Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 12
1.1 Вирусные болезни малины 12
1.2 Способы передачи ВККМ и других вирусов 14
1.3 Симптомы поражения ВККМ растений рода Rubus 16
1.4 Проблемы распространения ВККМ в посадках малины 19
1.5 Круг растений, поражаемых ВККМ 23
1.6 Систематическое положение ВККМ и свойства вирусных частиц 26
1.7 Характеристика изолятов ВККМ 31
1.8 Эффективность методов оздоровления малины от ВККМ и других вирусных болезней 33
1.9 Методы диагностики ВККМ и других вирусов 40
1.10 Создание сортов малины, устойчивых к ВККМ 44
ГЛАВА 2 МЕТОДИКА И УСЛОВИЯ ИССЛЕДОВАНИЯ 48
2.1 Характеристика объекта исследований 48
2.2 Выделение РНК из растений малины 50
2.2.1 Выделение тотальной РНК из растительного материала методом экстракции гуанидинизотиоционатом 51
2.2.2 Выделение тотальной РНК из растительного материала фенолхлороформенным методом с применением для экстракции SDS... 54
2.2.3 Выделение тотальной РНК из растительного материала методом экстракции горячим фенолом 56
2.2.4 Выделение тотальной РНК из растительного материала фенолтриизопропилнафталинсульфонатным методом 57
2.3 Расчет концентрации РНК и определение качества полученных препаратов 58
2.4 Разработка методики диагностики ВККМ с помощью RT-PCR 60
2.4.1 Обратная транскрипция 61
2.4.2 Полимеразная цепная реакция 63
2.5 Конструирование вектора, содержащего фрагмент ВККМ 65
ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 67
3.1 Оптимизация методов выделения РНК из тканей малины 67
3.2 Диагностика вируса кустистой карликовости малины в тканях малины методом RT-PCR 77
3.2.1 Характеристика праймеров, используемых для диагностики ВККМ методом RT-PCR 77
3.2.2 Положительные и отрицательные контроли при проведении RT-PCR 84
3.2.3 Влияние концентрации РНК малины для обратной транскрипции на протекание RT-PCR 88
3.2.4 Влияние методов выделения РНК на эффективность диагностики ВККМ в тканях малины методом RT-PCR 91
3.3 Скрининг ВККМ методом RT-PCR в полевых растениях, сеянцах и пробирочных растениях малины, размножаемой в культуре in vitro 95
3.3.1 Анализ ВККМ в цветущих растениях и сеянцах некоторых форм малины в полевых условиях 96
3.3.2 Диагностика ВККМ в растениях ремонтантной малины на разных стадиях годового цикла развития 104
3.3.3 Анализ ВККМ в растениях ремонтантной малины, размножаемых в культуре in vitro 107
3.4 Анализ нуклеотидной последовательности изолята ВККМ,
распространенного в посадках малины 116
ГЛАВА 4 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 122
ВЫВОДЫ 127
РЕКОМЕНДАЦИИ ПРОИЗВОДСТВУ 129
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 130
ПРИЛОЖЕНИЕ 158
- Вирусные болезни малины
- Характеристика объекта исследований
- Оптимизация методов выделения РНК из тканей малины
Введение к работе
В настоящее время во всем мире описано около 30 вирусных болезней малины, снижающих ее урожайность и ухудшающих качество посадочного материала [Приходько, 1992; Martin, 2002; Jones, 2004; Упадышев, 2004]. Наиболее распространенным и трудноконтролируемым патогеном малины и ежевики является вирус кустистой карликовости малины (ВККМ), который выявлен практически во всех областях возделывания культурных растений рода Rubus: в Восточной и Западной Европе, Скандинавии, Северной и Южной Америке, Австралии, Новой Зеландии, Южной Африке, Китае [Baumann, 1986; Jones, 1992; Kokko, 1996а; Spak, 1997; Martin, 1999; Chamberlain, 2003; Pearson, 2005]. Поражая различные сорта малины, ВККМ приводит к возникновению хлорозов, некрозов, появлению деформированных и «рассыпчатых» плодов, снижению продуктивности растений. При заболевании растений число костянок в ягодах снижается до 10-12 шт., в то время как в норме доходит до 60 [Strik, 2003]. ВККМ способен снижать урожайность на 50 % даже при бессимптомном протекании болезни [Murant, 19766]. В естественных условиях вирус передается с пыльцой и при семенном размножении. До 77 % сеянцев, полученных из семян инфицированной красной малины, поражены ВККМ [Jones, 1996а]. Все это делает контроль за его распространением в селекционных питомниках и производственных плантациях особенно сложным.
Проведенное в 1991-1996 гг. обследование селекционных посадок ма-лины Кокинского опорного пункта ВСТИСП (Брянская область) показало присутствие некоторых опасных вирусных заболеваний — BMP, ВКПМ, ВЛКПЗ, ВЧКТом с различной степенью встречаемости (от 6% до 44 %) [Приходько, 1997]. Однако это обследование не включало скрининг материа-
* Далее ОП ВСТИСП (Всероссийский селекционно-технологический институт садоводства и питомниковод-ства)
ла на наличие и распространение ВККМ, хотя в посадках малины повсеместно обнаруживается появление «рассыпчатых» и деформированных плодов, что свидетельствует о возможном присутствии данного вируса в селекционном материале.
Одним из основных методов диагностики вирусов, в том числе и ВККМ, является иммуноферментный анализ [Converse, 1976; Auger, 1982; Spak, 1995, 1999; Kolber, 1998]. Данный метод широко используется для регулярного проведения скрининга ВККМ на плантациях малины и ежевики в Европе и США [Baumann, 1988; Martin, 1998а, 1999; Strik, 2003; Чернец, 2007].
Другим высокочувствительным методом обнаружения растительных РНК-содержащих вирусов, к которым и относится ВККМ, является метод RT-PCR [Gillaspie, 2001; Pluta, 2002; Jones, 20026; Olmos, 2004; Yardimci, 2008]. В последние десятилетия, в связи с появлением нового RB штамма ВККМ, поражающего сорта, устойчивые к обычным S изолятам вируса, а также с обострением проблемы контроля за распространением патогена, разработана методика обнаружения ВККМ на основе метода IC-RT-PCR [Kokko, 19966]. Эта методика позволяет анализировать вирус в растениях независимо от проявления симптомов. Диагностика ВККМ проводится также с помощью метода RT-LAMP [Wang, 2005, 2008].
Отечественные разработки методов анализа ВККМ отсутствуют, а готовые коммерческие наборы для его обнаружения труднодоступны. В зарубежной литературе имеется упоминание о наличии ВККМ в образцах из России [Jones, 1998в], но информация о его распространении и характеристика местных изолятов на территории РФ отсутствует.
Поэтому, в настоящее время представляется актуальной разработка удобной и доступной методики диагностики ВККМ в растениях малины, которая позволит:
своевременно выявлять вирус и получать здоровый посадочный материал;
контролировать распространение ВККМ в селекционных питомниках и производственных плантациях;
- проводить селекцию, направленную на получение устойчивых или
толерантных к ВККМ сортов малины.
Цели и задачи исследования. Целью данного исследования являлась разработка методики диагностики ВККМ на основе метода RT-PCR, а также оптимизация условий анализа вируса в различных сортах и формах малины в полевых условиях и in vitro.
Для разработки методики решались следующие задачи:
Подбор оптимального метода для выделения РНК малины.
Выбор праймеров, обеспечивающих специфическую и эффективную амплификацию фрагментов вирусного генома.
Разработка системы положительных и отрицательных контролей и подбор оптимальных условий для проведения RT-PCR.
Для проверки работоспособности методики диагностики ВККМ и характеристики местного изолята вируса предполагалось провести:
Скрининг ВККМ в растениях различных сортов и форм малины Кокинского ОП ВСТИСП в полевых условиях и в культуре in vitro.
Изучение возможности передачи вируса при семенном размножении различных сортов и форм малины.
Изучение возможности обнаружения вируса в различных тканях малины в зависимости от стадии годового цикла развития растений.
Клонирование фрагмента гена белка оболочки ВККМ и определение его нуклеотиднои последовательности для идентификации штамма, распространенного в посадках малины Кокинского ОП ВСТИСП.
Научная новизна и значимость. На основе RT-PCR разработана доступная методика чувствительного анализа вируса кустистой карликовости в инфицированных растениях малины.
Осуществлен подбор последовательностей праймеров для амплификации нескольких участков гена белка оболочки РНК-2 ВККМ.
Впервые проведено частичное обследование на наличие ВККМ полевого и лабораторного материала малины, в том числе и ремонтантной. Все изученные формы содержали вирус. Подтверждена способность вируса передаваться при семенном размножении ремонтантной малины. Выявлены толерантные к ВККМ сорта малины. Показано, что выделение меристем ремонтантной малины и введение в культуру in vitro, не приводит к освобождению от ВККМ.
Определена нуклеотидная последовательность клонированного фрагмента гена белка оболочки ВККМ длиной 383 Ьр. Установлено, что изолят ВККМ, распространенный на территории Кокинского ОП ВСТИСП, имеет наибольшее сходство с изолятом R15, относящимся к группе RB штаммов.
Практическая ценность исследований. Разработана методика диагностики ВККМ, включающая протокол выделения РНК, набор праймеров и условия метода RT-PCR. Составлены наборы, предназначенные для анализа ВККМ в полевых и лабораторных растениях малины, культивируемых in vitro.
Данная методика необходима для производства безвирусного посадочного материала, а также при проведении селекции малины, направленной на создание сортов, устойчивых к ВККМ.
Получена генетическая конструкция, содержащая фрагмент гена белка оболочки ВККМ, которая может быть использована для создания модельных трансгенных растений малины при изучении механизмов устойчивости к вирусу, а также для получения резистентных к ВККМ сортов малины.
Основные положения, выносимые на защиту.
Методика обнаружения ВККМ на основе RT-PCR.
Скрининг ВККМ в полевом и лабораторном материале малины.
3. Идентификация штамма ВККМ, распространенного в посадках
малины Кокинского ОП ВСТИСП.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены на международной научно-практической конференции «Молодые ученые - возрождению агропромышленного комплекса России» (Брянск, 2006), на IV съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2006), II Вавиловской международной конференции* «Генетические ресурсы культурных.растений в XXI веке» (Санкт-Петербург, 2007), международной конференции молодых ученых «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биотехнологии» (Брянск, 2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, в том числе статья в журнале «Сельскохозяйственная биология», включенном в перечень ведущих рецензируемых научных журналов, рекомендуемых ВАК Министерства образования и науки РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из,введения, четырех глав, выводов, рекомендаций производству, списка литературы и приложения. Объем работы составляет 163 страницы. В диссертации содержится 22 рисунка и 9 таблиц. Список использованной литературы содержит 251 источник, в том числе 218 работ иностранных авторов.
Вирусные болезни малины
В последние десятилетия объектом интенсивного изучения стали вирусные болезни, наносящие большой вред плодовым и ягодным культурам [Приходько, 1992; Kolber, 1998; Cieslinska, 1999; Jones, 2004, Martin, 20046; Упадышев, 2004; Young, 2008]. Они являются одной из главных причин снижения урожайности, которая при комплексной инфекции вирусами часто может снижаться на 70-90% [Борзых, 1975; Baumann, 1981; Murant, 1987; Mink, 1993; Jones, 1998в]. Вирусы вызывают замедление роста штамба, снижение прироста боковых побегов, приживаемость, а также адаптивную способность к другим патогенам и неблагоприятным климатическим факторам. Инфицированные растения сильнее страдают от стрессовых воздействий внешней среды и легче поражаются возбудителями грибковых и бактериальных заболеваний [Converce, 1973, 1987].
Малина сильно подвержена вирусным заболеваниям. Во всем мире описано около 30 вирусных и несколько подобных вирусным болезней малины, которые в разной степени сказываются на ее росте и плодоношении [Cadman, 1952; Борзых, 1986; Baumann, 1987; Приходько, 1997; Jones, 1998а, 2004; Martin, 2002; Halgren, 2003]. Полные и сокращенные названия наиболее распространенных вирусов, поражающих растения рода Rubus, их способы передачи отображены в приложении (таблицы 1, 2). Приблизительно половина из этих вирусных болезней имеет экономическое значение, поскольку они вызывают значительное снижение урожайности и вегетативной продуктивности. По литературным данным, наиболее опасными и распространенными в посадках малины, ежевики и их гибридов являются вирус кустистой карликовости малины, вирус некроза черной малины, вирус желтой сетчатости малины, вирус мозаики листьев малины, вирус пятнистости листьев малины и вирус курчавости листьев малины [Stace-Smith, 1987; Jones, 1981, 1998а; Martin, 19986,1999 и др].
Хорошо изучена распространенность вирусных болезней малины в Европе и Северной Америке [Barbara, 1988; Knight, 1995, 1999; Martin, 1999; Strik, 2003; Jones, 2001a; Isac, 2004]. В Великобритании на плантациях малины наиболее часто встречаются 15 вирусов. Большинство из них передаются почвенными нематодами (Longidorus, Xiphinema nematodes и Olpidium brassi-cae), несколько вирусов передаются тлёй (Amphorophora idaei) и один посредством инфицированной пыльцы (вирус кустистой карликовости малины) [Jones, 1994а, 19866]. В Европе посадкам малины особый вред причиняют вирус мозаики листьев малины и вирус пятнистости листьев малины, в Северной Америке - переносимые тлей вирус некроза черной малины и вирус желтой сетчатости малины [Jones, 1994а, 1995].
В европейской части РФ видовой состав и распространенность вирусов малины исследованы недостаточно широко. В последние 15-20 лет массовый скрининг вирусных заболеваний в посадках практически не проводится; как правило, проверяются и выбраковываются лишь единичные растения. В 60-70 годы в России был изучен ряд заболеваний малины и других ягодных культур (израстание, курчавость, мозаика), возбудителями многих из которых являются вирусы. Было выявлено, что хлорозы, приводящие к снижению урожайности малины до 53%, являются следствием инфекции ВГОТМ, ВХЖМ и других вирусов [Приходько, 1992; Келдыш, 1985]. Также изучена встречаемость вирусов малины, вызывающих мозаичную болезнь (ВПЛМ, ВМЛМ, ВЖСМ, ВНЧМ) [Помазков, 1969, 1972; Грушечкин, 1972; Кузнецова, 1970].
Характеристика объекта исследований
Объектом настоящего исследования являлись сорта и формы малины красной (R. idaeus), в том числе с ремонтантным типом плодоношения. У сортов такого типа, получивших в последние десятилетия довольно широкое распространение, плодоношение на однолетних побегах наступает в конце лета — начале осени. Ремонтантные формы являются более устойчивыми к абиотическим и биотическим факторам среды по сравнению с неремонтантными.
Выращивание ремонтантных сортов малины имеет ряд преимуществ. В первую очередь это возможность применения низкозатратной технологии их возделывания путем поддерживания однолетнего цикла развития растений и формирования урожая. Согласно этой технологии, после уборки урожая надземную часть растений удаляют скашиванием, а весной следующего года отрастают новые побеги, которые плодоносят во второй половине лета - начале осени. Применение такой технологии позволяет решить проблему зимостойкости (плодоносят только однолетние побеги), избавиться от болезней и вредителей без применения химических средств защиты (удаление стеблей), получить экологически чистый урожай, а также продлить на 1,5-2 месяца срок потребления свежих ягод [Казаков, 1995, 2000].
Кроме того, создание ремонтантных сортов с неполегающими под тяжестью урожая стеблями обеспечивает максимальную механизацию ухода за насаждениями, что позволяет сократить материальные и трудовые затраты [Казаков, 1995].
В России целенаправленная работа по получению ремонтантных сортов малины ведется в Кокинском опорном пункте ВСТИСП (Брянская область). В этом учреждении академиком РАСХН Казаковым И.В. создан первый отечественный сорт малины ремонтантного типа с преимущественным плодоношением на однолетних побегах - «Бабье Лето». В настоящее время получено более 20 сортов ремонтантной малины, которые отличаются круп-ноплодностью, высокой и стабильной урожайностью. Восемь сортов успешно прошли государственное и производственное испытание и включены в Государственный реестр селекционных достижений России [Казаков, 2007]. Они широко используются в центральных и южных областях России, в Казахстане, Украине, Молдове, Грузии.
Сорта ремонтантной малины Абрикосовая, Августина, Бабье лето, Бабье лето-2, Бриллиантовая, Брянское диво, Геракл, Журавлик, Золотые купола, Элегантная и др. отличаются высоким уровнем продуктивности, продолжительностью плодоношения, хорошим качеством плодов. Для них характерно совмещение быстрого созревания урожая с обширной зоной плодоношения и другими хозяйственно-важными признаками [Казаков, 2007].
При создании ремонтантных сортов малины и их культивировании ос- новной проблемой является возникновение затруднений при размножении -большинство форм характеризуется низким коэффициентом размножения, многие не образуют корневой поросли. Поэтому, такие сорта часто размножаются методом клонального микроразмножения [Нам, 1998].
Ремонтантная малина подвержена вирусным заболеваниям, которые в разной степени сказываются на ее росте и плодоношении. Вирусы поражают все растение вместе с корневыми отпрысками, заболевшие кусты не выздоравливают и подлежат уничтожению.
Вирус кустистой карликовости в настоящее время является наиболее опасным вредителем малины, распространенным в селекционных посадках Кокинского опорного пункта ВСТИСП. Симптомы поражения ВККМ («рассыпчатые» и деформированные ягоды) характерны для многих форм малины, растения которых начинают цвести и образовывать плоды. Наличие ВККМ в посадках приводит к ухудшению качества плодов, снижению продуктивности и угнетению растений.
Настоящие исследования проводились в Центре биотехнологии Брянской государственной сельскохозяйственной академии и в ИННО-центре биотехнологии и экологии Брянского госуниверситета в период с 2005 по 2008 гг. Для анализа использовался полевой материал Кокинского опорного пункта ВСТИСП и лабораторный материал Центра биотехнологии БГСХА и ИННО-центра биотехнологии и экологии БГУ.
В процессе проведения исследования анализировались полевые растения малины, сеянцы, а также пробирочные клоны на различных этапах кло-нального микроразмножения. Использовались сорта и формы малины селекции академика РАСХН Казакова И.В.: неремонтантный — Бальзам; ремонтантные — Атлант, Бабье лето-2, Бриллиантовая, Брянское диво, Брянская юбилейная, Геракл, Жар-птица, Золотые купола, Золотая осень, Надежная, Пингвин, 13-39-11, 2-205-1А, 1-220-1, 16-136-6, 37-15-4, 18-183-1, 8-202-1, 3-2-1. Ремонтантный сорт Калашник, также выращиваемый в питомнике Кокинского ОП, растения которого анализировались на наличие ВККМ, создан в Институте садоводства (ВСТИСП) проф. Кичиной В.В.
Оптимизация методов выделения РНК из тканей малины
Одна из основных проблем при проведении полимеразной цепной реакции связана с получением препаратов нуклеиновых кислот животного и растительного происхождения, пригодных для осуществления PCR. Особенно актуальна эта проблема при анализе РНК-содержащих вирусов, что связано, во-первых, с нестабильностью РНК из-за рибонуклеазного гидролиза и, во-вторых, с высокой степенью загрязнения полученных препаратов примесями (белками, полифенолами, полисахаридами, а иногда и ДНК). Их присутствие затрудняет протекание как обратной транскрипции, так и полимеразной цепной реакции, так как ингибирует активность ферментов. Например, фенол снижает эффективность PCR при содержании 0,2%, а при его концентрации 0,5% реакция останавливается [Kovarova, 2000]. Поэтому, ключевыми моментами при выделении РНК являются сведение к минимуму рибонуклеазной активности на всех этапах выделения, исключение возможности случайного внесения РНКазы, а также уменьшение содержания органических примесей в полученных образцах.
Выделение нуклеиновых кислот малины, ткани которой содержат в больших количествах полифенольные соединения и полисахариды, представляет собой весьма длительный и сложный процесс. Полученные препараты РНК малины могут быть загрязнены различными примесями, характеризоваться значительной степенью деградации, и как следствие, невозможностью их дальнейшего применения для проведения анализа.
С целью подбора наиболее оптимального метода выделения РНК из тканей малины, осуществлялось сравнение препаратов РНК, полученных с помощью набора Diatom RNA Prep 100 («Изоген»), а также с использованием четырех различных методов [Chomczynski, 1987; Клеменс, 1987; Генная инженерия растений, 1991]. Выбранные методы являлись стандартными и применялись не только для выделения РНК из малины, но и из других культур. В данной работе они использовались также для выделения РНК пшеницы, люпина и ячменя, которая в дальнейшем служила в качестве отрицательного контроля для RT-PCR.
Для получения достоверных результатов по сравнению различных методов, выделение РНК осуществлялось из образцов ткани полевых растений одинаковой массы (100 мг листьев и ягод), соблюдались пропорциональные соотношения при использовании реактивов. Эффективность различных методов оценивалась по выходу нуклеиновых кислот и по качеству полученных препаратов. Эти характеристики определялись спектрофотометрически, а также с помощью электрофореза в агарозном геле.
В процессе исследования выявлено, что применение набора Diatomш RNA Prep 100 («Изоген»), а также всех проанализированных стандартных методов для выделения РНК из малины неприемлемо из-за низкого качества полученных препаратов. Содержание примесей в них часто было довольно высокое (Агбо/Агзо" ), что делало невозможным дальнейшее проведение анализа. Поэтому данные стандартные методы были оптимизированы непосредственно для выделения РНК из тканей малины. Проблема низкого качества препаратов решалась путем проведения дополнительных этапов очистки, изменения концентраций буферов, введение в их состав дополнительных компонентов для связывания примесей.
Результаты спектрофотометрической оценки качества РНК, выделенной различными модифицированными методами из тканей полевых растений ремонтантной малины, показаны в таблице 1. Наиболее «чистые» препараты, судя по соотношению средних значений оптических плотностей, были получены при использовании модифицированных фенолхлорофор-менного метода и метода экстракции гуанидинизотиоционатом.
![Оптимизация лабораторной диагностики гонореи и антибиотикочувствительность Neisseria gonorrhoeae по материалам г. Екатеринбурга и Свердловской обл. [Электронный ресурс]](/i/i/4436/199888.png "Оптимизация лабораторной диагностики гонореи и антибиотикочувствительность Neisseria gonorrhoeae по материалам г. Екатеринбурга и Свердловской обл. [Электронный ресурс] Кобенко Эльвира Георгиевна")
