Введение к работе
Актуальность темы. Последнее десятилетие характеризуется продолжающимися крупными эпидемиями и вспышками холеры, в основном, в странах Африки и Азии. Между тем, крупная вспышка холеры, возникшая на Гаити в 2010 г., говорит о том, что данная инфекция не имеет континентальных границ. Неблагополучная эпидемиологическая обстановка в мире усугубляется межконтинентальными, меж- и внутригосударственными заносами инфекции (Онищенко и др., 2011). В странах СНГ, в том числе в России, эпидемиологическая ситуация оценивается как неустойчивая и нестабильная. Это обусловлено регистрацией заносных случаев и ежегодной изоляцией холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп из объектов окружающей среды (Ломов и др., 2006).
Эпидемиологическая обстановка по холере в России на данный момент обусловлена завозами инфекции из-за рубежа, что связано с миграцией населения, установлением регулярных туристических, экономических связей с зарубежными странами, неблагополучными по этой инфекции (Москвитина, 2008; Онищенко и др., 2007; 2011).
Наиболее эффективными средствами профилактики холеры являются медицинские иммунобиологические препараты (Кутырев и др., 2006). В 2001 году в России вакцинация против холеры была включена в календарь профилактических прививок по эпидемическим показаниям.
Отечественная холерная бивалентная химическая вакцина, разработанная в РосНИПЧИ «Микроб» и содержащая основные протективные антигены Vibrio cholerae О1 классического биовара: холероген-анатоксин, а также О1 антиген сероваров Инаба и Огава не уступает по эффективности зарубежным холерным вакцинам (Кутырев и др., 2006; Щуковская и др., 2009).
Одним из основных этапов получения вакцин является процесс культивирования микроорганизмов. В производстве российской холерной вакцины используются морально устаревшие ферментеры вместимостью 0,5 м3, практически исчерпавшие свой технологический ресурс.
Развитие микробиологической биотехнологии на современном этапе невозможно без совершенствования ферментационной аппаратуры. В промышленности, отмечается существенное отставание технологического уровня производственных мощностей (Распоряжение Правительства РФ…, 2010), в том числе аппаратурного обеспечения ферментационных процессов. Таким образом, проведение исследований по разработке и конструированию экспериментального образца ферментера пригодного для глубинного управляемого, стандартизированного культивирования производственных штаммов холерного вибриона в производстве вакцины холерной бивалентной химической таблетированной является актуальной научно-практической и прикладной задачей.
К недостаткам существующей технологии производства отечественной холерной химической вакцины можно отнести также многоступенчатые и затратные этапы выделения нативных антигенов.
В 90-х годах была показана принципиальная возможность концентрирования и очистки О-антигена (О-АГ) холерного вибриона с использованием ультрафильтрации на полых волокнах (Громова и др., 1999), что позволило разработать масштабируемую технологию концентрирования одного из компонентов холерной химической таблетированной вакцины – О-АГ холерного вибриона штамма М41 серовара Огава с использованием ультрафильтрационных модулей на полых волокнах (Дятлов и др., 2001; Нижегородцев, 2003).
Выделение второго компонента вакцины – О-АГ и холерогена-анатоксина (ХА) холерного вибриона штамма 569В серовара Инаба осуществляется осаждением сульфатом аммония непосредственно из безмикробного детоксицированного центрифугата, что приводит к значительному расходу осадителя.
Одним из перспективных направлений, применяемых в технологиях производства химических вакцин, является концентрирование нативных антигенов тангенциальной ультрафильтрацией. Использование мембранных модулей с разными номинальными отсечками по молекулярной массе (НОММ) позволяет концентрировать антигены с различной молекулярной массой, практически без потерь целевого продукта. Таким образом, актуальность научных исследований по разработке экспериментальной технологии концентрирования протективных антигенов штамма V. cholerae 569В серовара Инаба методом тангенциальной ультрафильтрации является очевидной.
В этой связи разработка и конструирование экспериментального образца ферментера пригодного для глубинного управляемого, стандартизированного культивирования производственных штаммов холерного вибриона и создание экспериментальной технологии концентрирования протективных антигенов V. cholerae 569В серовара Инаба является важным и перспективным направлением научных исследований.
Цель работы: усовершенствовать производство вакцины холерной бивалентной химической таблетированной за счет внедрения в производственный процесс сконструированного биореактора и обоснования возможности использования разработанного процесса концентрирования протективных антигенов V. cholerae 569В серовара Инаба.
Задачи исследования:
1. Сконструировать биореактор и провести его апробацию в технологическом процессе производства вакцины.
2. Исследовать процесс глубинного культивирования производственных штаммов холерного вибриона – продуцентов протективных антигенов в разработанном биореакторе.
3. Разработать экспериментальную технологию концентрирования протективных антигенов штамма V. cholerae 569В серовара Инаба методом тангенциальной ультрафильтрации и обосновать предложения по ее внедрению в производство бивалентной химической таблетированной холерной вакцины.
4. Изучить свойства препаратов протективных антигенов холерного вибриона полученных с помощью разработанного ферментационного оборудования и по экспериментальной технологии.
5. Дать сравнительную характеристику свойств экспериментальных серий и коммерческого препарата таблетированной холерной вакцины.
Научная новизна заключается в том, что в ней предложена оригинальная конструкция биореактора, защищенная патентом на полезную модель № 86184 «Ферментационная установка для культивирования микроорганизмов».
Впервые обоснована и разработана экспериментальная технология концентрирования протективных антигенов холерного вибриона тангенциальной ультрафильтрацией; установлено, что наиболее целесообразно проведение технологического процесса концентрирования О-АГ и ХА V. cholerae 569В серовара Инаба с использованием ультрафильтрационных мембран с НОММ, равной 50 кДа.
Научно обоснована и проведена оптимизация технологического процесса концентрирования. Показано, что для интенсификации процесса мембранного концентрирования необходимо его проведение при следующих параметрах: температура – (37±2)0С, давления на входе и выходе фильтрационной установки – (2,5±0,1) и (0,5±0,1) кгс/см2 соответственно.
Определён состав лиофилизированных протективных антигенов V. cholerae 569В серовара Инаба по основным белковым и полисахаридным компонентам, даны сравнительные характеристики нового и традиционного препаратов. В результате сравнительного анализа иммунохимических, физико- и биохимических свойств протективных антигенов полученных по регламентной технологии и с помощью разработанного ферментационного оборудования и по экспериментальной технологии показана их идентичность. Выявлено, что готовая форма вакцины холерной бивалентной химической таблетированной, полученная по разработанной технологии по физико-химическим и иммунобиологическим свойствам соответствуют нормируемым требованиям и не отличается от коммерческого препарата, полученного по регламентной технологии.
Практическая значимость работы заключается в том, что разработанный биореактор был успешно апробирован в технологическом процессе производства вакцины холерной бивалентной химической таблетированной. На биореакторе проведено восемь выращиваний производственных штаммов холерного вибриона. Полуфабрикаты полученных протективных антигенов соответствовали требованиям нормативной документации.
С учетом конструкционных особенностей аппарата и технологии культивирования штаммов-продуцентов основных протективных антигенов холерного вибриона разработаны инструкция по эксплуатации ферментера и стандартные операционные процедуры.
На основании проведенных исследований по разработке экспериментальной технологии концентрирования протективных антигенов тангенциальной ультрафильтрацией обоснованы предложения по её внедрению в производство холерной вакцины.
По результатам проведенных научных исследований разработаны методические рекомендации «Концентрирование протективных антигенов холерного вибриона методом тангенциальной фильтрации», одобренные Учёным советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 2 от 18 марта 2011 г.) и утверждённые директором института 11 июня 2011 г. Получен патент РФ на полезную модель № 86184. Разработанный биореактор в соответствии с актом утвержденным директором института 28 марта 2008 г. введен в эксплуатацию.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Разработан и создан биореактор с высоким уровнем биологической защиты.
2. Культивирование производственных штаммов холерных вибрионов на разработанном биореакторе обеспечивает получение кондиционных нативных О-антигена и холерогена, при сохранении их физиологических и морфологических свойств.
3. Предложена оптимальная технология концентрирования тангенциальной ультрафильтрацией протективных антигенов Vibrio cholerae 569В серовара Инаба.
4. Экспериментальные серии вакцины, полученные с использованием разработанных биореактора и технологии концентрирования протективных антигенов холерного вибриона, по показателям качества соответствуют требованиям нормативной документации на вакцину холерную бивалентную химическую таблетированную.
Работа выполнена в ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» в рамках научно-исследовательской темы № 40-2-09 «Оптимизация технологических этапов производства МИБП и разработка новых препаратов для диагностики ООИ» (номер госрегистрации: 0120.0853923).
Апробация работы. Основные результаты работы представлены на: 15 международной школе-конференции молодых ученых «Биология – наука ХХI века», (Пущино, 2010); Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2010. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», (Москва, 2010); Международной научно-практической конференции «Вавиловские чтения-2010», (Саратов, 2010); Совещании проблемной комиссии 46.04 «Холера и патогенные для человека вибрионы» Координационного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации (Ростов-на-Дону, 2011).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ и 1 патент.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, включающей в себя объект и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов, списка используемых литературных источников, включающего 206 источников, и приложений. Работа изложена на 140 страницах и иллюстрирована 20 рисунками, 14 таблицами.
