Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Характеристика класса наследственных болезней обмена веществ 18
1.1. Историческая справка 18
1.2. Классификация наследственных болезней обмена веществ 21
1.3. Механизмы патогенеза при наследственных болезнях обмена веществ 25
1.3.1. Метаболические изменения при наследственных болезнях обмена веществ 26
1.3.1.1. Накопление субстрата 27
1.3.1.2. недостаточность продуктов реакции 30
1.3.1.3. Влияние продуктов или субстратов блокированной ферментной реакции на другие метаболические процессы 31
1.3.1.4. Метаболическая изоляция 32
1.3.2. Первичный биохимический дефект при наследственных болезнях обмена веществ 33
1.4. Типы наследования при наследственных болезнях обмена веществ 35
1.5. Эпидемиология наследственных болезней обмена веществ 36
1.6. Клинические проявления наследственных болезней обмена веществ 41
1.7. Общие принципы лабораторной диагностики наследственных болезней обмена веществ 1.7.1. Этап исследования метаболитов 45
1.7.2. Этап исследования белков 48
1.7.3. Этап исследования мутантных генов 51
1.7.4. Массовый и селективный скрининг на наследственные болезни обмена веществ 54
1.7.4.1. Тандемная масс-спектрометрия в массовом скрининге новорожденных 55
1.7.4.2. Селективный скрининг наследственных болезней обмена веществ 58
1.8. Лечение наследственных болезней обмена веществ. Основные принципы и перспективы 59
Глава 2. Материалы и методы исследования 64
2.1. Характеристика выборок и материала для исследований 64
2.2. Экспериментальные методы 65
2.2.1. Тандемная масс-спектрометрия 65
2.2.2. Высокоэффективная жидкостная хроматография тандемная масс-спектрометрия органических кислот мочи 67
2.2.3. Газовая хроматография - масс-спектрометрия 67
2.2.4. Определение концентрации очень длинноцепочечных жирных кислот в плазме крови 68
2.2.5. Определения активности галактозо-1-фосфат уридилтрансферазы 68
2.2.6. Молекулярно-генетические методы исследования 70
2.2.7. Создание тест-систем для молекулярной диагностики галактоземии тип 1, тирозинемии типі, недостаточности альфа 1 -антитрипсина 71
2.2.7.1. Синтез олигонуклеотидов 71
2.2.7.2. Изготовление микрочипов 71
2.2.7.3. Мультиплексная полимеразная цепная реакция 72
2.2.7.4. Гибридизация на микрочипе 72
2.2.7.5. Регистрация результатов 73
2.3. Статистическая обработка результатов исследований 74
Глава 3. Анализ частоты наследственных болезней обмена веществ в Российской Федерации 75
3.1. Спектр и относительные частоты отдельных подклассов наследственных болезней обмена веществ 75
3.2. Анализ нозологической структуры наиболее представленных подклассов наследственных болезней обмена веществ 78
3.2.1. Нозологическая структура лизосомных болезней накопления 78
3.2.2. Нозологическая структура группы митохондриальных болезней 81
3.3. Анализ частот заболеваний из группы лизосомных болезней накопления в России (Центральный федеральный округ) 84
Глава 4. Оптимизация методов биохимической и молекулярно-генетической диагностики наследственных болезней обмена веществ 90
4.1. Оптимизация методов биохимической диагностики наследственных болезней обмена веществ 90
4.1.1. Совершенствование методов диагностики нарушений обмена аминокислот, органических кислот и дефектов митохондриального Р-окисления, выявляемых методом тандемной масс-спектрометрии 91
4.1.1.1. Диагностические значимые соотношения метаболитов 96
4.1.1.2. Подтверждающая диагностика заболеваний, выявляемых методом тандемной масс спектрометрии 100
4.1.2. Микрометоды определения некоторых органических кислот методом высокоэффективной жидкостной хроматографии - тандемной масс-спектрометрии 112
4.1.2.1. Определение концентрации сукцинилацетона 112
4.1.2.2. Определение концентрации оротовой кислоты 115
4.1.2.3. Определение концентрации глутаровой кислоты 117
4.1.2.4. Определение концентрации N-ацетиласпартата 119
4.1.3. Биохимические подходы диагностики пероксисомных болезней 121
4.2. Оптимизация подтверждающих молекулярно-генетических методов диагностики наследственных болезней обмена веществ 124
4.2.1. Митохондриальные болезни 125
4.2.1.1. Атрофия зрительных нервов Лебера 125
4.2.1.2. Синдром MELAS 127
4.2.1.3. Синдром Ли (ген SURF1) 128
4.2.1.4. Болезнь Альперса 129
4.2.2. Лейкоэнцефалопатия с поражением ствола и высоким уровнем лактата при MP-спектроскопии (LBSL) 130
4.2.3. Дефекты митохондриального Р-окисления 132
4.2.3.1. Недостаточность среднецепочечной ацил-КоА дегидрогеназы жирных кислот 132
4.2.3.2. Недостаточность очень длинноцепочечной ацил КоА-дегидрогеназы жирных кислот 133
4.2.3.3. Недостаточность длинноцепочечной 3- гидрокси ацил-КоА-дегидрогеназы жирных кислот 134
4.2.4. Органические ацидурии 135
4.2.4.1. Глутаровая ацидурия тип 1 135
4.2.4.2. Множественная карбоксилазная недостаточность с поздним дебютом (недостаточность биотинидазы) 136
4.2.4.3. Метилмамлоновая ацидурия 137
4.2.5. Аминоацидопатии 138
4.2.5.1. Болезнь с запахом кленового сиропа мочи 139
4.2.5.2. Недостаточность орнитинтраскарбомилазы 140
4.2.5.3. Тирозинемия тип 1 140
4.2.5.4. Алькаптонурия 142
4.2.5.5. Цитруллинемия тип 1 143
4.2.6. Нарушения обмена углеводов 143
4.2.6.1. Болезнь Гирке (гликогеноз тип 1а, 1в) 143
4.2.6.2. Галактоземия 145
4.2.7. Другие наследственные болезни обмена веществ 146
4.2.7.1. Семейный внутрипеченочный холестаз тип 2 (болезнь Байлера) 146
4.2.7.2. Пантотенаткиназная недостаточность 146
4.2.7.3. Гипероксалурия тип 1 147
4.2.7.4. Синдром Цельвегера 148
4.2.8. Лизосомные болезни накопления 148
4.2.8.1. болезнь Краббе 149
4.2.8.2. Болезнь Ниманна-Пика тип С 151
4.3. Создание тест-систем для определения мутаций в генах методом гибридизации на биочипах 153
4.3.1. Тест-система для определения мутаций в гене галактозо- 1-фосфат-уридил трансферазы, обуславливающих развитие галактоземии тип I 154
4.3.2. Тест-система для определения мутаций в генах фумарилацетоацетат гидролазы и альфа-1 антитрипсина 157
Глава 5. Методические подходы для совершенствования программ массового и селективного скрининга на наследственные болезни обмена веществ 161
5.1. Селективный скрининг на наследственные болезни обмена веществ 162
5.2. Создание протокола подтверждающей диагностики галактоземии тип 1 169
5.2.1. Разработка биохимической подтверждающей диагностики галактоземии 169
5.2.1.1. Определение активности галактозо-1-фосфат уридилтрансферазы 170
5.2.1.2. Определение оптимальной отрезной точки 173
5.2.2. Разработка подтверждающей ДНК-диагностики галактоземии 175
5.2.3. Алгоритм подтверждающей диагностики галактоземии тип 1 178
5.2.4. Применение алгоритма подтверждающей диагностики для массового скрининга 179
5.2.4. Концентрация тотальной галактозы в крови у новорожденных с установленным генотипом 182
Глава 6 Общее заключение 186
Выводы 191
Практические рекомендации 194
Список литературы 196
Приложение 1 225
Приложение 2 228
Приложение 3 232
Приложение 4 241
- Классификация наследственных болезней обмена веществ
- Анализ частот заболеваний из группы лизосомных болезней накопления в России (Центральный федеральный округ)
- Тест-система для определения мутаций в генах фумарилацетоацетат гидролазы и альфа-1 антитрипсина
- Концентрация тотальной галактозы в крови у новорожденных с установленным генотипом
Введение к работе
Актуальность исследования.
Наследственные болезни обмена веществ (НБО) - обширный и во многом уникальный класс моногенных болезней человека. На сегодняшний день к этому классу относят около 500 заболеваний, входящих в 22 подкласса в зависимости от пораженного метаболического пути (Темин П.А., 2001; Краснопольская К.Д., 2005; Clarke J.T.R., 2004). Отдельные нозологические формы НБО встречаются крайне редко, но результаты ряда исследований позволяют считать, что их суммарная частота, которая оценивалась изначально как 1:5000, занижена, и реальные значения этого показателя достигают 1:600 - 1:1000 живых новорожденных (Новиков П.В., 2006; Fernandes J., 2006).
Данные по эпидемиологии большинства НБО недостаточны и разрозненны, в основном они базируются на ретроспективном анализе выявленных случаев (Krasnopolskaya K.D., 1993; Poorthuis B.J. et al. 1999; Dionisi-Vici C.et al. 2002). При этом даже приблизительная оценка относительной частоты групп НБО и отдельных нозологических форм позволяет более обосновано планировать организацию лабораторий по диагностике, создавать программы селективного и массового скрининга на эти заболевания.
В диагностике НБО ведущая роль принадлежит биохимическим методам, в последние годы все более широко применяются методы ДНК-анализа для подтверждающей постнатальной и пренатальной диагностики. В сфере лабораторной диагностики НБО актуальны разработка и оптимизация протоколов, как биохимического (определение активности ферментов или анализ метаболитов) так и молекулярно-генетического обследования пациентов. При этом оценка чувствительности и специфичности методов, границ нормальных и патологических значений, осложняются малочисленностью выборок, что связанно с низкой частотой отдельных нозологических форм НБО.
Одной из актуальных задач в области НБО является совершенствование неонатального скрининга. Во многих странах Европы и США массовый скрининг новорожденных включает обследование на несколько десятков НБО методом тандемной масс-спектрометрии (МС/МС) (Schulze A., 2003, Wilcken B., 2003). В Российской Федерации для внедрения МС/МС в качестве основного метода обследования новорожденных необходима предварительная работа по количественной оценке измеряемых соединений, составлению алгоритмов подтверждающей диагностики для каждой нозологической формы и разработке организационных принципов такого рода скринирования.
В Российской Федерации до настоящего времени не решены некоторые проблемы подтверждающей диагностики заболеваний, включенных в программу массового обследования новорожденных в настоящее время. В первую очередь это касается подтверждающей диагностики галактоземии. Неонатальный скрининг на галактоземию проводится с 2006 г. В основе тестирования лежит определение концентрации тотальной галактозы в пятнах высушенной крови; при положительном результате (>7,2 мг/дл) проводят повторное определение уровня галактозы. Данный подход не является высокоспецифичным, поскольку известно много состояний, при которых возможно повышение уровня галактозы у новорожденного: транзиторная галактоземия, тяжелое поражение печени как наследственной, так и экзогенной природы, другие формы галактоземии. Поэтому, разработка протокола подтверждающей диагностики галактоземии тип 1 является важной и актуальной задачей, стоящей перед программой массового скрининга (Кузьмичева Н.А., 2007; Lee J.Y., 2005).
Подтверждающая ДНК-диагностика наследственных заболеваний довольно важна, а для некоторых болезней, в том числе и относящихся к НБО, она является наиболее предпочтительным подходом. Безусловна приоритетность молекулярно-генетических методов при установлении гетерозиготного носительства, а также в пренатальной диагностике заболеваний, при которых мутантный фермент не экспрессируется в клетках ворсин хориона. Для разработки эффективных протоколов ДНК-диагностики отдельных нозологических форм необходимы данные о частоте и спектре мутаций. Однако исследования, посвященные анализу частоты и спектра мутаций при НБО в Российской Федерации, носят ограниченный характер, что связано в большинстве случаев с ограниченным числом пациентов с этими редкими заболеваниями. Низкая частота, выраженный клинический полиморфизм, генетическая гетерогенность и биохимический полиморфизм, а также наличие гено- и фенокопий затрудняют диагностику НБО, как на клиническом, так и на лабораторном уровне. Однако совершенствование методов лечения этих заболеваний, которое наблюдается в последние годы, требует особого внимания к классу этих наследственных заболеваний, поскольку от ранней диагностики во многом зависит и эффективность проводимой терапии (Wolf B et al., 1991; 2010; Desnick R.J., 2004; Moser H.W., 2004; Weisstein J.S., 2004; Nenad Blau, 2006).
Цель исследования: Изучение относительных частот и спектра семи групп наследственных болезней обмена веществ. Оптимизация методов их биохимической и молекулярно-генетической диагностики для усовершенствования на этой основе программ массового и селективного скрининга на наследственные болезни обмена веществ.
Задачи исследования:
-
Оценить спектр и относительные частоты наиболее распространенных подклассов наследственных болезней обмена веществ (лизосомных болезней накопления, митохондриальных заболеваний, нарушений обмена аминокислот, органических кислот, дефектов митохондриального -окисления, пероксисомных болезней, нарушений обмена углеводов) в выборке больных из Российской Федерации и обосновать необходимость оптимизации методов их лабораторной диагностики;
-
Оценить частоту заболеваний из группы лизосомных болезней накопления в Центральном федеральном округе Российской Федерации на основании анализа числа новых случаев заболеваний;
-
Разработать биохимические методы подтверждающей диагностики пероксисомных болезней, и наиболее распространенных органических ацидурий методами газовой хроматографии – масс-спектрометрии, высокоэффективной жидкостной хроматографии – тандемной масс-спектрометрии;
-
Определить вклад наиболее распространенных мутаций для 14 форм наследственных болезней обмена веществ и разработать методы подтверждающей ДНК-диагностики этих заболеваний;
-
Изучить с помощью селективного скрининга вклад заболеваний из подклассов органических ацидурий, дефектов митохондриального -окисления и аминоацидопатий в структуру патологии нервной системы у детей раннего возраста;
-
Разработать алгоритм подтверждающей диагностики галактоземии тип 1 для совершенствования программы массового скрининга новорожденных в Российской Федерации.
Научная новизна результатов исследования
Впервые проведена оценка спектра и относительной частоты отдельных подклассов наследственных болезней обмена веществ (НБО) в Российской Федерации. Показано, что две группы заболеваний – лизосомные болезни накопления (ЛБН) и митохондриальные заболевания (МБ) являются наиболее представленными и многочисленными по числу нозологических форм. Установлено, что наиболее частой формой ЛБН является болезнь Гоше, а самыми распространенными группами - мукополисахаридозы и липидозы.
Впервые определены частоты двадцати нозологических форм и суммарная частота ЛБН в Центральном Федеральном округе Российской Федерации.
Определен удельный вес (2,3%) трех групп НБО (аминоацидопатии, органические ацидурии и дефекты митохондриального -окисления) в структуре заболеваний, сопровождающихся психо-неврологическими нарушениями у детей раннего возраста (от 0 до 5 лет).
Впервые в России для 14 разных форм НБО (синдром Ли, атрофия зрительных нервов Лебера, синдром Альперса, галактоземия тип 1, тирозинемия тип 1, глутаровая ацидурия тип 1, недостаточность биотинидазы, недостаточность трифункционального белка, гликогеноз тип 1а, гликогеноз тип 1в, болезнь Баллера тип 2, болезнь Краббе, алькаптонурия, лейкоэнцефалопатия с поражением ствола и высоким уровнем лактата при МР-спектроскопии) показано наличие мажорных мутаций в соответствующих генах и определены их относительные частоты. Для диагностики галактоземии тип 1 был создан биочип, который позволяет определять 14 мутаций и полиморфизмов в гене GALT, для диагностики тирозинемии тип 1 - биочип, позволяющий выявлять 5 мутаций в гене FAH.
Практическая значимость
Разработан алгоритм подтверждающей диагностики галактоземии тип 1 с учетом биохимических и молекулярно-генетических данных, для использования в программах массового скрининга новорожденных на данное заболевание. Определены отрезные точки и активности галактозо-1-фосфат уридилтрансферазы (Г-1-ФУТ) в пятнах высушенной крови и цельной крови, показано, что на значение активности фермента Г-1-ФУТ существенное влияние оказывают варианты носительства галактоземии тип 1 и полиморфные варианты гена (вариант Дуарте).
Показана необходимость изменения отрезной точки при определении тотальной галактозы для снижения числа ложноположительных результатов тестирования при неонатальном скрининге.
Разработаны методы определения уровня очень длинноцепочечных жирных кислот (ОДЦЖК) в плазме крови для биохимической диагностики пероксисомных заболеваний, микрометоды определении глутаровой, оротовой кислот и сукцинилацетона методом высокоэффективной жидкостной хроматографии – тандемной масс-спектрометрии для подтверждающей диагностики глутаровой ацидурии тип 1, нарушений цикла мочевины и тирозинемии тип 1.
Составлены таблицы для подтверждающей диагностики аминоацидопатий, органических ацидурий и дефектов митохондриального -окисления, которые включают определение органических кислот мочи методом газовой хроматографии – масс-спектрометрии, исследование активности ферментов и ДНК-диагностику.
Результаты данного исследования создают базу для совершенствования диагностики НБО, что имеет принципиальное значение для медико-генетического консультирования отягощенных семей и применения эффективных методов терапии, которые уже разработаны для некоторых заболеваний из этого класса.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Наиболее частыми и многочисленными по числу форм НБО, выявленных за период 2004-2009гг являются лизосомные болезни накопления (ЛБН) и митохондриальные болезни (МБ).
-
Наиболее представленными в подклассе ЛБН являются мукополисахаридозы и липидозы, среди нозологических форм преобладает болезнь Гоше. В подклассе МБ превалируют заболевания, обусловленные мутациями мтДНК, среди нозологических форм – атрофия зрительных нервов Лебера.
-
Суммарная частота ЛБН в ЦФО Российской Федерации, рассчитанная по числу новых случаев заболевания на 100 000 новорожденных, составляет 5,22 или 1:19937.
-
Три группы НБО (аминоацидопатии, органические ацидурии и дефекты митохондриального -окисления) имеют удельный вес 2,3% в структуре заболеваний, сопровождающихся психо-неврологическими нарушениями у детей раннего возраста (от 0 до 5 лет).
-
Разработанный алгоритм подтверждающей диагностики галактоземии тип 1 позволяет с высокой достоверностью выявлять пациентов с данным заболеванием. На значение активности фермента Г-1-ФУТ существенное влияние оказывают носительство мутаций в гене GALT и полиморфные варианты гена (вариант Дуарте). Оптимальные отрезные точки активности Г-1-ФУТ для пятен крови и для цельной крови, различаются по своим абсолютным значениям, а также по чувствительности и специфичности
-
Разработаны биохимические тесты подтверждающей диагностики пероксисомных болезней, микрометоды определения глутаровой, оротовой кислот и сукцинилацетона методом высокоэффективной жидкостной хроматографии тандемной масс-спектрометрии
-
Для 14 форм НБО показано наличие мажорных мутаций, что позволяет применять простые методы ДНК-анализа для подтверждающей диагностики этих заболеваний.
Апробация работы.
Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции «Современные достижения клинической генетики» (г. Москва, 2003 г.), II Украинском конгрессе с международным участием «Метаболические наследственные заболевания» (г. Харьков, 2005), V (г. Уфа, 2005) и VI (г. Ростов-на-Дону, 2010) съездах Российского общества медицинских генетиков, IX Всероссийском съезде неврологов (г. Ярославль, 2006), 8 конференции с международным участием «Генетика и патология» (г.Томск, 2007), II Всероссийском Конгрессе "Современные технологии в педиатрии и детской хирургии" (г. Москва,2008), XII Конгрессе педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии» (г. Москва, 2008), Annual Symposium of Society for the Study of Inborn Errors of Metabolism (SSIEM) (Амстердам, 2004; Гамбург,2007; Лиссабон, 2008), European Conference of Human genetics, 2007, European Meeting on Mitochondrial Pathology (EUROMIT) (Ниймиген, 2004), 7th Meeting European Neuroophthalmology Society, (Moscow, 2005). Работа апробирована и рекомендована к защите на заседании научного семинара ФГБУ «МГНЦ» РАМН 15 февраля 2012 года.
Внедрение в практику здравоохранения.
Материалы диссертации внедрены в практическую работу ФГБУ «Российская детская клиническая больница» Министерства здравоохранения РФ, основные положения работы по подтверждающей диагностике галактоземии вошли в методические рекомендации, утвержденные Министерством здравоохранения и социального развития Российской Федерации в 2006 г. и применяются в медико-генетических учреждениях и центрах неонатального скрининга. Получен патент «Биочип для определения мутаций в гене галактоза-1-фосфат-уридил трансферазы, вызывающих поражение печени у новорожденных детей».
Материалы диссертации применяются в учебном процессе на кафедре медицинской генетики с курсом пренатальной диагностики Государственного бюджетного образовательного учреждения дополнительного профессионального образования «Российская медицинская академия последипломного образования» Министерства здравоохранения Российской Федерации, а также при подготовке клинических ординаторов в ФГБУ «Медико-генетический научный центр» РАМН.
Личное участие диссертанта.
Все использованные в работе данные получены при непосредственном участии автора. Автором были сформулированы цель и задачи исследования, разработаны методические подходы к диагностике различных классов НБО. Сбор первичных данных и проведение лабораторных исследований проведены лично автором или при его непосредственном участии, обработка, анализ и обобщение полученных результатов при написании и оформлении рукописи выполнены лично автором.
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 64 научные работы, в том числе 43 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК МОН РФ, методические рекомендации для врачей, патент «Биочип для определения мутаций в гене галактоза-1-фосфат-уридил трансферазы, вызывающих поражение печени у новорожденных детей» № 2423521 от 27.10.2009, 1 руководство для врачей, 2 главы в «Педиатрия: национальное руководство», 1 глава в «Неврология: национальное руководство», 3 главы в «Наследственные болезни: национальное руководство», 1 глава в «Клиническая лабораторная диагностика: национальное руководство».
Структура и объем работы.
Диссертационная работа изложена на 254 страницах машинописного текста и состоит из введения, 6 глав с описанием методики и результатов исследования, заключения, выводов, библиографии из 288 источников ( в том числе 30 на русском и 258 на иностранном языках) и 4 приложений. Работа содержит 40 рисунков и 52 таблицы.
Классификация наследственных болезней обмена веществ
Поскольку даже с границами НБО до сих пор существует некоторая неопределенность, классификация этих заболеваний также вызывает трудности. Одной из самых полных является биохимическая классификация, согласно которой все НБО разделены на 22 группы в зависимости от типа поврежденного метаболического пути (аминоацидопатии, нарушения углеводного обмена и т.д.) или в зависимости от его локализации в пределах определенного компатрмента клетки (лизосомные, пероксисомные и митохондриальные болезни). Данная классификация периодически обновляется Обществом по изучению наследственных болезней обмена (SSIEM) и именно она легла в основу одного из самых капитальных трудов по НБО - The Metabolic and Molecular bases of inherited disease (Табл.1) [239].
Для ряда заболеваний трудно определить их принадлежность к определенной группе. Это связано с объективными трудностями: многие метаболические пути пересекаются и, некоторые из НБО могут быть отнесены к нескольким группам одновременно. Кроме того, некоторые подразделы классификации сложились исторически. Например, гликогеноз II типа (болезнь Помпе) относится к лизосомным болезням накопления (ЛБН), хотя с биохимической точки зрения правильнее было бы отнести его к нарушениям обмена гликогена. К митохондриальным заболеваниям отнесены только дефекты, затрагивающие дыхательную цепь митохондрий, а нарушения {3-окисления жирных кислот и нарушения обмена пирувата входят в отдельную группу [15].
Трудности вызывает классификация нарушений биогенеза пероксисом, которые в настоящее время не имеют однозначных критериев для классификации и подразделяются на 5 нозологических единиц при наличии, по крайней мере, в два раза большего числа известных генов. Наконец, существуют смежные генные синдромы, обусловленные делециями различной протяженности, включающими несколько генов или их фрагментов (недостаточность глицеролкиназы, а также один из вариантов синдрома Целлвегера), которые довольно сложно классифицировать [147].
Непросто определить и число нозологических форм, входящих в класс НБО. По данным разных литературных источников их число варьирует от 350 до 600. Такая существенная разница связана с тем, что некоторые авторы считают разными нозологическими формами все аллельные варианты заболевания, а другие описывают их как варианты одной формы, и причисляют к НБО дефекты, которые изначально в этот класс не входили (например, атаксию Фридрейха, некоторые формы болезни Шарко-Мари-Туса). Конечно, наиболее обоснованно принять за одну нозологическую форму болезни, обусловленные мутациями в одном гене, но существует много примеров заболеваний, разительно различающихся клинически, но обусловленых мутациями в одном гене и наоборот - клинически однородных, но для которых описаны мутации в нескольких локусах. Например, GM1 ганглиозидоз и болезнь Моркио тип В не только рассматривают как две нозологические формы, но они даже отнесены к разным подгруппам НБО (нарушениям обмена ганглиозидов и гликозаминогликанов). Такие трудности касаются не только НБО, но и многих других наследственных заболеваний. Только когда для каждого заболевания будут выяснены механизмы патогенеза и тонкие различия в биохимическом фенотипе, появится возможность пересмотра классификации и описания нозологической формы, что на данном этапе развития генетики сделать довольно сложно.
Проведенный анализ нозологических форм приведенных в 5м издании The Metabolic and Molecular bases of inherited disease и каталоге Мак Кьюсика (OMIM), позволил выделить 479 форм заболеваний, которые могут быть отнесены к НБО, поскольку они связаны с нарушением определенного метаболического пути и имеют четкие биохимические «маркеры» [118, 239].
При этом, в абсолютном большинстве случаев, за нозологическую форму принимали клинические фенотипы, обусловленные мутациями в пределах одного гена. Исключения касались только некоторых случаев:
болезни, не различающиеся на уровне клинического фенотипа (например, некетотическая гиперглицинемия), обусловленные мутациями в разных локусах, контролирующих одну биохимическую функцию, принимали за одну нозологическую форму,
заболевания, обусловленные мутациями в одном гене, но чрезвычайно различающиеся по возрасту манифестации и клиническим проявлениям (например, GM1 ганглиозидоз и болезнь Моркио тип В, болезнь Альперса и прогрессирующую наружную офтальмоплегию) принимали за разные нозологические формы.
Для наиболее полной характеристики и обобщения имеющихся данных, применив критерии, предложенные Jimenez-Sanchez с соавторами [143] и дополнив их, проведен анализ основных клинических проявлений, типа наследования, функции дефектного белка и пораженного метаболического пути 479 форм НБО (см. приложение 1).
Из 22 групп НБО, приведенных в классификации наибольшее число нозологических форм включают нарушения обмена органических кислот и аминокислот (п=122), лизосомные болезни накопления (п=47), митохондриальные заболевания (п=37) и нарушения обмена углеводов и гликогена (п=32) (таблица 2). Единичные формы НБО относятся к нарушениям обмена цитокинов, креатинина, кетоновых тел, некоторые не могут быть однозначно отнесены к определенному подклассу.
Анализ частот заболеваний из группы лизосомных болезней накопления в России (Центральный федеральный округ)
С целью расчета частоты заболеваний и сравнения с данными, полученными при исследованиях в других странах, нами была выбрана наиболее изученная группа - ЛБН. В лабораторию поступают образцы из всех регионов Российской Федерации, но в наших расчетах мы учитывали только семьи, проживающие в Центральном Федеральном округе (ЦФО). Это связанно с географической близостью указанного региона к г. Москве, с более высоким уровнем медико-генетической помощи в этом регионе, а также тем, что по числу новорожденных в год данный регион РФ близок к другим странам Европы (Чехия, Германия, Нидерланды). Поэтому, при расчетах частоты нами были использованы данные о новорожденных ЦФО и исключены данные о случаях, диагностированных в семьях, проживающих в других регионах. Частота рассчитывалась двумя способами - первый как общее число пациентов, диагностированных за определенный период, по отношению к общему числу новорожденных в этот же период (при этом период рождения являлся интервалом между годом рождения старшего пациента и годом рождения младшего пациента в выборке), при втором способе оценке частоты учитывалось только общее число новорожденных (год рождения больных не учитывался). Нами был выбран временной промежуток с 2000 по 2009 годы, в это время в лаборатории осуществлялась диагностика большинства ЛБН биохимическими и/или молекулярно-генетическими методами. Стандартные правила в расчете частоты и распространенности редких заболеваний пока не приняты, однако методология, предложенная Poorthius B.J. et al. [211], по мнению многих исследователей, является общепринятой, и в своих работах многие применяют именно этот метод. Более подробно методы расчета приведены в приложении 2, результаты проведенного анализа представлены в таблицах 19 и 20. Для заболеваний, выявленных в единичных случаях доверительные интервалы не приводятся.
Данные по суммарной частоте лизосомных болезней накопления представлены по нескольким странам в работах [84, 178, 207, 211], в других исследованиях приведены данные по эпидемиологии отдельных групп ЛБН мукополисахаридозов [41, 171, 192]; сфинголипидозов [199] или отдельных нозологических форм [71, 122, 185, 203]. Суммарная частота ЛБН по данным этих авторов составляет от 7,6 до 25 на 100 000 новорожденных [84, 178, 207, 211].
Суммарное значение минимальной частоты ЛБН в ЦФО РФ составляет 5,02 на 100 000 новорожденных (1:19937), при втором способе оценки частоты 4,36 на 100 000 (1: 22942). В других странах Европы значении примерно в 2-3 раза выше, однако следует учитывать, что все эти заболевания чрезвычайно редкие и случайная вариация в оценке их частоты очень высока, что отражает минимальное и максимальное пороговое значение при 95% доверительном интервале, а также различные подходы к расчету. Ряд ЛБН были выявлены только у единичных пациентов, поэтому оценка частоты встречаемости этих форм очень приблизительна и доверительный интервал в таблице не указан. Наиболее распространенными группами ЛБН являются МПС и болезнь Гоше, что согласуется с данными по анализу относительных частот этих болезней в группе ЛБН в нашей стране и в других странах [212].
Если рассматривать частоту отдельных форм ЛБН (например, мукополисахаридоз тип I, болезнь Гоше) данные полученные в нашем исследовании очень близки к результатам, приведенным в зарубежной литературе [185,212]. Эти заболевания хорошо распознаются врачами, что связано с характерной клинической картиной и фенотипическими особенностями. Так МПС I и II типа относятся к числу «портретных» диагнозов, пациенты уже в раннем возрасте, как правило, направляются на консультацию к врачу-генетику. Клинические особенности болезни Гоше хорошо известны врачам-гематологам, и оно включено в стандарты дифференциальной диагностики гематологических заболеваний, протекающих с гепатоспленомегалией и тромбоцитопенией [2]. Немаловажным фактором, повышающим настороженность врачей в пользу диагностики этих редких болезней, является возможность их эффективного лечения методами ферментной заместительной терапии, трансплантации костного мозга и пуповиной крови.
В выборке из ЦФО РФ выявлено небольшое число случаев мукополисахаридоза III и IVA типов, что в совокупности влияет на суммарную частоту МПС. Одной из возможных причин недостаточной клинической диагностики МПС III (A,B,C,D) являются менее выраженные черепно-лицевые дизморфии и костные деформации, при этом ведущими клиническими симптомами при этих формах МПС являются грубые психоневрологические расстройства, а скринирующие тесты по определению гликозаминогликанов (ГАГ) в моче не входят в стандарты диагностики пациентов с поражением нервной системы. Пациенты с МПС IVA типа наблюдаются врачами-ортопедами, которые также не всегда хорошо знакомы с данной патологией, кроме того, анализ ГАГ мочи при этой форме МПС часто дает ложноотрицательные результаты.
Различия по частоте некоторых из ЛБН, вероятнее всего, указывают на их недостаточную выявляемость, нежели чем свидетельствуют об особенностях изучаемой выборки. В отличие от других стран диагностированы лишь единичные случаи НПС, болезни Помпе. Эти заболевания особенно трудны не только в клинической, но и лабораторной диагностике. Например, при НПС, полный клинический фенотип формируется на протяжении нескольких десятилетий, простых скрининг-тестов не разработано и необходимо проведение дорогостоящих молекулярно-генетических исследований или нагрузочных тестов на культуре кожных фибробластов для подтверждения диагноза.
Все полученные нами оценки относятся к минимальной частоте этих заболеваний, поскольку не все случаи болезней были учтены: пациенты могли не обратиться и в ФГБУ МГНЦ для подтверждающей диагностики и в медико-генетическую консультацию по месту жительства. Безусловно, проведенное нами исследование носит оценочный характер, единичные случаи заболеваний для некоторых из ЛБН не дают достоверной оценки их частоты и доверительный интервал в этих случаях имеет довольно большой размах. Если принять во внимание тот факт что эта группа болезней относится к числу наиболее охарактеризованных, информация об отдельных нозологических формах есть в большинстве учебников, то она может служить своеобразным ориентиром, позволяющим оценивать уровень диагностики НБО в нашей стране. Другие заболевания диагностируются с гораздо меньшей эффективностью. Также необходимо отметить, что наблюдается тенденция к увеличению числа установленных диагнозов за год в РФ, как и в других странах, что, несомненно, связано с большей информированностью врачей, а также с новыми возможностями лечения ряда ЛБН (болезнь Гоше, МПС). Методы определения активности нескольких лизосомных ферментов в пятнах высушенной крови могут помочь в определении точной частоты ряда нозологических форм из группы ЛБН в РФ.
Целесообразно создание Российского регистра по наследственным болезням при непосредственном участии всех лабораторий и центров, которые занимаются диагностикой НБО. Это приобретает особую актуальность в свете того, что для ряда НБО разработаны и совершенствуются эффективные подходы к лечению. В то же время, эти данные должны стать полезными в процессе планирования программ селективного и массового скрининга.
Тест-система для определения мутаций в генах фумарилацетоацетат гидролазы и альфа-1 антитрипсина
Для диагностики тирозинемии и недостаточности альфа-1-антитрипсина разработан биочип, позволяющий выявлять мутации в генах фумарилацетоацетат гидролазы и альфа-1-антитрипсина человека.
С целью разработки биочипа были проанализированы данные литературы и частоты мутаций в гене FAH у пациентов с тирозинемией тип 1 из Российской Федерации [40, 78]. Для создания биочипа были выбраны следующие мутации в гене FAH: p.Pro342Leu, p.Argl74Term, IVS 12+5 G- A, IVS6-1 G- T, IVS7-1 G- A. и две частые мутации в гене SERPINA1: Glu342Lys, Glu264Val [43].
Все выбранные нами для создания биочипа мутации были подтверждены методом прямого нерадиоактивного секвенирования и/или анализом полиморфизма длины рестрикционных фрагментов. Таким образом, были отобраны образцы ДНК, которые можно применить для тестирования полученного биочипа.
Олигонуклеотидные пробы в составе биочипа группировали в два блока. Блок №1 предназначен для выявления мутаций в гене FAH, а блок №2 - для выявления мутаций в гене SERPINA1 (таблица 41). Условия проведения мультиплексных ПЦР и гибридизации для анализа мутаций в разных блоках были одинаковыми.
С целью повышения надежности определения сигнала каждую олигонуклеотидную пробу на биочипе дублировали. Для подбора последовательности олигонуклетидов, обеспечивающих максимальную специфичность, в биочипе для некоторых мутаций использовались несколько типов олигонуклеотидов, комплементарных одной и той же мутации или нормальной последовательности (приложение 4). Нанесение олигонуклетидов, комплементарных нормальной последовательности и различным мутациям, на биочип показано в таблице 41 (обозначение олигонуклеотидов такое же, как и в таблицах в приложении 4).
Факт наличия не мутантных и мутантных аллелей в геноме пациента установлен при количественном анализе интенсивности флюоресценции соответствующих ячеек на чипе (Рисунок 36 а-ж).
Согласно сведениям, приведенным на рисунках 36а - 36ж, уровень нормированных сигналов флюоресценции (Jm) у пациентов не несущих мутаций в точках, соответствующих нормальной последовательности генов FAH и SERPINAl, в несколько раз выше, чем в точках соответствующих мутированным последовательностям.
Согласно сведениям, приведенным на рисунках 366, 369в и 36г уровень сигналов флюоресценции в точках, соответствующих мутации в гетерозиготном состоянии, такой же, как и в точках, соответствующих последовательности, не содержащей данную замену.
Согласно сведениям, приведенным на рисунках 36д и 36ж уровень сигналов флюоресценции в точках, соответствующих мутации в гомозиготном состоянии, в несколько десятков раз сильнее, чем в точках, соответствующих последовательностям, не содержащим данные замены. Данный факт говорит о том, что мутация находится в гомозиготном состоянии. Во всех остальных точках уровень сигнала, соответствующий нормальным последовательностям, в несколько раз сильнее сигнала, соответствующего мутированным последовательностям. Данный факт показывает, что заявленный биочип позволяет установить наличие мутации в генах FAH и SERPINA1 с высокой специфичностью (как в гетерозиготном, так и в гомозиготном состоянии). При этом не возникает ложноположительных сигналов, соответствующих другим мутациям.
Таким образом, сконструированный биочип позволяет надежно и быстро определять наличие 5 мутаций в гене FAH и двух мутаций в гене SERPINA1, приводящих к возникновению заболеваний.
Разработанные в ходе исследования методы биохимической диагностики можно применять для программ ССК на НБО, как в качестве методов скринирования (МС/МС), так и на этапе подтверждающей диагностики. Разработанные методы ДІЖ диагностики 25 НБО, внедрены в практику работы лаборатории НБО ФГБУ МГНЦ РАМН, и применяются для проведения пост- и пренатальной диагностики.
Концентрация тотальной галактозы в крови у новорожденных с установленным генотипом
В Российской Федерации пороговый уровень галактозы в сухих пятнах крови принят равным 7,2 мг/дл. Исследование, проведенное в рамках программы массового скрининга, показывает что на подтверждающую диагностику ГАЛ поступает большое число семей, у которых выявляют либо носительство ГАЛ тип 1 или вариант галактоземии-Дуарте. При этом, пациенты имеющие данные генотипы не нуждаются в назначении диеты, а семья подвергается необоснованному стрессу. Последствия от такого рода ложноположительных заключений, безусловно также имеют, финансовую стоимость (стоимость проведения подтверждающей диагностики, консультаций специалистов) и эмоциональную, последствия которой однозначно оценить сложно. Понятно, что критическое значение теста необходимо выбирать так, чтобы минимизировать последствия этого неверного отнесения здорового новорожденного в группу больных.
В ходе работы был проведен анализ уровня галактозы, полученных в центре неонатального скрининга г.Москвы и из других регионов РФ (п=173).
В таблице 51 приведены среднее значение и стандартное отклонение для 6 групп: с классической галактоземией (G/G), галактоземией Дуарте (G/D), носителей галактоземии (G/N), носителей (D/N) и гомозигот по варианту Дуарте (D/D) и новорожденных у которых не было выявлено вышеуказанных изменений в гене GALT, но уровень галактозы был выше отрезной точки (N/N).
У всех пациентов с ГАл тип 1 значения тотальной галактозы отличалось от всех исследуемых групп.
Проведенный нами ROC-анализ (рисунок 40) показывает, что отрезная точка, соответствующая максимальной чувствительности и специфичности относится к уровню галактозы - 20-25 мг/дл. Повышение отрезной точки при проведении ретеста до концентрации 20 мг/дл позволяет увеличить положительную прогностическую ценность (ГШД) до 78% а специфичность до 95% (таблица 52).
Таким образом, на основании проведенного анализа по определению уровня галактозы, в образцах, полученных в центре неонатального скрининга г. Москвы, а также результатов обследования больных с галактоземией из других регионов Российской Федерации, можно сделать заключение о необходимости изменения порогового значения уровня галактозы при проведении неонатального скрининга до более высоких цифр. Однако, для установления более точного значения отрезной точки необходимо проведения обобщенного анализа результатов массового скрининга на ГАЛ во всех регионах РФ.
НБО занимают важное место в структуре наследственной патологии человека. В настоящее время достигнуты значительные успехи, как в диагностике, так и в лечении этого класса заболеваний. Поэтому ранняя диагностика, совершенствование программ массового и селективного скрининга на НБО важны не только для медико-генетического консультирования семей, но и принципиально значимы в плане назначения терапии. При этом класс НБО включает большое число нозологических форм, разнообразных по своим клиническим проявлениям, биохимическим и генетическим характеристикам и, имеющих при этом довольно низкую частоту в популяциях. Только референсные лаборатории, имеющие многолетний опыт работы, могут накопить достаточный материал для подробной характеристики отдельных подклассов и нозологических форм НБО. В проведенном исследовании обобщен многолетний опыт работы лаборатории НБО ФГБУ «МГНЦ» РАМН, которая является одной из самых крупных лабораторий по диагностике НБО в РФ. На базе этой лаборатории были созданы и апробированы программы селективного скрининга, биохимические методы пост- и пренатальной диагностики лизосомных болезней накопления, пероксисомных, митохондриальных и многих других заболеваний, впервые началась ДНК-диагностика НБО в нашей стране. За несколько лет диагностика НБО перешла на принципиально новый уровень -высокопроизводительные и точные количественные методы анализа заменили качественные тесты с мочой, полуколичественные реакции и тонкослойную хроматографию. Молекулярная диагностика НБО наряду с биохимическими методами все более широко применяется во всех лабораториях мира. В РФ методические рекомендации по диагностике НБО не обновлялись с 1985 года и многие лаборатории до настоящего времени применяют методы, обладающие низкой чувствительностью и специфичностью.
Основной целью настоящей работы являлись изучение относительных частот и спектра нескольких групп НБО, а также оптимизация методов их биохимической и молекулярно-генетической диагностики для усовершенствования программ массового и селективного скрининга на НБО.
Безусловно, точные данные о частоте наследственных болезней могут быть получены только при проведении массовых обследований, а данные, основанные оценке числа новых случаев заболеваний, зависят от большого числа факторов, технических возможностей лаборатории, качества клинической диагностики и т.д. Предпринятая попытка оценить распространенность отдельных нозологических форм из подкласса ЛБН в ЦФО РФ, носит оценочный характер и, полученные данные о частотах болезней не могут быть экстраполированы на другие регионы страны. При этом данный анализ важен, поскольку дает возможность провести сравнения с исследованиями, полученными в других странах, получить представление о необходимости улучшения диагностики определенных форм заболеваний. Также следует полагать, что дальнейшее совершенствование методов лабораторной диагностики позволит провести такую оценку более точно в разных регионах и в стране в целом.
