Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
1.1. Анализ заболеваемости птиц в птицеводческих хозяйствах Кировской области и Российской Федерации за последние годы 12
1.2. Классификация пробиотиков, состав, назначение 16
1.3. Возможные направления совершенствования технологии получения пробиотиков из штаммов лактобактерий 33
2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 53
2.1. Материалы и методы исследования 53
2.1.1 Штаммы микроорганизмов 53
2.1.2 Питательные среды 53
2.1.3. Лабораторные и сельскохозяйственные животные 54
2.1.4. Методы оценки биологических свойств лактобактерий 55
2.1.5 Методы культивирования микроорганизмов 56
2.1.6 Методы оценки реактогенности, безвредности и токсигенности 57 2.1.7. Статистические методы обработки результатов 57
2.2. Экспериментальное обоснование усовершенствования методики
выделения молочнокислых бактерий от птиц в птицеводческих хозяй
ствах Кировской области 57
2.3. Изучение биологических свойств выделенных штаммов молочнокислых бактерий
2.4. Технология приготовления эталонных культур отобранных штаммов и оценка стабильности их свойств 67
2.5. Отработка технологии приготовления и оптимизация прописи стабилизированной рабочей культуры в качестве посевного материала для глубинного культивирования 71
2.6. Технология приготовления лабораторного образца пробиотиче-ского препарата на основе штамма Р6 лактобактерий 77
2.7. Изучение стабильности основных биологических свойств лабораторного образца биопрепарата 85
2.8. Изучение безвредности, реактогенности и токсигенности лабораторного образца пробиотика на основе штамма Р6 лактобактерий в опытах на лабораторных животных 91
2.9. Изучение эффективности лабораторного образца пробиотика в опытах на курах в птицеводческих хозяйствах Кировской области 95
3. ОБОБЩЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 104
4. ВЫВОДЫ 109
5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 111
6. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ 112
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК 113
ПРИЛОЖЕНИЯ 128
- Анализ заболеваемости птиц в птицеводческих хозяйствах Кировской области и Российской Федерации за последние годы
- Классификация пробиотиков, состав, назначение
- Материалы и методы исследования
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время в числе высокоэффективных лечебно - профилактических препаратов отечественными и зарубежными специалистами рассматриваются пробиотики (эубиотики). Пробиотики - это биопрепараты из живых безвредных для организма животных, антагонистически активных бактерий. Перспективными в отношении предотвращения заболеваний желудочно-кишечного тракта являются представители нормальной микрофлоры животных и птицы - молочнокислые бактерии, обладающие широкой природной антагонистической активностью в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (Смирнов В.В., 1992; Стегний Б.Т., 2005; Субботин В.В., 2008; Тихонов И.В. с соавт., 2008). Учитывая отмеченное, создание эффективных препаратов на основе микроорганизмов с пробиотическими свойствами и совершенствование технологий их приготовления является весьма актуальной задачей.
Практика показывает, что наиболее эффективными при профилактике заболеваний сельскохозяйственной птицы являются пробиотические препараты на основе штаммов микроорганизмов, которые выделены от здоровых особей. Для создания нового пробиотического препарата были исследованы биологические свойства 12 штаммов молочнокислых бактерий, выделенных от кур птицефабрик Кировской области, доказана эффективность лабораторного образца препарата, приготовленного на основе отобранного штамма Р6 с использованием разработанной питательной среды и усовершенствованной технологии.
Создание нового пробиотического препарата потребовало разработку и введение в процесс приготовления усовершенствованной питательной среды (ПС) для накопления биомассы микробных культур на стадиях процесса приготовления готовой формы препарата, а также разработку и внедрение в технологический процесс новой операции по приготовлению стабилизированной рабочей культуры (СРК) из посевной микробной культуры, выращенной глубинным способом в бутылях.
Цель работы - создание усовершенствованной технологии производства, пригодной для промышленного выпуска пробиотика на основе выделенного штамма Lactobacillus plantarum, с использованием в качестве посевного материала стабилизированной рабочей культуры и вновь разработанной по составу жидкой питательной среды для получения нативной культуры (НК) при глубинном способе выращивания в аппаратах-культиваторах (АКВ).
Задачи исследования
1. Усовершенствовать методику выделения лактобактерий, сохранить и поддержать эталонные штаммы полученных молочнокислых бактерий, изучить их биологические свойства.
2. Разработать технологию приготовления стабилизированной рабочей культуры и обосновать пропись защитной среды.
3. Отработать методику приготовления лабораторного и промышленного образца пробиотического препарата при использовании разработанной ПС и СРК и исследовать стабильность и воспроизводимость его прикладных и эксплуатационных характеристик.
4. Изучить специфическую безопасность и токсичность пробиотического препарата на лабораторных животных.
5. Усовершенствовать имеющуюся технологию промышленного производства пробиотиков на основе лактобактерий глубинным способом в аппаратах-культиваторах, оценить лечебно-профилактическую эффективность нового биопрепарата.
6. Создать нормативно-техническую документацию на приготовление готовой формы пробиотического препарата и его контроль.
Научная новизна
1. Впервые на основе выделенных в птицеводческих хозяйствах Кировской области штаммов лактобактерий оптимизирован способ поддержания посевных материалов и приготовления нативных культур, основанный на использовании стабилизированной рабочей культуры, хранящейся при минус 20С в течение шести месяцев.
2. Впервые для приготовления в аппаратах-культиваторах нативной культуры глубинным способом культивирования в жидкой питательной среде предложен ее новый состав, обеспечивающий высокие ростовые характеристики лактобацилл при производстве.
3. Предложенная промышленная технология производства пробиотика позволяет стабилизировать стадию культивирования за счет разработанной ПС и СРК, сократить процесс приготовления НК на 5 суток Получен экономический эффект в расчёте на суточную дозу молодняка кур на 24%. Себестоимость 1 суточной дозы пробиотика, полученного по традиционной технологии, составила 1,58 копеек, а по усовершенствованной нами технологии - 1,2 копейки.
Практическая значимость работы
1. Усовершенствованная промышленная технология за счет использования СРК сокращает на 5 суток пусковой период производства, стандартизирует стадию выпуска нативной культуры, снижает процент брака.
2. Включение в схему производства СРК, хранящейся в течение 6 месяцев при минус 20С, обеспечивает выпуск пробиотика на протяжении длительного периода времени стандартным по составу посевным материалом в необходимых объемах.
3. Разработанная пропись жидкой питательной среды для приготовления НК обеспечивает выход биомассы Lactobacillus plantarum в объеме регламентных требований.
4. Приготовленный пробиотик на основе выделенного штамма Lactobacillus plantarum Р6 при его применении в промышленном производстве молодняка кур повышает их сохранность до 5%.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на Международной научно-практической конференции, посвящённой 100- летию со дня рождения П.Г. Петского (Киров, 2009).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 6 научных работ, в том числе 3 статьи в сборнике международных конференций, 3 статьи в журнале, включённом в перечень ВАК РФ.
Объём и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 127 страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, данные о практическом использовании полученных результатов, рекомендации по использованию научных выводов, список использованной литературы (138 источник, из которых 99 отечественных и 39 иностранных), 23 таблицы, 4 рисунка, приложения.
Научные положения и результаты, выносимые на защиту
1. Усовершенствование способа поддержания и хранения клеток штамма Lactobacillus plantarum Р6, использование разработанной питательной среды, стабилизированной рабочей культуры, внедрение отработанных параметров ведения процесса выращивания в аппаратах - культиваторах позволяет получить бактериальную культуру с полноценными биологическими свойствами, пригодную для производства пробиотического препарата.
2. Усовершенствованная технология производства позволяет сократить пусковой период производства нативной культуры на 5 суток, достигнуть экономического эффекта в снижении себестоимости суточной дозы препарата на 24%, получить пробиотический препарат на основе штамма лактобактерий с необходимыми биологическими и физико-химическими показателями качества.
3. Разработанный образец пробиотического препарата на основе штамма Lactobacillus plantarum Р6 безвреден, нереактогенен и обеспечивает у птицы при оральном способе применения лечебно-профилактический эффект, выражающийся в снижении падежа до 5%.
Материалы и методы исследований
Работа выполнена в период с 2003 по 2009 годы на кафедре биотехнологии ФГОУ ВПО МГАВМиБ, в лабораториях НИИ Микробиологии МО РФ, кафедре микробиологии, вирусологии и фармакологии ФГОУ ВПО Вятской ГСХА. Производственные опыты были проведены в птицеводческих хозяйствах Кировской области.
В работе изучили 12 штаммов Lactobacillus plantarum, выделенных из пищеварительной системы кур в птицехозяйствах, из которых для дальнейшей работы были выбраны два штамма Р3 и Р6. Для выращивания штаммов лактобактерий с целью оценки их биологических свойств готовили питательные среды на основе сред МРС-1 и МРС-4. При выращивании других микроорганизмов готовили плотные (ППС) и жидкие (ЖПС) дифференциальные или диагностические питательные среды, а также среды на основе перевара по Хоттингеру. Для получения биомассы при культивировании лактобактерий в аппаратах-культиваторах использовали питательную среду на основе ферментативного гидролизата казеина с различными вариациями составных частей, наиболее полно удовлетворяющими потребностям данного вида бактерий. Биологические свойства лактобактерий оценивали общепринятыми методами. Антагонистическую активность выделенных штаммов Р3 и Р6 лактобактерий оценивали в отношении микробов тест-штаммов в сравнении с изученными штаммами лактобактерий.
Реактогенность, безвредность и токсигенность лабораторного образца препарата проверяли на беспородных белых мышах и морских свинках обоего пола, согласно ФС на «Лактобактерин».
Для оценки лечебно - профилактической эффективности лабораторного образца пробиотика использовали кур разных пород и возраста из птицехозяйств Кировской области.
Культивирование лактобактерий проводили в стеклянном биореакторе объёмом 5 л при температуре 38С, исходном значении рН=6,0, в статических условиях, в аэробных и анаэробных условиях и перемешивании магнитной мешалкой (150 об/мин), а также в 20-литровых стеклянных бутылях. Конечную стадию культивирования проводили в биореакторе (БИОР) объёмом 250 л при температуре 38С, исходном значении рН=6,0. Посевную дозу вносили в количестве не менее 0,4 млрд на мл ПС.
Оценку роста и физиологической активности бактериальной популяции проводили по динамике изменения концентрации бактериальных клеток, удельной скорости роста и времени генерации бактериальной популяции.
Статистическую обработку экспериментальных данных проводили методом вариационной статистики.
Анализ заболеваемости птиц в птицеводческих хозяйствах Кировской области и Российской Федерации за последние годы
По данным управления ветеринарии Кировской области, на 01.11.2008 года поголовье птицы в области составляло 2860,1 тысячи голов, или 101% к уровню прошлого года, в том числе 409,9 тысяч голов птицы в частном секторе, или 82% к прошлому году, и в промышленном секторе поголовье птицы достигло 2450,2 тысячи голов, или 104% к предыдущему году. Сократилось поголовье птицы к уровню прошлого года в ОАО «Кирово-Чепецкая птицефабрика» (91,7%), на Нолинской птицефабрике (83,9%), незначительно - в «Птицеводе» (99,4%) и на Костинской птицефабрике (97,4%).
Производство яиц за 12 месяцев текущего года в птицехозяйствах области составляет 293782 тысячи штук (это составляет 92,3% к уровню 2007 года). Уменьшилось производство яиц за счет сокращения поголовья кур-несушек к уровню прошлого года на 5 тысяч голов. Спад производства яиц допустили: Котельничская птицефабрика (21,8%), Нолинская (80,8%), племрепродуктор «Орловский» (76,8%), Уржумская племптицефабрика (62,9%), Фаленская птицефабрика (91,4%), Костинская птицефабрика (48,1%).
Яйценоскость на курицу-несушку составляет 243 яйца, это на 13 яиц больше, чем за этот же период прошлого года. Наивысшую продуктивность на курицу-несушку получили Фаленские птицеводы (253 яйца), на втором месте Яранская птицефабрика (248 штук), на третьем месте Зуевские птицеводы (247 яиц). Увеличили продуктивность на курицу-несушку к уровню 2007 года птицефабрики: В.-Поляны (+17 яиц), Нолинск (+11 штук), Советск (на +9 яиц). Снижение продуктивности допустили: племптицехозяйство «Орловское» (на 11 яиц) и мясные птицефабрики Костинская (на 9 штук) и Уржумская птицефабрика (на 3 яйца).
За текущий год пало птицы в птицехозяйствах области 325,8 тысяч голов, что составляет 95% к уровню 2007 года. В том числе 86,5 тысяч голов пало взрослой птицы, или 81% к прошлому году, и 239,3 тысячи голов, или 101% к предыдущему году. Увеличение падежа среди молодняка птиц вызвано массовым падежом молодняка в марте текущего года в ООО «Советская агрофирма» в количестве 27,0 тысяч голов из-за отключения электрического тока, и, соответственно, произошло отключение приточно-вытяжной вентиляции. Птица пала от асфиксии.
За 12 месяцев 2008 года сохранность по взрослой птице составляет 96,4%. Первое место по сохранности взрослой птицы держат нолинские птицеводы — 97,9%. На втором месте - фаленские птицеводы - 97,8%, на третьем месте орловские - 97,6%). Увеличили сохранность взрослой птицы зуевские птицеводы (на 0,6%), яранские (на 1,6%). Среди мясных птицефабрик улучшили сохранность взрослой птицы уржумские птицеводы (на 1,4%). Остальные птицефабрики допустили снижение сохранности взрослой птицы. Особое беспокойство вызывает сохранность взрослой птицы на Вятско-Полянской птицефабрике — 91,9%. По ветеринарной отчетности и по данным лабораторных исследований там нет инфекции, свыше 60% падежа взрослой птицы ежемесячно идет от рас-клева. Нужно пересматривать рационы кормления по питательности и балансировать по незаменимым аминокислотам.
Сохранность по молодняку составляет 96,3%, это на уровне прошлого года. Наивысшую сохранность по молодняку птиц (99,4%) имеет Нолинская птицефабрика, на втором месте по сохранности молодняка «Птицевод» (99,1%), третье место делят Зуевская и Фаленская птицефабрики (99,0%). Улучшили сохранность по молодняку мясные птицефабрики: Костинская на +0,8% (95,4%) и К-Чепецкая -97,1% (0,2%). Все остальные допустили снижение сохранности молодняка к уровню 2007 года.
97,1% птицы пало от болезней незаразной этиологии, в основном это болезни органов пищеварения, болезни органов дыхания, болезни обмена веществ, болезни органов размножения, травмы.
Классификация пробиотиков, состав, назначение
Классификация пробиотиков, состав, назначение Пробиотики - это иммунобиологические препараты на основе специально выбранных штаммов живых бактерий, антагонистически активных в отношении патогенных и условно патогенных микроорганизмов - возбудителей острых кишечных инфекций и токсикоинфекций и не оказывающих отрицательного (бактериостатического и (или) бактерицидного) влияния на микробов - представителей нормомикрофлоры ЖКТ и слизистых (эндогенной, индигенной, ау-тохтонной, резидентной микрофлоры - используемые в литературе синонимы) животных и человека [74-101].
В составе данных препаратов, помимо собственно бактерий-антагонистов, содержатся также различные биологически активные вещества (БАВ), являющиеся продуктами метаболизма этих базовых (производственных) штаммов микробов при их росте, развитии и размножении на плотных и в жидких питательных средах, используемых для накопления биомассы. В числе таких метаболитов могут идентифицироваться различные БАВ: бактериоцины, антибиотикоподобные субстанции и даже антибиотики, аминокислоты, ферменты, пептиды и полипептиды, полисахариды, витамины и провитамины, нуклеотиды и др. [102-130].
Спектр рассматриваемых БАВ индивидуален для каждого конкретного пробиотика и по основным слагаемым детермирован, в первую очередь, метаболическими характеристиками используемых в нем базовых штаммов микроорганизмов-продуцентов (т.е. генотипом). Однако в значительной мере он подвержен воздействию и собственно условий выращивания (состава и качества ПС, температуры и параметров аэрации (анаэробиоза), хранения и т.д.), что характеризуется как фенотипическая вариабельность свойств.
Совокупность характеристик, реализованных в фенотипе бактерий-продуцентов, а также биологически активных продуктов их метаболизма, обусловливает, в конечном счете, спектр и выраженность лечебно-профилактической эффективности конкретного пробиотика. Следовательно, коль скоро свойства штаммов (видов) микробов-антагонистов и адекватность условий их выращивания при прочих равных условиях предопределяют основные аспекты механизма действия эубиотиков и потенциальную возможность их реализации в организме животного и птицы, то, соответственно, выбор наиболее активных бактерий-продуцентов имеет для ветеринарной практики первостепенное значение.
Многие из известных отечественных и зарубежных пробиотиков, которые эффективно используются в ветеринарии, исторически первоначально создавались в медицинских целях, где и использовались академиком Л. Г. Перетцом и другими специалистами из его школы, начиная с 30-х годов, прежде всего, в инфекционной педиатрической практике [цит. по 68]. Поэтому основные требования, предъявляемые к микроорганизмам с эубиотическим действием, одинаковы как для пробиотиков медицинского, так и ветеринарного назначения. Сформулированные с учётом современных теоретических и прикладных представлений эти требования приведены в таблице 1.
Материалы и методы исследования
В условиях птицеводческих хозяйств Кировской области на протяжении двух лет путём высева из содержимого тонкого отдела кишечника трупов животных и каловых масс осуществлялся высев и отбор Lactobacillus plantaram. Для исследования были взяты 12 штаммов лактобактерий, из которых впоследствии были выбраны два штамма L. plantaram под номерами РЗ и Р6 для более детального изучения биологических свойств и оценки возможности использования их для усовершенствования технологии глубинного производства про-биотика в аппаратах - культиваторах. Параллельно с этим на данных штаммах были отработаны условия пассирования, приготовления посевных культур и, в первую очередь, СРК с использованием питательной среды нового состава.
Выделенный для оценки возможности приготовления пробиотика штамм Р6 L. plantaram в соответствии с имеющейся лицензией на право организации в НИИ Микробиологии МО РФ Всероссийской коллекции микроорганизмов, выданной ГНУ ГИСК им. Л.А. Тарасевича, был депонирован в мае 2005г. под номером 39.
Для сравнительных исследований в работе использовали штаммы микроорганизмов рода лактобацилл (Lactobacillus plantaram №3 и Lactobacillus buch-neri №4) из коллекции культур НИИ Микробиологии МО РФ, а также штамм L.plantarum 8РА-3, полученный из ГИСКа им. Л.А.Тарасевича.
Для выращивания штаммов лактобактерий с целью оценки их биологических свойств готовили питательные среды на основе сред МРС-1 и МРС-4 в соответствии с методикой, изложенной в ФС на «Лактобактерий сухой».
Для выращивания других микроорганизмов с целью оценки биологических свойств готовили плотные и жидкие питательные среды на основе перевара по Хоттингеру в соответствии с методикой, изложенной в сборнике инструкций, утвержденном приказом Минздрава СССР от Для получения биомассы при культивировании лактобактерий в аппаратах-культиваторах использовали питательную среду на основе гидролизата казеина с дрожжевыми добавками, принятую для производства «Лактобактерина» и модификации питательных сред с различными вариациями составных частей, наиболее полно удовлетворяющими потребностям данного вида бактерий. Контроль сред осуществляли по физико-химическим и биологическим показателям [52].
При приготовлении питательных сред нового состава использовали панкреатический гидролизат казеина (ФГК), полученный по оптимизированной нами методике. Для ферментативного гидролиза использовали поджелудочную железу крупного рогатого скота (ГОСТ 11285-93). Из возможных субстратов протеолиза выбрали казеин как наиболее полноценный и доступный животный белок, при ферментировании которого образуются пептиды и свободные аминокислоты, экстракт дрожжей (ГОСТ 23258-89) и молочно - кисло-дрожжевую среду (КДМ).
В работе использовали казеин технический кислотный (ГОСТ 17626-81, высший сорт). Осветление ПГК производили древесным углём осветляющим «ОУ - А» (ГОСТ 4463-74). Цветность ФГК определяли на фотоколориметре ФЭК - 56 в кювете с толщиной слоя 5 мм при длине луча, равной 400 нм.
Похожие диссертации на Совершенствование технологии приготовления пробиотика на основе лактобактерий, оценка его свойств и эффективности применения в птицеводстве
