Введение к работе
Актуальность темы. Создание и изучение новых биосовместимых материалов, необходимых для современных реконструктивных медико-биологических технологий, является актуальной проблемой биотехнологии. Повышение эффективности лечения и качества жизни невозможно без внедрения в практику реконструктивной медицины высоких технологий с применением новых материалов высокой функциональности и специфичности, включая конструирование систем, способных воспроизводить биологические функции живого организма (Bioartificial organs, 1999; Биосовместимость, 1999; Sudesh et al., 2000; 2004; Biopolymers, 2002; Biotechnology of Biopolymers: From Synthesis to Patents, 2004; Biopolymers, 2002; Biopolymers for Medicinal and Pharmaceutical Applications, 2005; Штильман, 2006; Хенч, Джонс, 2007). Активно развиваемый в настоящее время новейший подход - это создание биоискусственных органов и тканей, развитие которого делает необходимым освоение новых функциональных материалов (Шумаков, 1995; Шумаков с соавт., 2003; Штильман, 2006).
Получение фундаментальной основы для разработки и реализации новых материалов и устройств требует комплексных исследований. Для понимания механизма взаимодействия материалов и изделий из них с тканями организма необходимы глубокие исследования закономерностей ответа организма на инородное тело, характера регенераторного процесса, с одной стороны, и изучение «судьбы» (включая кинетику биоразрушения и динамику прочностных свойств) имплантируемого материала, с другой. Имплантированные материалы/изделия и живой организм при контакте подвержены взаимовлиянию, как правило, негативного характера, при этом характер и степень выраженности этого воздействия определяются как комплексом физико-химических свойств собственно материала, массой и геометрией имплантата, так и природой и силой ответных физиолого-биохимических реакций организма-хозяина. Поэтому для освоения новых материалов основополагающей задачей является необходимость глубокого изучения механизма совместимости материала с кровью, тканями и организмом; при этом необходимо ответить на следующие ключевые вопросы: 1) как собственно материал и изделия из него влияют на организм, 2) каков характер ответа организма на имплантацию материала/изделия, 3) под действием каких факторов in vivo материал/изделие и каким образом изменяются. Эти исследования реализуются на стыке биотехнологии, химии высокомолекулярных соединений, биофизики, молекулярной и клеточной биологии, медицины и включают разработку новых материалов и переработку их в специализированные изделия; изучение механизма взаимодействия материалов с тканями; оценку биотехнологических, физико-химических и медико-биологических свойств.
Несмотря на значительные успехи, достигнутые в биотехнологии материалов в последние годы, пока не удалось создать материалы, полностью
совместимые с живым организмом. Основными факторами, сдерживающими широкое применение остро востребованных биоразрушаемых полимерных материалов, являются небогатый ассортимент данных материалов, а также пока не решенная проблема регулируемости процессов их функционирования и деструкции в живом организме (Zhu et al, 2003; Liu et al, 2005, Yun et al, 2004; Balthasar et al, 2005; «Biotechnology of Biopolymers: From Synthesis to Patents», 2004; «Biopolymers for Medicinal and Pharmaceutical Applications», 2005; Штильман, 2007; Хенч, Джонс, 2007).
Открытие и изучение полигидроксиалканоатов (ПГА) - полиэфиров
микробиологического происхождения, явилось значимым событием для
биотехнологии новых материалов. ПГА - это термопластичные,
биоразрушаемые и биосовместимые полимеры, сферы применения которых потенциально широки и могут включать восстановительную хирургию, клеточную и тканевую инженерию, трансплантологию. Исследование этих полимеров активно проводится всеми развитыми странами, однако многие ключевые вопросы биотехнологии и материаловедения ПГА остаются открытыми. Это вопросы, связанные с получением высокоочищенных образцов и способами получения из ПГА специализированных изделий медико-биологического назначения различных типов. Остаются не изученными в полной мере кинетика и закономерности биоразрушения этих полимеров in vivo. Отсутствие четких представлений о механизме взаимодействия изделий из ПГА с клетками и тканями различной структуры, а также медико-технических характеристиках и эффективности их функционирования in vivo делают эти вопросы первоочередными для исследований.
Это определило направление исследований настоящей работы, ориентированной на комплексное исследование ПГА применительно к конкретным биомедицинским задачам: конструирование экспериментальных изделий из ПГА медико-биологического назначения и проведение всесторонних исследований закономерностей их взаимодействия с тканями и организмом для получения доказательства биосовместимости и функциональности как необходимой основы для внедрения в практику.
Цели и задачи исследования. Цель работы - комплексное исследование и экспериментальное обоснование применения биоразрушаемых полигидроксиалканоатов в качестве хирургических элементов, самостоятельных эндопротезов и систем доставки лекарственных средств.
Для достижения цели сформулированы следующие задачи:
1. На основе ПГА разработать семейство функциональных изделий
медико-биологического назначения, исследовать физико-механические
свойства, устойчивость к воздействию биологических сред и физико-
химических факторов.
2. Исследовать биосовместимость ПГА в культурах клеток и в
экспериментах на животных на уровне клеточного ответа, реакции тканей и
всего организма
З. Изучить кинетику биоразрушения ПГА в биологических средах in vivo в зависимости от технологии переработки полимера, формы и места имплантации изделия.
4. Оценить эффективность ПГА в качестве биосовместимых эндопротезов, шовного материала, остеопластических имплантатов, для депонирования и доставки лекарственных средств.
Научная новизна. Сконструировано семейство экспериментальных
образцов хирургических изделий и имплантатов биомедицинского назначения,
разработанных из биоразрушаемых полимеров ПГА; впервые проведены
комплексные исследования этих изделий. В культурах клеток и в
экспериментах на лабораторных животных показана биологическая
безопасность созданных полимерных изделий на уровне клеток, тканей и
организма. Показано, что биодеградация ПГА in vivo реализуется гуморальным
и клеточным путями с участием макрофагов и гигантских клеток инородных
тел с высокой активностью клеточной и сывороточной кислой фосфатазы;
течение процесса биоразрушения ПГА зависит от химической структуры
полимера, формы и места имплантации изделия. Впервые исследована реакция
различных тканей и закономерности регенераторного процесса в ответ на
имплантацию изделий из ПГА и получены количественные данные,
характеризующие реакцию тканей на имплантацию ПГА. Показано, что
ответная реакция тканей характеризуется не продолжительным
посттравматическим воспалением без образования выраженных фиброзных капсул и неблагоприятных реакций. Впервые изучена возможность применения полностью биоразрушаемых эндопротезов из ПГА для реконструкции желчевыводящих путей. Исследованы свойства серии объемных имплантатов из ПГА и доказано, что ПГА и композиты ПГА с гидроксилапатитом биоинертны и не вызывают цитотоксических реакций in vitro и воспалительных, некротических и иных негативных реакций in vivo; обладают остеопластическими свойствами, медленно деградируют и способствуют новообразованию костной ткани, обеспечивая нормальное протекание репаративного остеогенеза. ПГА исследованы в качестве матрикса для депонирования и доставки лекарственных средств; доказана безопасность разработанных форм в виде пленок, таблеток и микрочастиц при различных способах введения, изучено распределение и биодеградация полимерных микрочастиц во внутренних органах животных.
Практическая значимость. Разработано семейство изделий из высокоочищенных образцов ПГА, отвечающих требованиям, предъявляемым к материалам и изделиям биомедицинского назначения. На основе изученных свойств растворов, расплавов, эмульсий и порошков определены параметры для переработки ПГА в специализированные изделия в виде шовных волокон, пленочных и объемных матриксов, микрочастиц, полимерных эндопротезов. Отработаны способы модификации структуры матриксов из ПГА с применением химических и физических методов, обеспечивающие получение функциональных матриксов (scaffolds) в виде гибких пленок и мембран, пригодных для клеточных технологий. Биологические и физико-химические
свойства полимерных изделий позволяют рекомендовать их для использования в различных областях реконструктивной медицины. Моножильный шовный материал из ПГА обладает необходимыми физико-механическими свойствами и пригоден для хирургии. Показана возможность использования ПГА для изготовления полностью биоразрушаемых эндопротезов, эффективных для реконструкции желчевыводящих путей. Разработанные объемные имплантаты из ПГА и в композиции с гидроксилапатитом пригодны для реконструкции дефектов костной ткани. Полимерные микрочастицы являются перспективной лекарственной формой для длительного функционирования in vivo при различных способах введения и позволяют осуществить местную доставку антипролиферативных препаратов.
Положения, выносимые на защиту:
-
Разработанная серия экспериментальных изделий из ПГА в виде плоских и объемных матриксов, шовного материала, биосовместимых эндопротезов, систем депонирования и доставки лекарственных средств; результаты их комплексных исследований, свидетельствующие об их биосовместимости и соответствии требованиям, предъявляемым к материалам и изделиям медико-биологического назначения.
-
Характер взаимодействия разработанных полимерных изделий с биологическими тканями различной структуры (мышечной, костной, тканями внутренних органов); течение регенераторного процесса; ответная реакция тканей на имплантацию ПГА, характеризующаяся непродолжительным посттравматическим асептическим воспалением без образования выраженных фиброзных капсул и других неблагоприятных реакций.
-
Закономерности биодеградации полигидроксиалканоатов in vivo в зависимости от способа и места введения, реализуемой гуморальным и клеточными путями с участием макрофагальных клеток; возможность длительного функционирования полимерных изделий in vivo, от нескольких месяцев до года.
4. Экспериментальное обоснование возможности применения изделий из
ПГА в качестве биосовместимых и функциональных эндопротезов, шовного
материала, остеозамещающих имплантатов и матриксов для депонирования и
доставки лекарственных препаратов.
Работа выполнена в рамках плановой тематики НИР Института биофизики СО РАН (№№ государственной регистрации: 0120.0 404601; 01.200703092) и при поддержке Министерства образования РФ и Американского фонда гражданских исследований и развития (CRDF) (гранты REC 002, RUX0-002-KR-06, Yl-B-02-07, Р1МО002, BG5202, BG8102), Международного научно-технического центра (МНТЦ-ISTC, проект № 2218), РФФИ (гранты №№ 05-04-08024офи-а, 07-03-00112-а, РФФИ-КФН 02-04-97701), Красноярского краевого фонда науки (ККФН) (гранты №№ 9F154C, 13G028, 15G104, 16G104), Программы Президента РФ для молодых кандидатов наук (гранты №№ МК-4149.2006.4 и МК-577.2008.4), Фонда содействия отечественной науке-2008 года по программе «Молодые кандидаты наук»,
Программы Президиума РАН «Фундаментальные науки-медицине» (проекты №№ 11.1, 12.5, 12.11, 20.11), Программы Интеграционных программ Сибирского отделения РАН (проекты № 14 «Стволовые клетки - основа клеточных биотехнологий будущего»; № 54 «Научные основы разработки новых лекарственных препаратов»; № 96 «Фундаментальные основы биотехнологического получения целевых продуктов и препаратов»); Программы Министерства образования и науки РФ «Развитие потенциала высшей школы», проекты №№ 2.1.1.528; РНП-11).
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на XXXVIII и XXXIX Международных конференциях «Студент и научно-технический прогресс», (Новосибирск, НГУ, 2000 и 2001); Южно-Сибирской международной научной конференции студентов и молодых ученых (Абакан, 2000); Второй республиканской конференции «Молодежь и пути России к устойчивому развитию» (Красноярск, 2001); Международном симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2001); II Объединенной научной сессии СО РАН и СО РАМН «Новые технологии в медицине» (Новосибирск, 2002); Сессиях научной молодежи Красноярского научного центра СО РАН (Красноярск, 2002, 2006); International Symposium on Biopolymers 2002 ISBP02 (Germany, Munster), II International Symposium on Biopolymers (UK, Kordif, 2003); Advanced Research Workshop (NATO Science Programme), "Macromolecular Approaches to Advanced Biomaterials Engineering Systems"(Sofia, Bulgaria, 2003); Конференции по Программе Президиума РАН "Фундаментальные науки-медицине» (Москва, 2003, Новосибирск, 2006, 2007); Ш-ей конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2004); XI и XV научно-технической конференции с участием зарубежных специалистов «Вакуумная наука и техника» (Украина, Судак, 2004; Дагомыс, 2008); European Symposium on Biopolymers ESBP04 (S-Gallen, Switzerland, 2004); European Symposium on Biopolymers ESBP05 (Madrid, Spain, 2005); 3-й Международном биотехнологическом конгрессе "Bio - 2007" (Москва, 2006); Всероссийской научно-практической конференции «Новые технологии создания и применения биокерамики в восстановительной медицине» (Томск, 2007); British-Russian Workshop in Association with the European Comission Stem Cell: Policy, Research, and Innovations Perspectives, (Москва, 2007); 4th European Congress on Biopolymers (Madrid, Spain, 2007); 4th Europen Symposium on Biopolymers ESBP07 (Turkey, Kusadasi, 2007); IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов с международным участием «Биохим-2008» (Новосибирск, 2008); XVI International Conference on Bioencapsulation (Dublin, Ireland, 2008), IV Всероссийском съезде трансплантологов памяти академика В.И. Шумакова (Москва, 2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 89 работ: монография, 42 статьи в центральных РФ и зарубежных журналах, включая 36 статей в журналах, входящих в список ВАК.
Вклад автора: Планирование и проведение всех экспериментов, обработка и анализ полученных результатов, подготовка публикаций.
Структура работы. Диссертация изложена на 260 страницах машинописного текста и содержит 22 таблицы и 94 рисунка; включает обзор литературы, описание объектов и методов исследования, результатов и их обсуждения (5 глав), заключения и выводов. Список цитируемой литературы включает 485 источника, в т.ч. 380 зарубежных.
