Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 4 стр.
1.1. Актуальность темы 4 стр.
1.2. Цель и задачи исследований 5 стр.
1.3. Научная новизна 6 стр.
1.4. Практическая ценность 6 стр.
1.5. Апробация полученных результатов 7 стр.
1.6. Публикации 7 стр.
1.7. Объем и структура диссертации 7 стр.
2. Обзор литературы 8 стр.
2.1. Распространение и экономическая значимость пастереллезов 8 стр.
2.2. Историческая справка 9 стр.
2.3. Возбудители пастереллезов 13 стр.
2.4. Факторы патогенности P.multocida 14 стр.
2.5. Культивирование пастерелл 21стр.
2.6. Специфическая профилактика пастереллезов 25 стр.
3. Собственные исследования 31стр.
3.1. Материалы и методы 31стр.
3.2. Результаты исследований 35 стр.
3.2.1. Динамика накопления поверхностных антигенов пастерелл в процессе глубинного культивирования 35 стр.
3.2.2. Испытание возможности использования флокулянтов для концентрирования поверхностных антигенов пастерелл 46 стр.
3.2.3. Концентрирование поверхностных антигенов пастерелл методом ультрафильтрации на полых волокнах 56 стр.
3.2.4. Токсичность и реактогенность . минеральных масел и эмульгаторов, входящих в состав эмульгированных вакцин 57 стр.
3.2.5. Токсические свойства соматических антигенов пастерелл 60 стр.
3.2.6. Иммуногенная активность соматических антигенов P.multocida
трех серологических вариантов 63 стр.
3.2.7. Разработка контроля иммуногенной активности противопастереллезной вакцины 65 стр.
3.2.8. Испытание иммуногенной активности и реактогенности опытных серий вакцины против пастереллеза свиней 70 стр.
4. Обсуждение полученных результатов 73 стр.
5. Выводы 81 стр.
6. Практические предложения 83 стр.
7. Список литературы 84 стр.
8. Приложения 105 стр.
Введение к работе
1. 1.1. Актуальность темы '
Внедрение промышленной технологии в животноводстве, как правило, сопровождается концентрацией большого поголовья скота на ограниченной территории. В трудных экономических условиях современной России необходима не только правильная организация технологического процесса, но и высокая эффективность профилактических мероприятий против инфекционных заболеваний.
Такими заболеваниями являются пастереллезы сельскохозяйственных животных, вызываемые различными вариантами Pasteurella multoclda и Pasteurella haemolytica. Широкое носительство этих микроорганизмов в верхних отделах дыхательного тракта здоровых животных, стрессы, связанные с транспортировкой, недостатками в условиях содержания, несбалансированного кормления, а также вирусные инфекции способствуют повреждению защитных механизмов органов дыхания, создают благоприятные условия для развития пневмонийных пастереллезов, имеющих очень большое распространение.
Различные формы пастереллезов наносят большой экономический ущерб сельскому хозяйству многих стран мира, входит в число наиболее распространенных заболеваний (А. Н. Борисенкова, 1971, 1983, В. И. Геведзе и др., 1980, М. А. Сидоров, В. И. Геведзе, 1983, Н. А. Масимов, 1992, Д. Ф. Осидзе, 1987, G. R. Carter, 1967, 1981, N. Mashiro et al.,1992, К. R. Rhoades et. Al., 1992, G. Zhao et. Al., 1992, J. R. Brito et. AI., 1993). Разработка надежных средств специфической профилактики пастереллезов является актуальным вопросом в системе противоэпизоотических мероприятий.
Для борьбы с пастереллезами сельскохозяйственных животных учеными нашей страны и всего мира были разработаны живые и инактивированные вакцины, нашедшие широкое применение (Н. М. Никифорова, 1977, А. Н. Борисенкова, 1986, G. R. Carter, 1957, A. W. Confer et al., 1985, R. D. Olson et al.,
1986, M. W. Azam et al., 1991, A. Myint, 1992). Однако существующие вакцины изготавливаются из бактериальной массы пастерелл, выращенной без учета факторов патогенности, имеют ряд недостатков.
В связи с изложенным целесообразно усовершенствовать технологию промышленного изготовления противопастереллезных препаратов с учетом накопления, распределения, токсичности и перекрестной протективной активности биологических компонентов бактериальной клетки P.multocida, функционально относящихся к факторам патогенности возбудителя.
1. 2. Цель и задачи исследований.
Целью настоящей работы явилось изучение факторов патогенности P.multocida с целью разработки нового поколения вакцин против пастереллеза сельскохозяйственных животных.
В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:
1.2.1. В условиях Щелковского биокомбината проследить динамику
накопления поверхностных антигенов пастерелл в среде роста в процессе
производственного глубинного культивирования и установить сроки
накопления максимального количества поверхностных антигенов с учетом
динамики роста.
1.2.2. Изучить возможность адсорбции поверхностных антигенов
пастерелл растворами хитозана, испытать возможные физические и
сорбционные методы их концентрирования.
1.2.3. В опытах на лабораторных животных изучить токсические свойства соматических антигенов пастерелл различных серовариантов, их протективные характеристики при прямом и перекрестном заражении, а также токсичность промышленного адъюванта и его составляющих.
1.2.4. Усовершенствовать метод контроля иммуногенной активности противопастереллезнои вакцины по серологическим вариантам А, В и D с применением теста сывороточной защиты мышей и определением титра
антител к капсульним антигенам пастерелл в сыворотках крови иммунизированных подсвинков в РПГА.
1.2.5. С учетом полученных результатов изготовить и испытать опытные образцы поливалентной эмульгированной вакцины против различных форм пастереллезов сельскохозяйственных животных.
1.3. Научная новизна работы
В условиях производства прослежена динамика накопления поверхностных антигенов пастерелл в процессе глубинного культивирования и испытаны физические и сорбционные методы их концентрирования.
Изучены токсические свойства соматических антигенов пастерелл различных серологических серовариантов P.multocida и прослежены их прямые и перекрестные протективные характеристики. Одновременно изучена токсичность минерального масла «Маркол» и эмульгаторов, входящих в состав эмульгированной вакцины.
Усовершенствован метод контроля иммуногенной активности серологических вариантов пастерелл, входящих в состав вакцины. Изучена возможность контроля иммуногенности с применением серологических тестов.
С учетом разработанных технологических приемов, по новой технологии изготовлены и испытаны опытные серии вакцины эмульгированной поливалентной против пастереллезов свиней, кроликов и пушных зверей.
1. 4. Практическая значимость работы..
Результаты проведенных исследований позволяют внести
принципиальные изменения в технологию изготовления вакцин против
пастереллезов сельскохозяйственных животных с учетом особенностей роста
пастерелл в жидких питательных средах. Изучена токсичность и протективная
активность соматических антигенов, что позволяет снизить реактивность
противопастереллезных биологических препаратов и повысить их
иммуногенность.
Разработан контроль иммуногенной активности эмульгированной поливалентной вакцины против пастереллеза свиней, кроликов и пушных зверей по серологическим вариантам А, В и D. Изучена возможность применения РПГА с целью определения титра антител к капсульным антигенам пастерелл для оценки эффективности противопастереллезной вакцины. 1. 5 Основные положения, выносимые на защиту: 1.5.1. Результаты изучения динамики накопления поверхностных антигенов пастерелл в среде роста в процессе производственного глубинного культивирования и сроков накопления максимального количества поверхностных антигенов с учетом динамики роста
1.5.2. Результаты изучения возможности концентрирования
поверхностных антигенов пастерелл физическими и сорбционными методами.
1.5.3. Результаты изучения в опытах на лабораторных животных
токсических свойств соматических антигенов пастерелл различных
серовариантов, их протективных характеристик при прямом и перекрестном
заражении, а также токсичности промышленного адъюванта и его
составляющих.
1.5.4. Метод контроля иммуногенной активности
противопастереллезной вакцины по серологическим вариантам А, В и D с
применением теста сывороточной защиты мышей и определением титра
антител к капсульным антигенам пастерелл в сыворотках крови
иммунизированных подсвинков в РПГА.
1.5.5. Результаты испытания опытных образцов поливалентной эмульгированной вакцины против различных форм пастереллезов свиней, кроликов и пушных зверей.
1. 6. Апробация и публикация результатов.
Основные положения диссертации доложены: на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 70-летию со дня рождения В. А. Першина, 14 июля 1997 г.; на Пятой международной конференции «Новые
перспективы в исследовании хитина и хитозана», 25-27 мая 1999 г.; на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 30-летию института (ВНИТиБЩ 8-9 июня 2000 г.; на международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», 24-25 апреля 2003 г.
1. 7. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 121 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Работа иллюстрирована 11 таблицами, 3 графиками и 3 гистограммами. Список литературы содержит 217 источников, в том числе 100 иностранных.
Актуальность темы
Внедрение промышленной технологии в животноводстве, как правило, сопровождается концентрацией большого поголовья скота на ограниченной территории. В трудных экономических условиях современной России необходима не только правильная организация технологического процесса, но и высокая эффективность профилактических мероприятий против инфекционных заболеваний.
Такими заболеваниями являются пастереллезы сельскохозяйственных животных, вызываемые различными вариантами Pasteurella multocida и Pasteurella haemolytica. Эти микроорганизмы обитают в верхних отделах пищеварительного и дыхательного трактов здоровых животных. Стрессы, связанные с транспортировкой, недостатками в условиях содержания, несбалансированного кормления, а также вирусные инфекции способствуют повреждению защитных механизмов организма, что создает благоприятные условия для развития пневмонийных пастереллезов.
Различные формы пастереллезов наносят большой экономический ущерб сельскому хозяйству многих стран мира, входит в число наиболее распространенных заболеваний (А. Н. Борисенкова, 1971, 1983, В. И. Геведзе и др., 1980, М. А. Сидоров, В. И. Геведзе, 1983, Н. А. Масимов, 1992, Д. Ф. Осидзе, 1987, G. R. Carter, 1967, 1981, N. Mashiro et al.,1992, К. R. Rhoades et. Al., 1992, G. Zhao et. AL, 1992, J. R. Brito et. Al., 1993). Разработка надежных средств специфической профилактики пастереллезов является актуальным вопросом в системе противоэпизоотических мероприятий.
Для борьбы с пастереллезами сельскохозяйственных животных учеными нашей страны и всего мира были разработаны живые и инактивированные вакцины, нашедшие широкое применение (Н. М. Никифорова, 1977, А. Н. Борисенкова, 1986, G. R. Carter, 1957, A. W. Confer et al., 1985, R. D. Olson et al., 1986, M. W. Azam et al., 1991, A. Myint, 1992). Однако существующие вакцины изготавливаются из бактериальной массы пастерелл, выращенной без учета факторов патогенносте, имеют ряд недостатков.
Поэтому целесообразно усовершенствовать технологию промышленного изготовления противопастереллезных препаратов с учетом распределения и накопления поверхностных антигенов при выращивании в жидких питательных средах, с учетом токсичности и перекрестной протективной активности соматических антигенов.
1. 2. Цель и задачи исследований.
Целью настоящей работы явилось усовершенствование промышленной технологии изготовления вакцины против пастереллезов сельскохозяйственных животных, включающих в свой состав все серологические варианты P.multocida.
В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:
1. В условиях Щелковского биокомбината проследить динамику накопления поверхностных антигенов пастерелл в среде роста в процессе производственного глубинного культивирования и установить сроки накопления максимального количества поверхностных антигенов с учетом динамики роста.
2. Изучить возможность адсорбции поверхностных антигенов пастерелл растворами хитозана, испытать возможные физические и сорбционные методы их концентрирования. .
3. В опытах на лабораторных животных изучить токсические свойства соматических антигенов пастерелл различных серовариантов, . их протективные характеристики при прямом и перекрестном заражении, а также токсичность промышленного адъюванта и его составляющих.
4. Усовершенствовать метод контроля иммуногенной активности противопастереллезной вакцины по серологическим вариантам А, В и D с применением теста сывороточной защиты мышей .
Распространение и экономическая значимость пастереллезов
В последние годы все большее значение среди инфекционных болезней приобретают пастереллезы сельскохозяйственных животных. Это группа заразных антропозоонозных болезней поражает многие виды животных. Пастереллез распространен там, где имеются млекопитающие и птицы (Carter G. R., 1967, Barnum D. А., 1990). Энзоотическая геморрагическая септицемия крупного рогатого скота и водяных буйволов, вызываемая Pasteurella multocida серотипа Е, является серьезной проблемой для Африки. Большой экономический ущерб наносит пастереллез птиц фермерам западной Канады. В США периодически случаются вспышки эпизоотии холеры птиц (Bjorge R., Bolinbroke D., 1988). В странах Европы эти заболевания регистрируются среди домашних птиц, свиней, крупного и мелкого рогатого скота в виде спорадических случаев, но при условиях, способствующих его распространению, может приобретать характер эпизоотии (Rutter J. М., 1985, Aldova Е., Frederiksen W et al., 1992). Эпизоотической особенностью пастереллеза является тенденция, особенно выраженная среди птиц, к широкому распространению, а в неблагополучных хозяйствах к устойчивому стационарному течению. Способствует этому массовое передвижение животных без должного учета ! степени благополучия хозяйств по пастереллезу, отсутствия надлежащей организации хозяйственных и ветеринарно-санитарных мероприятий в животноводческих и птицеводческих хозяйствах, широкое использование в качестве животных кормов боенских отходов от больных животных и пастереллоносителей (Сосов Р. Ф., 1974).
Как сообщает Carter G. R (1981), фактически неограниченный диапазон хозяев этого вида доказывается фактами его выделения от нутрии, голубя, самца павлина, баклана, пеликана и грифа, от нутрий , снежных баранов
Скалистых гор, полевой мыши, кротов и кенгуру. В 1961 году Л. И. Бакулина выделяла пастерелл от песчанок.
У человека пастереллы не являются постоянными обитателями верхних дыхательных путей. В большинстве случаев заражались люди, контактировавшие с инфицированными животными. Кошки, зайцы, крысы и мыши могут заразить человека при укусе и нанесении царапин. Ухаживающий персонал может заразиться через укусы блох (Подкопаев В. М. и др., 1985).
Экономический ущерб от пастереллеза складывается из потерь от падежа, вынужденного убоя животных и затрат на проведение профилактических и оздоровительных мероприятий (Сосов Р. Ф., 1974). Летальность при пастереллезе колеблется от 10 до 75 %, а иногда и выше.
2.2. Историческая справка
Инфекционная природа этого заболевания была установлена в конце 19-го века. Пастереллез мелкого рогатого скота впервые описал Стинола в 1863 году как катаральную лихорадку овец. О. Bollinger в 1878 году описал болезнь диких животных и крупного рогатого скота, характеризующуюся сильной инфильтрацией и множественными геморрагиями на серозных и слизистых оболочках различных органов (Кадымов Р. А. и др., 1987). Род Pasteurella установил V. Trevisian в 1887 году.
На искусственных питательных средах возбудитель впервые был выращен Луи Пастером в 1880 году при исследовании кур. В последствии аналогичные микроорганизмы были выделены от многих видов домашних, диких животных и птиц. Они получали названия в соответствии с зоологической классификацией К. Линнея по видам животных, от которых они были изолированы: Bacillus aviseptica, B.boviseptica, B.suiseptica и т.д.
Дальнейшие исследования показали, что все эти бактерии относятся к одному виду и были объединены в одну таксономическую единицу. Современное общепринятое название Pasteurella multocida предложили С. Т. Rosenbusch и I. A. Merchant в 1939 году.
Материалы и методы
Исследования проводились в условиях бактерийного производства Государственного Щелковского биокомбината (ПЦБК), лаборатории бактериологии Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я. Р. Коваленко (ВИЭВ).
В работе использовали производственные штаммы Pasteurella multocida , относящиеся к следующим серологическим вариантам по Картеру: 1231, P.multocida капсульного типа А, изолированный от больных пневмонией свиней; 681 P.multocida капсульного типа В, выделенный при геморрагической септицемии крупного рогатого скота; Т - 80 P.multocida капсульного типа Д, изолированный от свиней с признаками пастереллезной пневмонии.
Штаммы получали в ВИЭВ в лиофилизированном состоянии с сахарозо — желатиновой защитной средой в ампулах под вакуумом, хранили при температуре 4 "С.
Сухие лиофилизированные культуры трех серовариантов высевали отдельно каждый штамм на сывороточный бульон Хоттингера в пробирках, сывороточный и кровяной агары Хоттингера в чашках Петри. Посевы помещали в термостат с температурой 37 С.
Через 18-20 часов из выращенных культур, готовили мазки, окрашивали их по Граму с целью изучения морфологии клеток. Для обнаружения капсулы готовили тушевые мазки по методу Бурри - Гинса (Лабинская А. С, 1978, Moller D. A. et al., 1989). Препараты изучали в световом микроскопе Биолам при увеличении х 100 в иммерсионной системе.
Выращенные колонии проверяли на типичность роста и капсулообразование в косопроходящем свете. Типичные колонии имели характерное оранжевое свечение.
Выращенные культуры P.multocida трех штаммов использовали для приготовления матровой расплодки для засева производственных реакторов.
Оптическую концентрацию культур определяли фотометрическим методом на КФК - 2 по калибровочной кривой. рН измеряли на лабораторном иономере И - 135М.1.
Для изучения безвредности, токсичности, реактогенности и иммуногенности минеральных масел, адъювантов, соматических антигенов P.multocida трех серологических вариантов, а также опытных и производственных серий использовано 36 подсвинков живым весом 10 — 12 кг, 27 кроликов массой 1,5 - 2 кг, 45 морских свинок массой 400 - 500 г, 75 голов белых мышей массой 20 - 25 г, 2425 голов белых мышей массой 16 - 18 г.
В качестве серологического теста применяли РПГА с использованием разработанных Л. Я. Ставцевой пастереллезных антигенных и антительных эритроцитарных диагностикумов к капсульным антигенам пастерелл 0,3 % -ной концентрации. Тест проводился в лаборатории бактериологии ВИЭВ ведущим научным сотрудником Л. Я. Ставцевой.
Статистическую обработку цифровых данных проводили в соответствии с методами, описанными в работах П. И. Ашмарина и др. (1962), Н. А. Плохинского (1970), Е. В. Гублера (1978). Расчет средней арифметической проводили по формуле:
