГосНИИ ОЧБ (Санкт-Петербург, 2000), Всероссийской научной конференции молодых ученых (Уфа, 2004), 2-й Международной конференции «Наука - Бизнес - Образование; Биотехнология - Биомедицина - Окружающая среда» (Пущино, 2005) и на заседании общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов НИИ им. Пастера (Санкт-Петербург, 2005).
Развитие пробиотического направления в микробиологии
Термин «пробиотик», означающий «для жизни», произошел из греческого языка. Он впервые был использован Lilly и Stillwell в 1965 г для описания «субстанций, выделяемых одним микроорганизмом, который стимулирует рост других» и, таким образом, был противоположен термину «антибиотик». Parker (1974 г) первым использовал термин «пробиотик» в том значении, которое мы используем сегодня. Он определил пробиотики как «организмы или субстанции, которые способствуют кишечному микробному балансу». Salminen и Schaasfsma расширили определение пробиотиков, отметив кратковременный, ограниченный оздоравливающий эффект, оказывающий влияние на индигенную микрофлору (189, 194).
По мнению Б.А. Шендерова (112), справедливо внесшего некоторые уточнения в определение понятия пробиотика, это «живые микроорганизмы и вещества микробного или иного происхождения, оказывающие при естественном способе введения благоприятные эффекты на физиологические функции, биохимические и поведенческие реакции организма хозяина через оптимизацию его микроэкологического статуса».
Оздоравливающие эффекты, связанные с приемом пробиотиков, многочисленны. Экспериментально доказаны: 1) низкая частота и уменьшение продолжительности диареи, ассоциированной с антибиотиками, ротавирусной инфекцией, химиотерапией и, в меньшей степени, с «диареей путешественников»;
2) стимуляция гуморального и клеточного иммунитета; 3) уменьшение накопления патогенных метаболитов в кишечнике, например, аммония и проканцерогенных энзимов.
В России наряду с термином «пробиотики» до настоящего времени нередко используют термин «эубиотики», предложенный в свое время немецкими учеными. Чаще всего последним обозначают фармакопейные бактерийные препараты из живых лиофильно высушенных микроорганизмов, предназначенные для коррекции микрофлоры хозяина (например, Бифидумбактерин сухой, Лактобактерин сухой, Бификол и др.) (И2); Однако по своей сути эубиотики, согласно определению, следует рассматривать как частную разновидность пробиотиков. В зарубежной литературе в последние годы термин «эубиотики» практически не используется.
Пробиотики могут содержать не только представителей одного вида бактерий (монопробиотики), но и ассоциацию нескольких видов микроорганизмов (от 2 до 30) (так называемые ассоциированные пробиотики). Пробиотики могут назначаться широкому кругу живых организмов (человеку, животным, птицам, рыбам и др.) вне зависимости от видовой принадлежности хозяина, от которого были первоначально выделены штаммы пробиотических бактерий (гетеропробиотики). Наиболее часто пробиотики назначаются представителям того вида животных или человеку, из биоматериала которых были выделены соответствующие штаммы (гомопробиотики). Следует отметить, что в практику начинают внедряться аутопробиотики, действующим началом которых являются штаммы нормальной микрофлоры, изолированные от конкретного индивидуума и предназначенные для коррекции его микроэкологии (113).
Термин «пребиотик» впервые был предложен Gibson G.R. и Roberfroid М.В.
Питательные среды и растворы
Состав питательных сред для культивирования бифидобактерий
Модифицированная среда Блаурокка (по ФС 42-3947-00 на Бифидумбактерин сухой). Печеночный отвар (1:2) с содержанием аминного азота (100 ± 20) мг % -1000 мл;натрия хлорид - 5,0 г; пептон ферментативный сухой (ГОСТ 13805-76) -10,0 г; лактоза (ТУ 6-09-2293-79) - 10,0 г; L-цистин (ТУ 6-09-3252-80) - 0,1 г; агар микробиологический 0,75 г; рН 7,2 ± 0,2; стерилизация: 121 С 30 мин. Кукурузно-лактозная среда (по МУК 4.2.577-96).
В небольшом количестве дистиллированной воды расплавляют агар в количестве 2,5 г на 1,0 дм3 приготовляемой среды. К остальному количеству дистиллированной воды добавляют пептона 10 г, водного раствора кукурузного экстракта 40,0 см3, разбавленного 1:6, натрия лимоннокислого трехзамещенного 6 г, магния сернокислого 0,12 г, калия фосфорнокислого двузамещенного 2 г. Смесь нагревают до температуры (80+2) С, после чего соединяют с расплавленным агаром, добавляют лактозы 10 г и солянокислого цистина 0,15 г или аскорбиновой кислоты 0,5 г. Цистин предварительно растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, в которой устанавливают активную кислотность (8,4+0,1) ед рН с помощью 10%-ного раствора NaOH и нагревают на водяной бане до полного его растворения. Смесь доливают горячей дистиллированной водой до заданного объема и устанавливают активную кислотность среды (7+0,1) ед рН с помощью 40%-ного раствора NaOH или 25%-ного раствора аммиака. Среду стерилизуют при (112+1) С в течение (30+1) мин. Гидролизатно-молочная среда (ГМС) (по МУК 4.2.577-96). Гидролизованное молоко:
Обычное или восстановленное обезжиренное молоко (обрат) доводят до кипения и кипятят (2+1) мин, охлаждают до (14+1)С, устанавливают активную кислотность (7,8+0,1) ед рН 10-20%-ным раствором NaOH.
Добавляют панкреатин из расчета 1 г/дм3, предварительно разведенный в небольшом количестве нагретой до 44 С воды, размешивают, ставят в термостат и выдерживают при температуре (40+1) С под ватной пробкой. В течение первых 2-х часов перемешивание и коррекции активной кислотности до (7,8+0,1) ед рН проводят каждые (30+1) мин, в следующие 2 часа - через каждый час. Через 4 часа от начала гидролиза к смеси добавляют 1-2% хлороформа, закрывают резиновой или корковой пробкой и снова ставят в термостат. В течение первых часов молоко несколько раз перемешивают (пробку после встряхивания прокалывают для удаления паров хлороформа). Через 4 часа доводят активную кислотность до (4,3+0,1) ед. рН 30%-ным раствором уксусной кислоты, кипятят, помешивая, в течение (15+1) мин, фильтруют через бумажный фильтр. Готовый гидролизат должен содержать 200-300 мг/% аминного азота. Хранят гидролизат под хлороформом (1% к объему) при температуре от 4 до 6С.
class3 УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СОСТАВА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВЕННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БИФИДОБАКТЕРИИ И
ЛАКТОБАЦИЛЛ class3
Выбор питательной среды для выращивания производственной биомассы лактобацилл
Для выращивания биомассы лактобацилл на ряде промышленных предприятий используются различные питательные среды на основе натурального животного и растительного сырья (Калинина Т.Э., 1995; Чешева В.В., Манвелова М.А., 1996; Конькова Н.К., 2002). При выборе оптимального варианта питательной среды для культивирования производственных штаммов лактобацилл в бутылях нами были использованы несколько вариантов питательных сред, наиболее часто применяемых для выращивания лаіктобактерий. Посевной материал - 24-часовые культуры лактобактерий, выращенные на среде МРС-1, посевная доза - 1%, время и температура инкубации — 24 ч, 37 С.
В ходе анализа полученных результатов было выявлено, что два варианта питательных сред - МРС-1 и КД-5 обеспечивали достоверно лучшие (t = 52,3» t 0д) показатели роста микробных клеток для всех штаммов лактобацилл по сравнению с остальными питательными средами. На синтетической среде 58 А была получена самая низкая концентрация клеточной биомассы всех штаммов (на 2 - 2,5 порядка ниже, чем на среде МРС-1). Немногим выше оказались результаты культивирования
