Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ .„ ; 7
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
Состояние исследований по использованию методов биотехнологии в селекции растений на начало 80-х годов XX века 12
Обоснование темы 36
Клональное микроразмножение и системы регенерации растений in vitro 38
Получение гаплоидов и/или удвоенных гаплоидов методами биотехнологии растений и их практическая значимость 44
Культура зародышей 47
Культура пыльников 51
Культура неоплодотворенных завязей и семяпочек 81
1.2.3. Генетическая трансформация 94
Использование методов прямого переноса генов при генетической трансформации моркови 100
Агробактериальная трансформация моркови 101
1.3. Связь диссертационной работы с тематическим планом научно-исследовательских
работ 117
1.4. Апробация работы 120
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 125
2. ОБЬЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 125
Растительный материал 125
Стерилизация 126
Выделение эксплантов 127
Питательные среды-состав и приготовление 128
Условия культивирования эксплантов in vitro 132
Цитоэмбриологические исследования 132
Генетическая трансформация моркови 135
Адаптация растений-регенерантов и выращивание последующих поколений в условиях in vivo 138
Биохимический анализ экспериментального материала 139
2.10. Статистическая обработка экспериментальных данных 140
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 141
3.1. Культура зародышей 141
Стерилизация семян и завязей моркови 142
Разработка состава питательной среды для культивирования зиготических зародышей моркови in vitro 156
Каллусогенез и регенерация растений в культуре зародышей моркови in vitro... 171
Рост и развитие завязей, семяпочек и зародышей in vivo 178
Регенерация растений in vitro из разновозрастных завязей, семяпочек
и зародышей моркови 187
Получение апомиктичных растений моркови in vivo 198
Получение апомиктичных растений моркови in vitro 202
3.2. Культура пыльников 205
Цветение и фертильность донорных растений моркови 205
Строение пыльника моркови 208
Развитие пыльника моркови in vivo и in vitro 209
3.2.4 Микроспорогенез и микрогаметогенез у моркови 212
Взаимосвязь между стадиями развития мужского гаметофита и размерами соцветий и генеративных органов моркови 214
Условия выращивания донорных растений моркови 224
Стерилизация первичных эксплантов 226
Стадия развития микроспор для индукции андрогенных структур моркови 227
Каллусогенез и эмбриогенез в культуре пыльников моркови in vitro 228
Каллусогенез 230
Эмбриогенез 251
Способы повышения эффективности получения андрогенных структур в культуре пыльников моркови in vitro 269
Роль 2,4-Д на индукцию андрогенных структур в культуре пыльников моркови in vitro 275
Цитология эмбриогенеза в культуре пыльников моркови 281
Смена плоидности при формировании андрогенных растений-регенерантов моркови in vitro 287
Депонирование 292
Адаптация растений-регенерантов in vivo 295
3.3. Культура неопыленных завязей и семяпочек 303
Строение завязи моркови 303
Развитие генеративных органов моркови in vivo 304
Взаимосвязь между стадиями развития женского гаметофита и стадиями развития мужского гаметофита, а также размерами соцветий и генеративных
органов моркови 310
Каллусогенез и эмбриогенез в культуре неопыленных завязей и семяпочек моркови in vitro 312
Цитология каллусо- и эмбриогенеза в культуре неопыленных семяпочек моркови 317
Смена плоидности при формировании гиногенных растений-регенерантов моркови in vitro 319
3.4. Анализ андрогенных и гиногенных растений моркови 320
3.4.1. Растения вегетативного периода онтогенеза 320
Андрогенные растения Rao 320
Андрогенные растения Rai 322
Андрогенные растения Ra2 328
Гиногенные растения Rn 332
3.4.2. Растения репродуктивного периода онтогенеза 333
Андрогенные растения Rao 333
Гиногенные растения Rro 334
Прикладное значение метода андрогенеза in vitro у моркови 335
Сравнительная характеристика андрогенных и гиногенных растений моркови, полученных из сорта Нантская 4 339
Анатомическое строение черешков листьев андрогенных и гиногенных растений моркови Ro вегетативного периода онтогенеза 341
Молекулярная оценка андрогенных и гиногенных растений моркови Ri вегетативного периода онтогенеза на основе RAPD технологии 343
Морфологические различия андрогенных и гиногенных растений
моркови Ro репродуктивного периода онтогенеза 345
3.5. Генетическая трансформация моркови сорта Нантская 4 346
Трансформация моркови репортерным геном GUS 350
Методика отбора трансгенных растений Rti,...,ii моркови с селективным
геном npt II 351
Отбор и анализ трансгенных растений моркови сорта Нантская 4 с геном растительного дефензина Rs-ap 360
Отбор и анализ трансгенных растений моркови сорта Нантская 4 с геном Тауматин II 366
3.5.4.1. Отбор и анализ трансгенных растений Rjo 366
3.5.4.2. Отбор и анализ трансгенных растений Rti 368
3.5.4.3. Отбор и анализ трансгенных растений Rt2 378
3.5.4.4. Анализ трансгенных растений Rti-тз по устойчивости к болезни,
вызываемой Fusarium avenaceum 382
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 387
ВЫВОДЫ 396
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 400
ПРИЛОЖЕНИЯ 475
Приложение 1 476
Характеристика образцов моркови, использованных в исследованиях 476
Приложение 2 479
Характеристика семян моркови, использованных в исследованиях 1983 г 479
Приложение 3 480
Инфицированность выделенных зародышей моркови в зависимости от времени
стерилизации сухих семян 0,1 %-м водным раствором сулемы, % (1983 г.) 480
Приложение 4 480
Инфицированность выделенных зародышей моркови различных образцов при
стерилизации сухих семян 0,1 %-м водным раствором сулемы, % (1983 г.) 480
Приложение 5 481
Инфицированность выделенных зародышей моркови различных образцов при
стерилизации сухих и предварительно замоченных семян 0,1 %-м водным
раствором сулемы в течение 30 мин, % (1983 г.) 481
Приложение 6 481
Инфицированность семян моркови при стерилизации этанолом в течение двух
минут, % (1984 г.) 481
Приложение 7 483
Инфицированность семян моркови разных лет урожая, % (1984 г.) 483
Приложение 8 484
Инфицированность семян моркови при стерилизации фитонцидами в течение
16 часов, % (1984 г.) 484
Приложение 9 486
Инфицированность семян моркови через четыре дня при стерилизации аятином,
перекисью водорода и перманганатом калия, % (1984 г.) 486
Приложение 10 487
Инфицированность семян моркови через четыре дня при стерилизации
хлорсодержащими препаратами, % (1984 г.)... 487
Приложение 11 488
Инфицированность семян моркови при стерилизации диоцидом, % (1984 г.) 488
Приложение 12 489
Инфицированность семян моркови при стерилизации сулемой различной
концентрации в течение 30 мин, % (1984 г.) 489
Приложение 13 491
Инфицированность семян моркови при стерилизации 0,5 %-м водным раствором
сулемы при разных экспозициях и в сочетании с этанолом, % (1984 г.) 491
Приложение 14 493
Посевные качества семян при стерилизации ртутьсодержащими препаратами
(1984 г.) 493
Приложение 15 494
Общая инфицированность завязей моркови в зависимости от времени и способа
стерилизации, % (1983 г.) 494
Приложение 16 494
Общая инфицированность завязей моркови при стерилизации их 0,1%-м водным
раствором сулемы в зависимости от возраста, % (1983 г.) 494
Приложение 17 495
Общая инфицированность завязей моркови после переноса морфологически
неинфицированных завязей из чашек Петри в пробирки в зависимости от времени
и способа стерилизации, % (1983 г.) 495
Приложение 18 495
Общая инфицированность зародышей моркови при стерилизации завязей 0,1%-м
водным раствором сулемы и диоцида, % (1983 г.) 495
Приложение 19 496
Состав питательных сред, применяемых при культивировании зародышей моркови
in vitro на основе МСм (Masuda et al., 1981) 496
Приложение 20 501
Характеристика проростков моркови, полученных из зрелых зиготических
зародышей сорта Московская зимняя А-515, в культуре in vitro (1984 г.) 501
Приложение 21 505
Диаметр первичных каллусных культур из зрелых зиготических зародышей моркови
сорта Московская зимняя А-515 на средах, содержащих различные концентрации
ауксинов, см (1984 г.) 505
Приложение 22 506
Длина завязей, семяпочек и зародышей моркови линия № 671 и № 855 сорта
Московская зимняя А-515 в процессе роста и развития, мм (1983 г.) 506
Приложение 23 507
Результаты множественных сравнений двухфакторного анализа для средних
значений показателей завязей, семяпочек и зародышей: 1 - Московская зимняя А-515;
2 - Линия № 521 петалоидного типа ЦМС из сорта Московская зимняя А-515;
3-Лосиноостровская; 4-Витаминная (1984 г.) 507
Приложение 24 , 508
Характеристика растений линий № 671 и № 855 петалоидного типа ЦМС из сорта
Московская зимняя А-515 через 6 недель на средах различного состава из
разновозрастных зародышей (1983 г.) 508
Приложение 25 509
Характеристика растений линии № 671 петалоидного типа ЦМС из сорта Московская
зимняя А-515 через 4 недели на среде 3-67 из разновозрастных зародышей и завязей
(1983 г.) і 509
Приложение 26 509
Количество листьев у растений моркови, полученных при культивировании
разновозрастных зиготических зародышей и семяпочек на питательной среде
in vitro в течение шести недель, шт (1984 г.) 509
Приложение 27 510
Высота растений моркови, полученных при культивировании разновозрастных
зиготических зародышей и семяпочек на питательной среде in vitro в течение шести
недель, см (1984 г.) 510
Приложение 28 511
Образцы, полученные из лаборатории генетики и цитологии ВНИИССОК и способы
культивирования апомиктичных эксплантов моркови (1984 г.) 511
Приложение 29 513
Сорта, гибриды и линии, используемые в исследованиях по культуре пыльников
моркови і : 513
Приложение 30 514
Состав питательных сред, применяемых при культивировании пыльников моркови
in vitro 514
Приложение 31 516
Образование каллуса у пыльников моркови in vitro, культивируемых на
агаризованных и жидких средах различного состава, % 516
Приложение 32 517
Визуальная оценка растений-регенерантов моркови на среде П-50 ( МСм -
безгормональная) различного состояния через 4 недели культивирования
(весна 1992 г.) 517
Приложение 33 518
Характеристика растений-регенерантов моркови сорта Нантская 4 выращенных в
различных условиях культивирования in vitro через 4-ре недели после высадки их на
адаптацию in vivo (весна 1992 г.) 518
Приложение 34 518
Характеристика растений-регенерантов моркови сорта Нантская 4 выращенных
на средах различного состояния in vitro через 4-ре недели после высадки их на
адаптацию in vivo (весна 1992 г.) 518
Приложение 35 519
Состав питательных сред, применяемых при культивировании завязей и семяпочек
моркови in vitro на основе МСм (Masuda et al., 1981) 519
Приложение 36 520
Оценка корнеплодов моркови по селекционным признакам 520
Приложение 37 526
Полевая всхожесть семян моркови, полученных в результате самоопыления растений
репродуктивного периода онтогенеза Rai (пленочная теплица, 1995 г.) 526
Приложение 38 527
Акт о передаче селекционного материала моркови в лаб. генетики и цитологии
ВНИИССОК 527
Приложение 39 528
Акт о передаче селекционного материала моркови на Западно-Сибирскую овощную
опытную станцию 528
Приложение 40 : 529
Авторское свидетельство на сорт моркови столовой Соната 529
Приложение 41 530
Энергия прорастания и всхожесть семян моркови на фильтровальных мостиках в
жидкой среде МСм, содержащей различные концентрации канамицина (1998 г.) 530
Приложение 42 531
Рост растений моркови на жидкой среде МСм с канамицином, 0-500 мг/л (1998 г.).... 531
Приложение 43 533
Рост и развитие растений моркови на жидкой среде МСм с канамицином, 0-100 мг/л
(1998 г.) 533
Приложение 44 536
Динамика роста и развития проростков RT1 моркови с бинарной системой
Тауматин II + npt II 536
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ , 539
Введение к работе
Биотехнология как наука, использующая биологические принципы в практических целях, возникла в конце прошлого столетия с появлением микробиологии и её применением в промышленных процессах брожения. Хотя такие биотехнологические процессы, как хлебопечение, приготовление кисломолочных продуктов, сыроварение, виноделие, улучшение полезных видов растений и животных известны с незапамятных времен.
Применение термина «биотехнология» впервые было осуществлено в 1973 году в США, в научно-исследовательской группе Станфордского университета, при получении Е-коли (EcoRl) во время проведения успешной работы в области рекомбинантов ДНК. С этого момента то, что мы теперь называем «биотехнологией», стало использоваться при описании сравнительно новых технологических процессов, входящих в общее понятие «биология», и в частности, для определения таких областей технологии, как рекомбинация ДІЖ, слияние клеток и др. (Хиросэ, 1986). Энциклопедическое определение биотехнологии (от греческого bios - жизнь, techne - искусство, мастерство и logos - учение), использование биологических процессов и систем в различных областях сельского хозяйства, промышленности и медицины; научное направление, объединяющее возможности биологии и техники*. В связи с этим выделяются ряд направлений в том числе и сельскохозяйственная биотехнология.
Сельскохозяйственная биотехнология - любая технология, использующая живые организмы или их части для создания или модификации продуктов, улучшения растений или животных, а также создания микроорганизмов для специального применения (James, 1991). Она охватывает использование «как
* Сельскохозяйственный энциклопедический словарь / Редкол.: B.K. Месяц (гл. ред.) и др. - М.: Советская энциклопедия, 1989. - С. 52.
8 традиционной, так и современной биотехнологии». В традиционном понимании
биотехнология - наука о методах и технологиях производства различных веществ и продуктов с использованием природных биологических объектов и процессов (хлебопечение, квашение, виноделие, пивоварение, биологическая защита от вредных насекомых, производство традиционных вакцин для животных, и др.). Современная биотехнология - наука о генно-инженерных и клеточных методах и технологиях создания и использования генетически трансформированных биологических объектов для интенсификации производства или получения новых видов продуктов различного назначения (включает новые методы культуры клеток и тканей; диагностику с использованием как монокло-нальных антител, так и зондов нуклеиновых кислот; технологию рекомбинант-ной ДНК - рДНК). Высшим достижением современной биотехнологии является генетическая трансформация, перенос чужеродных генов и других материальных носителей наследственности в клетки растений, животных и микроорганизмов, получение трансгенных организмов с новыми или усиленными свойствами и признаками.
Важное место в сельскохозяйственной биотехнологии занимает биотехнология растений. Одно из первых определений этому направлению было дано в начале 90-х годов XX века. Биотехнология растений - прикладная область науки, которая использует научные подходы для разработки новых технологий и оборудования с целью получения новых форм и использования их биологическими организмами (Qualset, 1991). Целями научных исследований биотехнологии растений, наряду с другими, являются: новые фундаментальные знания о процессах, происходящих в растениях, включая структуру, функцию и выражение гена; новые методологии для применения при разработке продуктов; новые генетические линии для научных исследований и селекции растений, включая растения, гаметы, клонированную ДНК; новые сорта растений для прямого использования в сельском хозяйстве.
Немаловажное значение в становлении современной биотехнологии растений сыграла разработка методологических основ культуры тканей растений -
области биологии, изучающей клетки, ткани и органы, изолированные от растения и выращиваемые на искусственных питательных средах, in vitro (в стекле) (Чайлахян и др., 1982).
История развития методов культуры тканей растений подробно отражена в ряде работ как зарубежных (Уайт, 1949), так и отечественных (Бутенко, 1964; Калинин и др., 1980; Муромцев и др., 1990; Бутенко, 1999) исследователей. Можно выделить следующие периоды развития методов культуры тканей растений:
1834-1900 гг. - Создание и разработка клеточной теории.
1901-1922 гг. - Сформулирована идея культуры тканей.
1923- 1934 гг. - Безуспешные поиски методов, обеспечивающих длительное выращивание культуры тканей.
. 4. 1935-1940 гг. - Детальная разработка техники культуры растительных тканей: культивирование изолированных кончиков корня в течение неограниченного периода времени, введение в культуру новых объектов - кал-лусные ткани.
1941-1960 гг. - Разрабатываются составы основных питательных сред, Изучено значение отдельных макро- и микроэлементов. Выявлена потребность тканевых культур в витаминах и стимуляторах роста. Открыт новый класс стимуляторов роста растений - цитокинины. Оценено значение натуральных экстрактов типа эндосперма кокосового ореха, каштана, кукурузы и других растений для поддержания неорганизованного клеточного роста и стимуляции процессов органогенеза и соматического эмбриогенеза в культуре каллусных тканей и клеточных суспензий. В культуру in vitro введены ткани 142 видов высших растений.
1961-1975 гг. Разработан метод получения изолированных протопластов. Изолированные протопласты, еще не образовавшие клеточную стенку, были использованы для разработки методов гибридизации соматических клеток путем слияния протопластов с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ), а также для введения в них вирусных РНК, клеточных органелл, клеток про-
10 кариотов. Разработан метод культуры меристем (клонального микроразмножения), позволяющий быстро, с высоким коэффициентом, клонально размножить растения в асептических условиях, а также получить оздоровленный посадочный материал экономически важных растений. Важное фундаментальное и прикладное значение имело открытие индукции анд-роклинии при культивировании изолированных пыльников и партеногенеза при культивировании клеток зародышевого мешка. Обнаружено явление сомаклональной изменчивости.
1976 - 1990 гг. Продолжает быстро развиваться техника in vitro, изучение биологии культивируемых растительных объектов и создание биотехнологий на их основе. Разработка методов электрослияния изолированных протопластов и разнообразных методов селекции гибридных клеток значительно облегчила гибридизацию соматических клеток растений. Методы мутагенеза и клеточной селекции, получение сомаклональных вариантов и экспериментальных гаплоидов используются для создания новых форм и сортов сельскохозяйственных растений.
1991 г. и по настоящее время - С использованием изолированных протопластов и генетических векторов на основе Ті-плазмид, электропорации и баллистического введения генов в клетки реципиентов стало возможным получение трансгенных растений.
В отечественной литературе термин «биотехнология» относительно растений появился в названии IV Всероссийской конференции «Культура клеток растений и биотехнология» - Кишинев, 1983 г. У зарубежных исследователей термин «биотехнология растений» подразумевал применение технологий тканевых культур, клеточных культур, слияния клеток, рекомбинацию ДНК и др. (Хиросэ, 1986). При этом выделялись три основные области применения биотехнологии растений: 1 - клональное микроразмножение и оздоровление посадочного материала; 2 - производство вторичных метаболитов; 3 - селекция растений.
В контексте нашей работы мы также будем использовать термин «биотехнология растений», подразумевая при этом область биологии, имеющую дело с растительными организмами и продуктами их жизнедеятельности, использующую все уровни организации живого - молекулярный, субклеточный, клеточный, тканевый, организменныи и применяющую методы как культуры тканей, так и других биологических дисциплин для разработки практически важных технологий.
