Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 .Культура клеток и тканей растений - как источник биологически активных соединений 8
1.1 . Каллусная ткань в изолированной культуре 14
1.2.Вторичный метаболизм в растениях in vivo и in vitro 16
1.2.1.Продукты вторичного метаболизма в культуре ткани Catharanthus roseus Ц
1.3 .Условия и способы культивирования растительных клеток и синтез биологически активных веществ 18
І.ЗЛ.Физико-химические факторы среды 20
1.4.Элиситоры как индукторы вторичного метаболизма в клеточной культуре ткани 39
1.4.1 .Механизмы воздействия элиситоров на биосинтетические способности растительной клетки 42
1.4.2.Воздействие элиситоров на регуляцию метаболизма алкалоидов 47
1.5.Способы культивирования и их влияние на вторичный синтез в культуре ткани 59
1.5.1 .Культивирование интактных растений 5 9
1.5.2.Глубинное культивирование клеток растений в жидкой питательной среде (суспензионные культуры) 60
1.5.3.Культивирование иммобилизованных клеток 62
Выводы 65
Глава 2.Объект и методы исследования 68
2.1 . Объект исследования 68
2.2.Введение в культуру Catharanthus roseus L. 70
2.3.Получение каллусных тканей Catharanthus roseus L. 71
2.4.Получение суспензионной культуры 73
2.5.Иммобилизация тканей Catharanthus roseus L. на инертный носитель 74
2.6.Методы оценки физиологического состояния культуры 75
2.7.Определение содержания тяжелых металлов 77
2.8.Элиситоры в качестве биотического воздействующего фактора в культуре ткани Catharanthus roseus L. 79
2.9.Определение содержания протеина в каллусных тканях Catharanthus roseus 80
2.10.Определение флавоноидов в каллусной ткани Catharanthus roseus L. 80
2.11.Определение сапонинов 81
2.12.Количественное определение свободных аминокислот 82
2ЛЗ.Определение суммарного содержания алкалоидов 83
2Л4.Разделение алкалоидов Catharanthus roseus L. высокоэффективной жидкостной хроматографией 84
2.15.0пределение содержания хлорофилла 85
2.16.Определение ферментативной активности ферментов шикиматного пути хинатдегидрогеназы и шикиматдегидрогеназы 85
2.17.Определение химического состава плодового тела гриба Pleurotus ostreatus (FrKumm) 87
2.18.Методы исследования водных экстрактов древесной зелени 89
2.19.Культивирование дереворазрушающего высшего гриба Pleurotus ostreatus (Fr. Kumm) на послеэкстракционном остатке каллусной ткани Catharanthus roseus L. 92
Глава 3 .Введение в культуру Catharanthus roseus Ь. 93
З 1 .Получение интактных стерильных растений Catharanthus roseus L. в культуре in vitro 93
3.2.Получение каллусной ткани и суспензионной культуры Catharanthus roseus L. 100
3.3 .Влияние физико-химических параметров на процессы роста и развития каллусной ткани Catharanthus roseus L. 110
З.З.І.Влияние уровня освещенности на процессы роста и развития каллусной ткани Catharanthus roseus L. 110
3.3.2.Влияние концентраций сахарозы на рост и развитие каллусной ткани Catharanthus roseus L. 112
З.З.З.Влияние инозита и гидролизата казеина на рост ткани и накопление алкалоидов 117
З.ЗАВлияние гормонального состава среды на рост и развитие каллусной ткани Catharanthus roseus L. 122
З.З.З.Влияние модуляторов вторичного метаболизма на активности ключевых ферментов шикиматного пути 135
З.З.б.Влияние минерального состава среды на рост и структуру каллусной ткани Catharanthus roseus L. 137
3.3.7.Влияние фосфатного компонента на рост каллусной ткани и накопление алкалоидов 156
Глава 4,Способы получения клеточной культуры Catharanthus roseus L. 165
4.1 .Суспензионная культура Catharanthus roseus L. 165
4.2.Иммобилизация каллусной ткани Catharanthus roseus L. на
пенополиуретановые пластины 176
4.3.Влияние способа культивирования на рост и развитие каллусной ткани Catharanthus roseus L. 178
Глава 5.Влияние элиситоров различной природы на биосинтетическую способность клеточной культуры Catharanthus roseus L. 186
5.1 .Динамика роста и накопление индольных димерных алкалоидов в клеточной культуре Catharanthus roseus L. под действием элиситоров мицелиальных, дрожжевых грибов и хвойных экстрактов
5.2.Качественный и количественный состав свободных аминокислот в каллусной ткани Catharanthus roseus L. 199
5.3.Содержание биологически активных веществ в каллусной ткани Catharanthus roseus L. после элиситации 202
5.4.Активность ферментов шикиматного пути 207
5.5.Химический состав плодового тела гриба Pleurotus ostreatus (Fr. Kumm) 208
5.6.Состав водных экстрактов древесной зелени сосны 216
5.7.Питательная среда на основе хвойного водного экстракта сосны 219
Глава 6.Проблема регуляции и стратегии контроля процессов вторичного синтеза в культуре in vitro 222
Глава 7.Технология получения алкалоидов из растительного сырья 237
7.1 .Технологический процесс получения каллусной ткани и алкалоидов из каллусной ткани Catharanthus roseus L. 238
7.2.Оптимизация процесса извлечения алкалоидов из каллусной ткани Catharanthus roseus L. 242
7.2.1.Химический состав каллусной ткани Catharanthus roseus L. после культивирования дереворазрушающего гриба Pleurotus ostreatus
(Fr Kumm) 246
ВЫВОДЫ 249
ЛИТЕРАТУРА 252
ПРИЛОЖЕНИЯ 278
- Каллусная ткань в изолированной культуре
- Объект исследования
- .Получение интактных стерильных растений Catharanthus roseus L. в культуре in vitro
Введение к работе
Растительная клетка - уникальный источник ценных биологически активных веществ разной химической природы, которые обладают не только широким спектром лечебного действия, но и применяются в парфюмерии, пищевой промышленности, сельском хозяйстве. Химические аналоги данных веществ, как правило, содержат сопутствующие примеси, проявляющие негативное действие на организм человека и животных. Кроме того, многие специфические биологически активные вещества, такие как алкалоиды, являются продуктами отдаленного синтеза у растений и их искусственное получение затруднено в связи с многостадииностью процесса, низким выходом основного продукта и его дороговизной [1,2].
Поиск альтернативных источников и разработка методов получения биологически активных веществ растительного происхождения, по эффективности сопоставимых или превосходящих использование традиционного сырья определяет актуальность этой проблемы. Одним из таких методов является культура клеток и тканей растений in vitro,- Культивируемые клетки высших растений способны синтезировать традиционно используемые продукты растительного происхождения, создавать принципиально новые вещества, трансформировать дешевые предшественники в ценный продукт. Преимуществами данного метода является возможность получения продукта независимо от внешних климатических, почвенных условий, круглогодично и сохраняя при этом естественные ареалы ценных лекарственных растений [3,4,5].
Основной проблемой метода культуры тканей и клеток высших растений в аспекте получения ценных вторичных метаболитов является низкий конечный выход продукта. Это обусловлено тем, что в условиях in vitro клетки выходят из-под организменного контроля, присущего целому растению, и образуют специфическую биологическую систему с иной, чем в целом организме "сверхзадачей". Актуальным при использовании культур тканей и клеток высших растений с целью получения ценных вторичных веществ является
поиск условий, при которых обеспечивался бы оптимальный рост и оптимальное содержание вторичных веществ в биомассе. Основными факторами, регулирующими эти процессы в культуре in vitro, являются искусственные регуляторы роста и способы культивирования тканей и клеток.
Роль искусственных регуляторов роста в процессах деления клеток in vitro изучена достаточно глубоко. Однако, существенное влияние на выбор вида регулятора, его концентрации оказывает видовая принадлежность, генотип, а также эпигенетические факторы [6]. Поэтому подход к каждой конкретной культуре остается эмпирическим. Данные по влиянию регуляторов роста на процессы вторичного синтеза в разных культурах весьма противоречивы. Этот вопрос требует дальнейшего серьезного изучения [7].
Применение того или иного способа культивирования существенным образом определяет как скорость роста биомассы, так и интенсивность биосинтетических процессов. Традиционные методы культивирования (поверхностное и глубинное) имеют ряд существенных недостатков. Иммобилизация клеток на инертный носитель является перспективным подходом для биотехнологического использования культур высших растений. Преимуществами создаваемых клеточных культур по сравнению с традиционным растительным сырьем (дикорастущие или выращиваемые на плантациях растения) являются: 1) получение продукта независимо от внешних климатических, почвенных условий и возможность культивирования клеток тропических растений; 2) оптимизация и стандартизация условий выращивания; 3) перспективы полной автоматизации и компьютеризации процессов.
Культивирование тканей и клеток высших растений in vitro (в частности Catharanthus roseus L. Don) с целью их промышленного использования для получения соединений специализированного обмена определяет актуальность данного исследования.
Каллусная ткань в изолированной культуре
В настоящее время одним из важнейших аспектов рационального природопользования является создание биотехнологических производств на основе использования клеточных популяций, обладающих высоким биосинтетическим потенциалом. Это в большой мере способствует сохранению природных популяций многих видов растений. Культивирование интактных растений в условиях in vitro в основном связано с вопросами микроразмножения с целью оздоровления, интродукции in vivo, генетйко-селекционными исследованиями. Для получения биологически активных веществ in vitro традиционно используют каллусную ткань либо суспензии клеток [29-31].
В естественных условиях каллусная ткань образуется обычно как следствие травмы на раневой поверхности любого органа растения путем деления и роста клеток. Стимулирует эти клетки к делению как само раневое раздражение и вещества, выделяющиеся из разрушенных клеток, так и притекающие к месту поражения ауксины и питательные вещества [13]. Каллусная клетка, в результате деления которой возникает каллусная ткань или каллус, представляет один из типов клеточной дифференцировки, присущей высшему растению. Эта ткань механически защищает место поранения и накапливает ряд биологически активных веществ, выполняющих различные функции, обеспечивающие выживание растения в стрессовых условиях. В этой связи изучение свойств и культивирование каллусной ткани многих лекарственных растений в условиях in vitro представляет интерес, как источник получения ценных хозяйственно-полезных продуктов [3].
Для образования каллуса в условиях in vitro, который, в свою очередь, может дифференцироваться с образованием побегов и затем регенерантов, используют разнообразные экспланты. У травянистых растений экспланты можно получать из стеблей, листьев, лепестков цветков [16, 32-37]. Для получения морфогенного каллуса из многолетних растений часто берут органы, в которых клетки митотически активны, например верхушки побегов или выделенные из них участки меристемной ткани [38-41]. Размер и форма исходного экспланта до определенных пределов не оказывают влияния на пролиферацию каллуса, хотя существует минимальный критический размер, уменьшив который, нельзя вызвать рост экспланта [16].
Каллусообразование вызывают высокие концентрации ауксинов и низкие цитокининов. Формирование каллуса на агаризованной среде также можно индуцировать, добавляя1 только ауксин, например 0,45 мкМ 2,4-Д [16].
В искусственных условиях выращивание тканей проводят в термостате. Их выращивают как в темноте, так и на свету. Хорошо растущая ткань обычно за 30-40 дней увеличивает массу примерно в 100 раз. Остановка в росте на тридцатые сутки может происходить из-за истощения питательной среды, так и из-за старения самой ткани [3,16,18]. Для продолжения роста, каллусную ткань переносят на свежую питательную среду. Обычно после такого переноса культура входит в "лаг-фазу" - период адаптации клеток перед последующим ростом. Затем наступает фаза экспоненциального роста, для которой характерны увеличение числа клеточных делений и накопление биомассы. После периода роста культура переходит в стационарную фазу, что вызвано лимитирующим содержанием одного или более питательных веществ. Как в "лаг-фазе", так и в стационарной фазе клетки могут перейти в стрессовое состояние, а это, в свою очередь, приводит к потере жизнеспособности.
В зависимости от происхождения и условий выращивания каллусные ткани бывают: 1) рыхлыми, сильно оводненными, легко распадающимися на отдельные клетки; 2) средней плотности, с хорошо выраженными мери-стематическими очагами; 3) плотными с зонами редуцированного камбия и сосудов (в основном трахеоподобных элементов).
В цикле искусственного выращивания каллусные клетки после ряда делений проходят обычный для клетки растения онтогенез, они приступают к росту растяжением, затем дифференцируются как зрелые каллусные клетки и наконец деградируют [16]. После образования каллуса, что требует от 4 до 16 недель, его можно разделить и размножить на той же среде. Органогенез стимулируется изменением соотношения концентраций цитокининов и ауксинов, необходимых для формирования каллуса. Обычно, если для развития каллуса в среду вводится лишь ауксин, его концентрацию снижают и добавляют цитокинин. Изменение концентраций регуляторов роста в среде сопровождается появлением и ростом побегов [42].
Объект исследования
Многие виды лекарственных и декоративных растений, интродуцированные на территории России, в настоящее время рассматриваются как объекты, подпадающие под категорию видов, требующих специальной стратегии для их лучшего сохранения [216]. Крупномасштабное использование медленно возобновляемых плантаций постепенно приводит к их сокращению. В частности неуклонно сокращается выращивание Catharanthus roseus L. — растения, содержащего уникальную совокупность индольных димерных алкалоидов, используемых для получения противораковых препаратов. Культивируется Catharanthus roseus L. в природных условиях зон субтропического и тропического климата (рисунок 1). В нашей стране Catharanthus roseus L, интродуцирован на юге Краснодарского края [217].
Catharanthus roseus (L.) G. Don. - представитель семейства Лросіпасеае. Этот вид содержит моно- и димеры индольных алкалоидов, два из которых — винбластин и винкристин — используют как средства при различных формах лейкемии и в химиотерапии ряда опухолевых заболеваний. Эти алкалоиды очень дороги, их рыночная стоимость на мировом рынке составляет - винкристина — 1мг — 34,19 $, винбластина — 17,34 $ [218]. Для их получения используют интактные растения, где концентрация винбластина может достигать 2 мг/г сухой массы, но выделение винкристина осложнено его низкими концентрациями. Остальные мономерные алкалоиды обладают гипотонической и противоаритмической активностью [68,134].
Интродуцированные растения, как правило, содержат меньше подобных соединений. Исследования растительного сырья тропических видов растений показывают повышенное содержание некоторых хозяйственно важных биологически активных веществ, например, у побегов и листьев Catharanthm roseus L, Don., было обнаружено высокое содержание онколитических веществ.
В частности, содержание винбластина составило 0,0125 %, тогда как в отечественных образцах сырья - 0,005 %[220].
Сокращение природных ареалов и возделываемых площадей привело к тому, что медицинские препараты, содержащие эти алкалоиды, с 1990 года импортируются.
Именно поэтому Catharanthus ruseusL оказался интересным объектом в различных областях биотехнологии, среди которых наиболее важными являются клональное микроразмножение этого растения и получение индольных алкалоидов из культивируемых клеток.
Использование методов культуры клеток и тканей растений in vitro является одним из приоритетных путей сохранения генофонда Catharanthus roseus L.
.Получение интактных стерильных растений Catharanthus roseus L. в культуре in vitro
На начальном этапе исследования важно было получить пробирочные растения Catharanthus roseus L. для дальнейшего их использования в качестве стерильного маточного посадочного материала. Необходимость введения в культуру in vitro стерильных маточных растений Catharanthus roseus L. была обусловлена трудностями, связанными с инициацией образования и развития стерильной недифференцированной ткани (каллуса) и разработки условий её культивирования. Получение стерильных растений in vitro являлось одним из этапов первой задачи исследования: задачей разработки условий, способов и этапов получения клеточных линий Catharanthus roseus L.
Как показал анализ литературных данных, для введения в культуру in vitro Catharanthus roseus L. чаще всего используются питательные среды с минеральной основой по Мурасиге и Скугу (MS), Гамборгу (В-5), Ничам (NN), Кнудсону (С), Шенку-Хильдебрандту (ШХ). В данной работе были использованы среды с минеральной основой по MS, NN, С, В-5 и Sierlis.
Стерильные однолетние побеги Catharanthus roseus L. вводили на агаризованные питательные среды с минеральным составом по Мурасиге и Скугу, Серлису, Кнудсону и Ничам (таблица 1, приложение 1) без добавления гормонов. Всего на этом этапе было отобрано и введено в культуру in vitro по 80 эксплантов на каждой среде (всего изначально было введено в культуру 320 эксплантов).
Полученные данные относительно выживаемости эксплантов приведены в таблице 1.
В результате было обнаружено, что минеральный состав среды, при одних и тех же фото- и температурном режимах и одинаковом органическом фоне, влияет на процессы приживаемости, роста и регенерации введенных in vitro эксплантов.
На рисунке 2 представлены полученные пробирочные растения Catharanthus roseus L. в стерильной культуре.
Конкретизируя сказанное отметим, что низкосолевая среда Ничей (NN) вызывает этиолированность растений Catharanthus roseus L. — потерю хлоропластов при длительном культивировании. На среде Кнудсона этиолированности тканей не отмечалось, однако рост и развитие экспланта происходило медленнее, чем на высокосолевых средах Серлиса и Мурасиге-Скуга. На этой среде образование первых пазушных почек было отмечено лишь на 15-е сутки, тогда как на средах Серлиса и Мурасиге-Скуга первые пазушные почки появлялись уже на 8-10 сутки культивирования.
Среды Серлиса и Мурасиге-Скуга отличаются по количественному содержанию одного компонента — СаСЬ (3,32 мг/л в первом случае и 4,4 мг/л во втором). Отмечено, что различие в концентрации этого компонента не влияет на рост и приживаемость растений. Однако, забегая вперед, укажем, что содержание СаС12 в среде в совокупности с определенным гормональным фоном важно учитывать при культивировании каллусных тканей Catharanthus roseus L. Так, каллусы, культивировавшиеся на среде с минеральным составом по Мурасиге-Скугу и по Серлису, представляли собой рыхлые ярко-зеленые группы клеток меристемы и паренхимы, собранные в глобулярные образования диаметром до 1 мм имели структуру более подходящую для иммобилизации на инертный носитель, нежели каллусные ткани, культивируемые на среде Серлиса. В связи с этим, в исследованиях по иммобилизации тканей на инертный носитель, использовали среды с минеральным составом по Мурасиге-Скугу и Серлису.
Похожие диссертации на Научные основы индуцированного синтеза алкалоидов в клеточной культуре CATHARANTHUS ROSEUS L. (DON)
