Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1 Линии ЭСК человека 12
1.1.1 Транскриптомные портреты линий ЭСК 13
1.1.2 Импринтинг в линиях ЭСК 17
1.1.3 Статус X хромосомы в линиях ЭСК 18
1.1.4 Стабильность кариотипа в линиях ЭСК 20
1.2 Культивирование и стабильность кариотипа ЭСК человека 22
1.2.1 Методы хромосомного анализа ЭСК 22
1.2.2 Фидер 24
1.2.2.1 Растворимые факторы фидера 24
1.2.2.2 Нерастворимый матрикс 25
1.2.2.3 Тип фидера 27
1.2.3 Способы пересева 28
1.2.3.1 Появление аномалий кариотипа ЭСК, культивировавшихся с помощью ферментативного пересева 29
1.2.3.2 Сохранение нормального кариотипа ЭСК, культивировавшихся с помощью ферментативного пересева 31
1.2.3.3 Кариотип ЭСК, культивировавшихся с помощью механического пересева 32
1.2.4 Проблема неопределённости факторов культивирования 32
1.3 Хромосомная изменчивость в линиях ЭСК человека 34
1.3.1 Особенности цитогенетического анализа ЭСК 35
1.3.2 Аномалии кариотипа ЭСК 36
1.3.2.1 Численные хромосомные аномалии 37
1.3.2.1.1 Наиболее распространённые численные аномалии хромосом...37
1.3.2.1.2 Редкие численные аномалии хромосом 39
1.3.2.2 Структурные хромосомные аномалии 39
1.4 Возможные последствия хромосомных аномалий 40
1.4.1 Возможные эффекты численных и структурных хромосомных аномалий 40
1.4.2 Эффект положения и трёхмерная структура ядра как фактор регуляции генной экспрессии 44
Глава 2. Материалы и методы 49
2.1. Материалы 49
2.1.1. Реагенты 49
2.1.2. Антитела, использованные для проведения иммуноокрашивания клеток и криосрезов эмбриоидных телец 49
2.1.3. Ферменты 50
2.1.4. Линии ЭСК 50
2.2. Методы 50
2.2.1. Приготовление фидера 50
2.2.1.1. Культивирование мышиных эмбриональных фибробластов 50
2.2.1.2. Инактивация митотической активности мышиных эмбриональных фибробластов 51
2.2.1.3. Предварительное культивирование фидера перед использованием51
2.2.2. Культивирование ЭСК 51
2.2.2.1. Культивирование ЭСК 51
2.2.2.2. Пересев ЭСК 52
2.2.3. Криоконсервация и размораживание клеток 53
2.2.4. Получение эмбриоидных телец 54
2.2.5. Получение криосрезов и измерение диаметра эмбриоидных телец. 54
2.2.6. Иммуноокрашивание клеток и криосрезов эмбриоидных телец 54
2.2.7. Получение фибробластоподобных производных на основе клеток hESMOl, hESM03, hESM04 55
2.2.7.1. Получение сублинии FhESMO 1.3 55
2.2.7.2. Получение сублиний дифференцированных клеток при спонтанной дифференцировке ЭСК in vitro 56
2.2.8. Получение препаратов метафазных хромосом ЭСК 56
2.2.9. Получение препаратов метафазных хромосом фибробластоподобных клеток 57
2.2.10. Дифференциальное окрашивание метафазных хромосом с помощью DAPI 58
2.2.11. GTG-дифференциальное окрашивание метафазных хромосом 58
2.2.12. С-дифференциальное окрашивание метафазных хромосом 58
2.2.13. Приготовление препаратов метафазных хромосом для FISH 58
2.2.14. Микродиссекция 59
2.2.14.1. Приготовление игл 59
2.2.14.2. Приготовление микропипеток 59
2.2.14.3. Приготовление покровных стекол 59
2.2.14.4. Приготовление препаратов метафазных хромосом 59
2.2.14.5. Микродиссекция метафазных хромосом 60
2.2.15. Приготовление ДНК-пробы из ВАС клона RP-11-4В17 60
2.2.16. ПЦР с частично вырожденными праймерами 61
2.2.17. Введение метки в ДНК микродиссекционных ДНК - библиотек 61
2.2.18. Супрессионная гибридизация in situ 62
2.2.19. Детекция на цитологических препаратах ДНК - проб 63
2.2.20. Микроскопический анализ препаратов после иммуноокрашивания и FISH 63
2.2.21. Получение препаратов для проведения трёхмерной гибридизации. 64
2.2.22. 3D FISH и иммуноокрашивание 64
2.2.23. Лазерная сканирующая микроскопия 64
Глава 3. Результаты и обсуждение 66
3.1. Кариотип клеток hESMOl-04 и характеристика клеток производных сублиний, полученных на их основе 66
3.1.1. Кариотип клеток hESMOl-04 и их фибробластоподобных производных 66
3.1.1.1. Кариотип клеток hESMOl-04 66
3.1.1.2. Хромосомы дифференцированных клеток, полученных на основе hESMOl-04 68
3.1.2. Особенности сублиний дифференцированных клеток, полученных на основе клеток hESM01-04 69
3.1.2.1. Особенности культивирования сублиний дифференцированных клеток, полученных на основе hESMOl, hESM03 и hESM04 69
3.1.2.2. Анализ наличия тканеспецифических маркёров в дифференцированных клетках сублиний, полученных на основе hESMOl, hESM03 и hESM04 69
3.1.3. Характеристика ЭСК, несущих аномальные хромосомы 71
3.1.3.1. Выделение сублиний ЭСК, несущих аномальные хромосомы... 71
3.1.3.2. Ростовые свойства клеток hESM01rl8 и hESM03der9 72
3.1.3.3. Анализ наличия маркёров, характерных для плюрипотентных клеток, в клетках hESM01rl8 и hESM03der9 73
3.1.3.4. Особенности получения сублиний дифференцированных клеток на основе hESM01rl8 и hESM03der9 73
3.1.3.5. Анализ наличия тканеспецифических маркёров в эмбриоидных тельцах и дифференцированных клетках сублиний, полученных на основе hESM01rl8 и hESM03der9 74
3.1.3.6. Кариотип дифференцированных клеток, полученных на основе hESM01rl8 и hESM03der9 75
Молекулярно-цитогенетическии анализ хромосомных аномалий в клетках hESM01rl8uhESM03der9 76
3.2.1. Анализ аномальной хромосомы в клетках hESM01rl8 76
3.2.2. Анализ аномальных хромосом в клетках hESM03der9 79
Сравнительный анализ положения в интерфазном ядре нормальных хромосом и их аномальных дериватов 87
3.3.1. Разработка методов идентификации хромосомных территорий в интерфазных ядрах ЭСК 87
3.3.2. Сравнительный анализ локализации хромосом 18 и г(18) 91
3.3.3. Сравнительный анализ положения хромосом 9 и der(9) 94
3.3.3.1. Сравнительный анализ положения хромосом 9 и der(9) 94
3.3.3.2. Сравнительный анализ объёма ядер клеток hESM03der9 и дифференцированных клеток сублиний, полученных на их основе97
Обсуждение 99
3.4.1. Основные направления изучения стабильности кариотипа ЭСК <^9
3.4.2. Фиксация аномальных хромосом в клеточных популяциях ЭСК... ~д Q2
3.4.3. Особенности хромосом недифференцированных клеток и метс=^п><дЬ1 хромосомного анализа "х 04
3.4.4. Хромосомные аномалии, выявленные в клетках bBSMnirig-hESM03der9 i07
3.4.5. Влияние хромосомных аномалий на общую архитектошиш интерфазного ядра
3.4.6. Возможности использования ЭСК, несущих аномальные хромосо в качестве экспериментальных моделей
Выводы
Список литературы
- Транскриптомные портреты линий ЭСК
- Появление аномалий кариотипа ЭСК, культивировавшихся с помощью ферментативного пересева
- Антитела, использованные для проведения иммуноокрашивания клеток и криосрезов эмбриоидных телец
- Кариотип клеток hESMOl-04 и их фибробластоподобных производных
Введение к работе
Актуальность проблемы
В настоящее время возможности практического использования эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) человека привлекают все более пристальное внимание. Все существующие линии ЭСК человека имеют такие общие характеристики как способность к самовоспроизведению, экспрессия специфических маркёров, способность к дифференцировке. В то же время появляется всё больше работ, в которых выявляются различия между разными линиями ЭСК. Несомненно, что генетическая нестабильность и связанное с ней изменение паттерна экспрессии генов могут давать вклад как в потенциал дифференцировки линий ЭСК человека, так и в процесс формирования клетками опухолевого фенотипа (Enver et al, 2005). Это существенно ограничивает возможности практического применения клеточных технологий на основе ЭСК. В то же время, при условии детального описания перестроенных хромосом, сублинии ЭСК с аномальным кариотипом могут оказаться мощным инструментом для изучения роли конкретных хромосомных районов в поддержании плюрипотентности ЭСК и определении спектра их возможной дифференцировки, а также механизмов формирования ряда патологий, сопровождающих раннее развитие эмбрионов, клетки которых отягощены аналогичными аномалиями.
Несмотря на интенсивные исследования в этой области информация в отношении стабильности кариотипа ЭСК человека остается весьма ограниченной и противоречивой. В литературе наряду с данными, свидетельствующими о стабильности кариотипа ЭСК человека при их культивировании in vitro, представлены факты появления в кариотипе ЭСК хромосомных аномалий и описаны примеры изменения ряда свойств ЭСК, сопутствующие таким аномалиям.
В настоящее время актуальным является не только детальный анализ хромосомных перестроек и сопутствующих им изменений экспрессии генов, но также и выяснение влияния хромосомных перестроек на общую архитектонику интерфазных ядер ЭСК человека. Результаты исследований, проведенных в последние годы, показали, что трёхмерная организация интерфазного ядра является одним из факторов регуляции генной экспрессии (Cremer, Cremer, 2001). Однако пока опубликована всего одна работа, посвященная исследованию трёхмерной
9 организации интерфазных ядер ЭСК человека (Wiblin et al, 2005). Полученные в этой работе результаты указывают на то, что архитектоника ядер ЭСК имеет ряд особенностей в сравнении с организацией ядер других типов клеток. В связи с этим исследования локализации и пространственной организации хромосом в ядрах ЭСК человека представляют особый интерес.
Цели и задачи работы
Целью настоящей работы является определение закономерностей реорганизации кариотипа эмбриональных стволовых клеток человека серии hESM и сопутствующих им изменений в процессе культивирования in vitro.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
провести на разных пассажах кариотипирование четырёх независимо полученных линий ЭСК человека (hESMOl, hESM02, hESM03 и hESM04) при культивировании их в виде набора индивидуальных сублиний;
при выявлении аномальных хромосом провести их детальный молекулярно-цитогенетический анализ;
провести сравнительный анализ характеристик ЭСК исходных линий hESMOl-04 и сублиний с выявленными хромосомными перестройками;
разработать метод визуализации и идентификации хромосомных территорий перестроенной хромосомы и её нормального гомолога в трёхмерном пространстве интерфазного ядра ЭСК;
провести оценку влияния хромосомных перестроек на положение хромосом в интерфазных ядрах ЭСК.
Научная новизна и практическая ценность работы
Показана возможность сохранения нормального кариотипа эмбриональными стволовыми клетками человека серии hESM при длительном культивировании, что является необходимым условием для получения большого количества этих клеток и их практического использования.
Выявлены и детально охарактеризованы аномальные хромосомы, являющиеся производными хромосом 9 и 18, аналогичные ранее описанным аномалиям у пациентов с рядом патологий. Выделенные сублинии ЭСК с соответствующими хромосомными перестройками могут способствовать созданию
10 экспериментальной модели для изучения механизмов развития таких патологий и способов их профилактики.
Разработаны методы, которые впервые позволили провести одновременную визуализацию хромосомных территорий перестроенных хромосом и их нормальных гомологов в трёхмерном пространстве интерфазных ядер ЭСК. Впервые для визуализации целых хромосомных территорий были использованы микродиссекционные ДНК-пробы. Впервые проведено сравнение положения отдельных хромосом и их перестроенных гомологов в интерфазных ядрах ЭСК человека, а также расположения гомологичных районов в составе хромосомных территорий перестроенной хромосомы и её нормального гомолога.
Апробация работы
Результаты работы были представлены: на конференции "Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты", Москва, 17-18 ноября 2005; на VI Международной конференции по молекулярной генетике соматических клеток, Звенигород, 12-16 декабря 2005; на первом конгрессе Германского общества исследователей стволовых клеток, Cologne, Германия, июль 2006; на Всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре», Санкт-Петербург, 17 -19 октября 2006; на отчётной сессии ИЦиГ, Новосибирск, февраль 2007; на Британско-Российском совещании "Стволовые клетки: законодательство, исследования и инновации", Москва, март 2007; на XLV Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс», Новосибирск, апрель 2007; на II Региональной конференции молодых учёных им. академика РАМН Н.В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии», Томск, 27 апреля 2007; на Международной молодёжной научно-методической конференции, Томск, 9-12 мая 2007; на II съезде Общества клеточной биологии, Санкт-Петербург, 16-19 октября 2007.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 14 работ, из них 4 в рецензируемых журналах из списка ВАК. Ещё одна работа принята в печать в журнал "Cell cycle".
Вклад автора
Автор принимал личное участие в планировании, проведении и обсуждении всех экспериментов, по результатам которых написана данная работа.
Культивирование ЭСК проводилось совместно с к.б.н. М.А. Лагарьковой (ИОГен РАН). Получение микродиссекционных проб и визуализация хромосомных территорий в трёхмерном пространстве интерфазного ядра проводилось совместно с д.б.н. Н.Б. Рубцовым и к.б.н. Т.В. Карамышевой. Большая часть экспериментов была проведена автором самостоятельно. Личный вклад автора в работу является определяющим.
Структура и объём диссертации
Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (133 ссылки). Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста, иллюстрирована 20 рисунками и содержит 4 таблицы.
Транскриптомные портреты линий ЭСК
Получение линий ЭСК de novo сопровождалось немногочисленными указаниями на различия по характеристикам этих клеток. В работе Кован с соавторами (Cowan et al, 2004) приведены данные о времени удвоения полученных авторами линий ЭСК с нормальным кариотипом. Это время составило 24-48 часов для клеток 11 линий и 60-72 часа для клеток трёх других линий. В работе Инзунза с соавторами (Inzunza et al, 2004) приведены данные о том, что ЭСК одной из трёх полученных ими линий значительно чаще претерпевали спонтанную дифференцировку. Так как стало очевидно, что линии ЭСК могут существенно отличаться по таким общим характеристикам, то актуальным стал поиск генов, экспрессией которых отличаются клетки этих линий.
До работы группы учёных The International Stem Cell Initiative (Adewumi et al, 2007) были опубликованы результаты исследований отдельных авторов, посвященных сравнению паттернов генной экспрессии в различных линиях ЭСК. К сожалению, в этих работах было проведено сравнение очень небольшого числа клеточных линий. Например, работа Зенга с соавторами (Zeng et al, 2004) была посвящена сравнению профиля экспрессии генов только в двух линиях ЭСК, а именно BG01 и BG02. В результате этого исследования не было найдено значимых различий в профиле экспрессии генов в линиях BG01 и BG02. Однако было установлено, что из 373 транскриптов, характерных для обеих линий, 92 были также выявлены в других линиях ЭСК, а 281 оказались специфичными только для BG01HBG02.
Сравнение с помощью микрочиповой технологии результатов массового параллельного индивидуального секвенирования (massively parallel signature sequencing - MPSS), анализа экспрессирующихся последовательностей (expressed sequence tag - EST) , серийного анализа генной экспрессии (serial analysis of gene expression - SAGE) независимо полученных линий ЭСК показало, что некоторые гены экспрессируются в них неодинаково (Brandenberger et al, 2004; Richards et al, 2004). Более того, в работе Жонга с соавторами (Zhong et al, 2008) показано, что уровень экспрессии ряда генов может существенно варьировать даже в разных клетках одной и той же линии ЭСК. В работе Ричардса с соавторами (Richards et al, 2004) авторы исходили из предположения, что транскриптомный портрет разных линий ЭСК может помочь определить механизм, ответственный за возникновение различий в ростовых характеристиках, склонности к спонтанной дифференцировке и другим параметрам ЭСК разных линий. Необходимо также напомнить, что различия в поведении ЭСК линий HES3 и HES4 на разном фидере были ранее охарактеризованы этой же группой авторов (Richards et al, 2003). С помощью SAGE было показано, что более 70% (8341 из 11579) проанализированных транскриптов представлены в обеих линиях. Более того, уровень экспрессии этих транскриптов в основном одинаков. Значимые различия по уровню экспрессии были выявлены для 175 транскриптов. Только один транскрипт, REX1, не был выявлен в одной из этих линий, причём этот результат SAGE был верифицирован с помощью полуколичественной ОТ-ПЦР. Менее 30% (3063 из 11579) транскриптов, характерных для ЭСК, которые не были выявлены в ЭСК обеих линий, представляли собой «редкие» транскрипты (менее трёх копий на клетку). Возможно, что использование более детального анализа позволит выявить эти «недостающие» транскрипты в обеих линиях (Richards et al, 2003). В одной из линий был повышен уровень экспрессии некоторых генов, ассоциированных с процессом дифференцировки, что, по мнению авторов, может указывать на небольшую контаминацию ЭСК спонтанно дифференцированными клетками. Наконец, некоторые из выявленных различий оказались связаны с тем, что одна из исследуемых линий имела хромосомный состав 46,ХХ, а вторая - 46,XY.
Для линии ЭСК BG03 с помощью микрочипового анализа был охарактеризован профиль экспрессии 454 генов маркёров стволовых клеток, цитокинов и членов семейства TGF/BMP сигнального пути (Brimble et al, 2004). В отличие от аналогичных исследований (Baker et al, 2007; Harrison et al, 2007) в работе Бримбла перед проведением анализа ЭСК проходили 15 пассажей в бесфидерных условиях. Было показано, что профиль экспрессии генов ОСТ4, CD9, SOX2, ZFP42, EGR2 в основном сходен с таковым, полученым для ЭСК, культивируемых на фидере. Значимое различие в уровне экспрессии генов в ЭСК, культивировавшихся на фидере и в бесфидерных условиях, было показано только для гена SOX1. Авторы объясняют этот факт возможностью спонтанной спорадической дифференцировкой ЭСК по нейрональному пути в бесфидерных условиях. Кроме того, в работе Бримбла с соавторами (Brimble et al, 2004) приведены данные по определению маркёров STR (short tandem repeat - короткие тандемные повторы) в генах HLA, которые различались в клетках разных исследованных линий. Анализу индивидуальных для каждой линии последовательностей посвящено также исследование Бхаттахаруа (Bhattacharya et al, 2004). В этом исследовании, также как в работах Бримбла, Ричардса и Карпентер с соавторами (Brimble et al, 2004; Richards et al, 2004; Carpenter et al, 2004), было отмечено сходство экспрессии генов в разных ЭСК. В то же время опубликован ряд работ, посвященных преимущественно анализу различий в профиле генной экспрессии в разных линиях ЭСК. Число генов, проявляющих достоверно отличающийся уровень экспрессии, составило 25% от всех вовлеченных в сравнение при анализе линий HI и BG02 (Rao, Slice, 2004), 48% -при анализе линий HSF-1, HSF-6 и Н9 (Abeyta et al, 2004), 20% - при анализе линий HS181, HS235, HS237, FES21, FES22, FES29 и FES30 (Skottman etal, 2005).
Для того чтобы определить, как соотносятся эти, на первый взгляд, противоречивые результаты исследований, в 2007 году группой учёных The International Stem Cell Initiative было охарактеризовано одновременно 59 линий ЭСК из 17 лабораторий мира (Adewumi et al, 2007). Целью этой работы было установить сходства и различия в экспрессии специфических генов в ЭСК разного происхождения и выявить маркёры, с помощью которых можно идентифицировать индивидуальные линии. Несмотря на различные генотипы, способы получения и поддержания этих линий, клетки всех линий имели сходный паттерн экспрессии ряда специфических генов: SSEA3 и SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81, GCTM2 и GCT343, CD9, Thyl (CD90), щелочную фосфатазу, NANOG, ОСТ4, TDGF1, DNMT3B, GABRB3 и GDF3. В то же время было показано, что существуют различия по некоторым генам, которые были названы специфичными для линий. Кроме того, некоторые гены, подверженные импринтингу, экспрессировались неодинаково в разных линиях. Подобные различия между линиями характерны не только для ЭСК
Появление аномалий кариотипа ЭСК, культивировавшихся с помощью ферментативного пересева
Результаты немногочисленных исследований указывают на то, что способ пересева клеток на ранних пассажах может являться критическим фактором для появления хромосомных аномалий в ЭСК. Описанные в работе Миккола с соавторами (Mikkola et al, 2006) хромосомные аномалии были выявлены после того, как механический способ измельчения колоний при пересеве был заменён на ферментативный, с использованием коллагеназы IV. В исследовании Бримбла с соавторами (Brimble et al, 2004) приведены данные, свидетельствующие в пользу того, что ферментативный способ пересева может способствовать появлению в культуре анеуплоидных клеток. К такому же выводу подталкивают результаты работы Кована с соавторами (Cowan et al., 2004), в ходе которой, начиная с пятого пассажа, был использован ферментативный метод для пересева 17 линий ЭСК.
После проведения нескольких десятков пассажей с использованием ферментативного пересева в линиях HUES1,3,4 были выявлены хромосомные перестройки (Cowan et al, 2004).
Изучению состояния кариотипов клеток линий BG01 и BG02 при разных способах пересева было посвящено специальное исследование Миталиповой с соавторами (Mitalipova et al, 2005). Авторы показали, что ЭСК линий BG01, BG02 и BG03 сохраняли нормальный диплоидный кариотип после проведения с помощью механического измельчения и переноса колоний 52, 32 и 34 пассажей, соответственно. Кариотип линий BG01 и BG02 сохранялся стабильным на протяжении более ста пассажей при использовании механического способа пересева. С механическим способом измельчения авторы сравнили два других: с использованием специального буфера для диссоциации клеток и ферментативный способ с использованием трипсина. На первом этапе эксперимента клетки обеих линий пересевали механически в течение более чем 40 пассажей, при этом хромосомные аномалии не были выявлены. На втором этапе способ пересева был изменён на способ с использованием специального буфера для диссоциации клеток. После проведения немногим более 20 пассажей в кариотипах клеток обеих линий были выявлены дополнительные хромосомы. Кроме того, в одной из полученных сублиний BG02 был выявлен мозаицизм по инверсии в хромосоме 17. Для обеих полученных сублиний одинаковой характерной особенностью оказалась трисомия по хромосоме 17. При переходе после проведения 12 пассажей от механического способа пересева к ферментативному с использованием трипсина в кариотипе одной из сублиний BG02 были выявлены дополнительные копии пяти хромосом. От момента смены способа пересева до выявления этих хромосомных аномалий было проведено более 50 пассажей. Ранее Бримблом с соавторами (Brimble et al, 2004) также были получены различные варианты сублиний с аномальным кариотипом на основе линии BG01. В этой работе аномальные сублинии были получены после проведения сорока семи пассажей с использованием коллагеназы и трипсина для пересева.
Дополнительные указания на возможную зависимость увеличения частоты появления хромосомных перестроек ЭСК от использования ферментативного пересева в ходе длительного культивирования можно найти в работах ряда авторов (Inzunza et al, 2004; Baker et al, 2007; Maitra et al, 2005; Josephson et al, 2006). В исследовании Инзунза с соавторами (Inzunza et al, 2004) при пересеве клеток линии HS181 использовался комбинированный метод диспазной обработки с последующим механическим измельчением колоний ЭСК. В результате длительного культивирования в кариотипе клеток появилась стабильная хромосомная перестройка. В исследованиях Бэйкера с соавторами (Baker et al, 2007) и Энвера с соавторами (Enver et al, 2005) рассматривается проблема нестабильности кариотипа ЭСК в процессе длительного культивирования, при котором использовались ферментативные методы пересева. В работах Майтра с соавторами (Maitra et al, 2005) и Джозефсона с соавторами (Josephson et al, 2006), в которых проанализированы различия линий ЭСК с помощью методов молекулярной биологии, также использовались ферментативные способы пересева ЭСК. Следует отметить, что, несмотря на различия в использовании фидера, а также в составе сред, которые использовались в работе Джозефсона с соавторами (Josephson et al, 2006), в клетках проанализированных ими линий не было выявлено новых перестроек по сравнению с теми, которые были выявлены в этих же линиях в предшествующей работе Майтра с соавторами (Maitra et al, 2005).
Как следует из результатов работ Амита и Ицковича-Элдора (Amit, Itskovitz-Eldor, 2006; Amit et al, 2004) и Людвига с соавторами (Ludwig et al, 2006), использование ферментативного способа пересева не всегда сопровождается изменением нормального кариотипа ЭСК. В работе Амита и Ицковича-Элдора (Amit, Itskovitz-Eldor, 2006), где авторы использовали ферментативный способ пересева, не было выявлено никаких изменений в кариотипе клеток линии Н9 и двух субклонов, полученных на её основе. В другой работе Амита с соавторами (Amit et al, 2004) было проведено сравнение трёх линий ЭСК при различных условиях культивирования. Только в одной из исследованных сублиний после проведения 20 пассажей в бесфидерных условиях с использованием коллагеназы IV для пересева была выявлена трисомия по хромосоме X. Эта аномалия была представлена в 40% исследованных клеток. Ферментативный способ пересева ЭСК использовался также для культивирования всех сублиний ЭСК в работе Людвига с соавторами (Ludwig et al, 2006), где представлены данные как об отягощенном трисомией по хромосомам X и 12, так и о нормальном кариотипах ЭСК в разных условиях культивирования. Возможно, расхождения в результатах, полученные авторами, обусловлены индивидуальными особенностями линий ЭСК, которые были использованы для исследования. Отсутствие стандартизированных методов пересева, времени между пересевами и состава среды также может отчасти объяснять полученные расхождения в результатах.
Антитела, использованные для проведения иммуноокрашивания клеток и криосрезов эмбриоидных телец
Для приготовления фидера мышиные эмбриональные фибробласты культивировали в течение трёх пассажей, при каждом пассаже монослой клеток рассевали 1:3. Культивирование проводили на 10 см чашках Петри в среде DMEM (Hyclone, high glucose), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (Hyclone) и антибиотики (пенициллин/стрептомицин в концентрации, указанной производителем, Gibko), в атмосфере 6,5% СОг при 37С, пересев осуществляли с использованием 0,05% трипсина/ЭДТА (Hyclone).
После того, как мышиные эмбриональные фибробласты дорастали до монослоя после проведения третьего пассажа, проводили инактивацию их митотической активности. Митомицин С (Sigma) растворяли в PBS до концентрации 1мг/мл и фильтровали через 0,22 мкм целлюлозно-ацетатный фильтр (Corning). Полученный раствор добавляли в культуральную среду до концентрации 10 мкг/мл и инкубировали в этой среде мышиные эмбриональные фибробласты в течение 2 часов в атмосфере 6,5% С02 при 37С. После инкубации клетки дважды промывали PBS, после чего замораживали как описано в разделе 2.2.3.
Фидер размораживали, выдерживали в течение 1-2 суток в атмосфере 6,5% С02 при 37С. Затем высевали в среду DMEM (Hyclone, high glucose), содержащую 10% фетальной бычьей сыворотки (Hyclone) и антибиотики, на желатинизированные чашки Петри в количестве примерно 80% от монослоя. Для обработки чашек желатином за полчаса до высаживания клеток чашки Петри промывали 0,01% раствором проавтоклавированного желатина (Sigma). Для культивирования ЭСК сублинии hESM01rl8 помимо фидера указанной плотности также использовали фидер меньшей плотности (30-50% от монослоя).
Колонии ЭСК человека культивировали на желатинизированных 35мм чашках Петри (Costar) в среде KODMEM (Invitrogen), содержащей 20% заменителя сыворотки (Invitrogen), О.ІмМ р-меркаптоэтанол (Sigma), ІмМ глутамин (Hyclone), їх смесь заменимых аминокислот (Gibco), 4нг/мл bFGF (Chemicon) и антибиотики, в атмосфере 6.5% С02 при 37С с использованием фидера из митотически инактивированных мышиных эмбриональных фибробластов. Пересев проводили один раз в 4-7 дней в зависимости от плотности и размера колоний и доли спонтанно дифференцировавшихся клеток.
На последовательных пассажах ЭСК часть клеток подвергали криоконсервации, как описано в разделе 2.2.3, остальные клетки культивировали в течение ряда пассажей. Параллельно, по мере необходимости, криоконсервированные ЭСК размораживали и культивировали. Таким образом, каждая линия ЭСК была представлена серией параллельно или последовательно культивировавшихся сублиний. Каждая из четырёх исходных линий ЭСК была представлена серией из 6-16 таких сублиний.
В зависимости от плотности колоний ЭСК и доли спонтанно дифференцировавшихся клеток для пересева выбирали механический или комбинированный с применением фермента способ пересева. Для краткости далее комбинированный способ пересева называется «ферментативным». Следует подчеркнуть, что ферментативный пересев использовали уже после выделения сублиний hESM01rl8 и hESM03der9.
Перед пересевом с помощью механического способа культуральную среду заменяли на свежую, после чего колонии ЭСК нарезали на фрагменты величиной примерно по 100-300 клеток и отделяли от дна чашек Петри с помощью металлической иглы или пластикового наконечника для автоматических пипеток. Полученную взвесь фрагментов колоний ЭСК переносили на новый фидер.
Ферментативному способу пересева отдавали предпочтение в тех случаях, когда доля спонтанно дифференцировавшихся клеток была незначительна (3-10 колоний в чашке Петри диаметром 3,5 см) при большой плотности колоний ЭСК (примерно 80% и более площади поверхности дна чашки Петри). Перед ферментативной обработкой из чашек Петри с помощью металлической иглы удаляли дифференцированные колонии или их участки. Ферментативный пересев проводили с помощью 0,5-1 минутной инкубации при комнатной температуре в предварительно нагретом до 37С 0.05% трипсине (Gibco) или 10-15 минутной инкубации при 37С в растворе коллагеназы IV (Invitrogen) концентрации 1 мг/мл. После инкубации проводили инактивацию фермента с помощью добавления 10-20 кратного избытка среды с 20% заменителем сыворотки. Полученную смесь растворов фермента и среды удаляли и добавляли новую порцию культуральной среды, в которой проводили снятие всех клеток со дна чашек Петри. Колонии клеток соскабливали с поверхности дна чашки Петри с помощью пластикового наконечника для автоматических пипеток. Полученную взвесь переносили на новый фидер.
Для криоконсервации ЭСК снимали со дна чашек Петри так же, как и в случае пересева. Оттаивание оказывалось более успешным в том случае, если замораживали более крупные фрагменты колоний ЭСК (примерно по 400-800 клеток). Для снятия ЭСК со дна чашек Петри осуществляли выбор между механическим и ферментативным способами на тех же основаниях, что и для пересева клеток. После снятия клеток полученную взвесь центрифугировали (1000 об/мин 3 минуты), супернатант заменяли на смесь, содержащую 10% ДМСО (Fluko) и 90% фетальной телячьей сыворотки (Invitrogen), полученную суспезию клеток переносили в криопробирку. Криопробирки помещали в пенопластовую коробку с толщиной стенки 1 см, которую, в свою очередь, помещали в кельвинатор с температурой -70С на ночь, после чего криопробирки переносили в жидкий азот.
Кариотип клеток hESMOl-04 и их фибробластоподобных производных
Клетки линии hESMOl анализировали на пассажах 11, 19, 23, 37 и 49, линии hESM03 - на пассажах 8, 39 и 40, клетки линии hESM04 - на пассажах 13-22, 36 и 42, клетки линии hESM02 - на пассажах 16, 17, 22 и 36. Для анализа были использованы клетки двух параллельных сублиний (в случае клеток hESM02-04) и трёх в случае клеток hESMOl (таблица 1).
В связи с тем, что не каждая фиксация клеток позволяла получить препараты с достаточным количеством метафазных пластинок хорошего качества, в ряде случаев был проведён цитогенетический анализ клеток на следующем пассаже. Таким образом, удалось довести до 20 число проанализированных метафазных пластинок на пассажах 16-17 клеток hESM02 и на пассажах 39-40 клеток hESM03 (таблица 1). В большинстве проанализированных метафазных пластинок не было обнаружено хромосомных перестроек. В то же время в ходе исследования встречались единичные хромосомы, про которые на данном уровне разрешения цитогенетического анализа нельзя было с уверенностью сказать, что они являются нормальными гомологами соответствующих хромосом. Отсутствие сходных «подозрительных» хромосом в других изученных клетках указывало на то, что подобные аномальные хромосомы присутствовали в небольшом проценте клеток и не фиксировались в клеточной популяции в процессе культивирования. Анализ рисунка дифференциального окрашивания хромосом позволяет выявить хромосомные перестройки размером 1-2 бэнда (Ronne, 1990), для верификации таких результатов и проведения более детального картирования необходимо применять методы молекулярной цитогенетики. С учетом данного разрешения проведённый анализ свидетельствует о том, что культивирование не сопровождается дестабилизацией кариотипа, по крайней мере, в некоторых сублиниях клеток hESM01-04.
Следует отметить, что в кариотипе фибробластоподобных клеток, полученных при дифференцировке клеток hESMOl, hESM03 и hESM04, не было выявлено стабильных хромосомных перестроек, также как и при прямом цитогенетическом анализе ЭСК соответствующих линий. Не исключено, что дифференцировку проходили преимущественно клетки с нормальным кариотипом, кроме того, получение дифференцированных производных требовало проведения 2-3 дополнительных пассажей, что могло привести к отбору клеток с нормальным кариотипом. Цитогенетический анализ был проведён для трёх сублиний дифференцированных клеток, полученных в независимых экспериментах на основе линии hESMOl, в том числе, для сублинии FhESM01.3, а также для дифференцированных клеток трёх сублиний, полученных в независимых экспериментах на основе hESM03 и двух сублиний, полученных в независимых экспериментах на основе hESM04. Анализ дифференцированных клеток проводился на 3-5 пассажах после дифференцировки, а для сублинии FhESM01.3 был проведён анализ на 5, 8 и 10 пассажах после дифференцировки, в каждом случае было проанализировано, как минимум, по 20 метафазных пластинок.
Общий вид дифференцированных клеток, полученных на основе hESMOl, hESM03 и hESM04 представлен на рисунке 2а. Для полученных фибробластоподобных клеток было характерно сокращение времени клеточного цикла, что проявлялось как уменьшение времени между пересевами (время, за которое клетки дорастают до монослоя после пересева из расчета 1:3) с каждым последующим пассажем. Для дифференцированных производных, полученных на основе hESMOl, hESM04 и hESM03 на первом-втором пассаже это время составляло около 13 дней, на третьем-пятом около пяти-семи дней, и для сублинии FhESM01.3, культивирование которой осуществлялось до 11 пассажа, время между пересевами снизилось до 2-3 дней. Морфология дифференцированных клеток в ходе культивирования, последовавшего за диференцировкой, не претерпела значительных изменений, также не было отмечено изменения типа роста на многослойный.
