Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1. PoflRubus, подрод Idaeobatus 7
1.1.2. Биологические особенности малины 8
1.1.3. Генетические аспекты ремонтантности 9
1.2. Современные методы исследования генома растений 11
1.2.1. Морфо-фенотипические и биохимические методы 11
1.2.2. Молекулярно- генетические методы исследования генома растений 12
1.2.2.1. Подход основанный на полиморфизме длин рестрикционных фрагментов 13
1.2.2.2. Использование метода ГЩР для молекулярно- генетического исследования генома растений 14
1.2.2.3. RAPD-анализ 19
1.3. Микросателлиты и их типы 21
1.3,1. Методы исследования генома с помощью микросателлитньгх последовательностей , 24
1.4. Использование молекулярных маркеров в изучении генома и селекции малины 28
1.4.1. Биохимические маркеры 29
1.4.2. Изоферментные маркеры 30
1.4.3. RKLP-маркеры 31
1.4.4. RAPD- маркеры 35
1.4.5. SCAR-маркеры 37
1.4.6. ДНК секвенирование 38
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 40
2.1. Объекты исследований 40
2.2. Методы исследования 41
2.2.1. Выделение геномной ДНК 41
2.2.2. ISSR-PCR 44
2.2.3. RAPD-PCR 45
2.2.4. M13-PCR 46
2.2.5. Создание филогенетического дерева на основе ISSR-маркеров 47
2.2.6. Приготовление компетентных клеток 47
2.2.7. Цитирование 48
2.2.8. Трансформация 48
2.2.9. Выделение ДНК из агарозных гелей 49
2.3. Материалы и оборудование 50
2.3.1. Оборудование 50
2.3.2. Реактивы^ среды и ферменты 50
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ 53
3.1. Выделение ДНК малины 53
3.2. Выбор метода для молекулярно-генетического анализа малины 59
3.3. Полиморфизм межмикросателлитных последовательностей ДНК на межвидовом уровне 62
3.4. Использоание ISSR-маркеров для изучения филогенетических связей сортов и видов ремонтантной малины 67
3.5. Использование ISSR-маркеров для молекулярно-генетической идентификация и паспортизация сортов малины 77
3.6. Молекулярное маркирование признака ремонтантності* у малины с использованием IS SR-PCR 81
ВЫВОДЫ 84
БЛАГОДАРНОСТИ 86
ЛИТЕРАТУРА 87
Введение к работе
Актуальность работы. Организация промыпгленного производства на горнодобывающих, строительных, металлургических предприятиях включает в себя мероприятия по созданию бесперебойно действующих перегрузочных пунктов, базовой конструкцией которых является накопительный бункер. Основной задачей при этом выступает обеспечение постоянного выпуска сыпучих грузов, таких как песок, уголь, цемент и т.д., из накопительных емкостей. Исследования движения сьшучего материала при выпуске из бункеров описаны в работах Зенкова Р.Л., Дженике Э.В.
Для предотвращения сводообразования используются всевозможные подвесные, пристенные приспособления. Но эти устройства малоэффективны при торцевом выпуске связных сыпучих материалов. В связи с этим наиболее надежными являются механизмы, располагаемые в основании емкости, - питатели различных конструкций, в том числе вибрационные. Большой вклад в разработку теоретических основ вибрационной техники, в исследование динамики и создание вибрационных транспортирующих машин, в том числе питателей, внесли Блехман И.И., Спиваковский А.О., Гончаревич И.Ф., Быховский И.И., Нагаев Р.Ф., Тишков А.Я., Иофин С.Л., Сергеев В.Е. и др. Вибрационный питатель с упругим рабочим органом (вибролента), созданный в лаборатории вибротехники ИГД СО РАН Тишковым АЯ, Левенсо-ном С.Я., Гендлиной Л.И., Зимониным Л.В., зарекомендовал себя как производительная, недорогая и простая в обслуживании машина. Однако с его помощью не удается обеспечить зону воздействия на сыпучий груз, достаточную для предотвращения трубообразования при работе со связными материалами. В этом случае выпускается только часть сыпучего груза, расположенная непосредственно над рабочим органом устройства. Оставшийся материал постепенно уплотняется и его движение прекращается, что ведет к неполному использованию объема бункера. Выгрузка данной массы связана с дополнительными материальными и физическими затратами. В связи с этим возникла актуальная задача - обеспечить выпуск всей сыпучей среды, находящейся в накопительной емкости, без сводо- и трубообразования.
Цель работы состоит в создании вибрационного питателя, обеспечивающего выпуск всего объема связного материала, находящегося в емкости.
Идея работы заключается в оснащении упругого рабочего органа дополнительными конструктивными элементами, расширяющими зону вибровоздействия питателя на сыпучий груз.
Задачи исследования:
Разработка схемы вибропитателя, позволяющего выпустить с максимальной производительностью весь объем связного материала, находящегося в емкости.
Определение степени влияния конструктивных параметров вибрационного питателя на процесс выпуска связного сыпучего материала из бункера.
Создание методики расчета основньж параметров вибрационного питателя, оснащенного дополнительными конструктивными элементами.
Разработка рекомендаций по созданию промышленного образца вибрационного питателя.
Методы исследований: обобщение накопленного опыта по выпуску связньж сыпучих материалов; экспериментальные исследования на лабораторном стенде с использованием виброизмерительной аппаратуры с последующей статистической обработкой на ЭВМ; расчет основньж параметров машины при помощи программного обеспечения MathCAD 2000 Prof.
Основные научные положения, защищаемые автором:
расширение зоны вибровоздействия обеспечивается оснащением упругого ра
бочего органа в разгрузочной части дополнительными конструктивными эле
ментами в виде бортов и рассекателя потока.
Рост производительности вибрационного питателя достигается увеличением
угла наклона бортов до 30 и угла при вершине рассекателя потока - до 120.
Амплитуда колебаний рабочего органа с бортами под углом 30 уменьшается в
сравнении с амплитудой плоского рабочего органа при одинаковой производи
тельности, ее величина остается постоянной при увеличении нагрузки на пита
тель.
при расчете вибропитателя следует учитывать влияние его динамических пара
метров, а также конструктивных особенностей на величину присоединенной
массы связного сыпучего материала.
Достоверность научных результатов обеспечивается достаточным объемом экспериментальных исследований, применением апробированных методов измерения, статистической обработкой полученных данных при помощи современных методов с использованием ЭВМ, адекватностью экспериментально полученных результатов расчетным данным.
Научная новизна положений:
разработана схема вибрационного питателя с упругим рабочим органом, оснащенного дополнительными конструктивными элементами, позволяющего эффективно выпускать связные сыпучие материалы из бункеров;
установлено влияние дополнительных конструктивных элементов упругого рабочего органа питателя на объем выпуска связного сыпучего материла и динамические параметры питателя;
при расчете питателя учтено влияние дополнительных конструктивных элемен
тов на величину присоединенной массы сыпучего материала
Личный вклад автора состоит в обобщении накопленного опыта по выпуску сыпучих грузов из бункера, экспериментальном исследовании влияния конструктивных параметров вибрационного питателя на процесс выпуска связного материала, создании методики и программы расчета основных параметров машины, разработке схемы и рекомендаций по созданию промышленного образца вибрационного питателя.
Практическая ценность работы состоит в обосновании схемы вибрационного питателя с упругим рабочим органом, оборудованного дополнительными конструктивными элементами (свидетельства на полезную модель № 21289, № 23611, № 29711); а также в разработке методики инженерного расчета характеристик вибрационного питателя в зависимости от физико-механических свойств выпускаемого материала с учетом параметров дополнительных конструктивных элементов.
Реализация работы в промышленности. Результаты проведенных исследований переданы для проведения реконструкции бункеров ОАО «Новосибирский сельский строительный комбинат»
Апробация работы. Основные результаты исследований представлены в материалах конференции «Неделя горняка - 2002»/ г. Москва, 2002 г.; 1-й международной конференции «Современные проблемы машиностроения и приборостроения»/ г. Томск, 2002 г.: конференции «Неделя горняка - 2003»' г. Москва. 2003 г..: докладывались на международной конференции «Проблемы и перспективы развития горных наук»/ г. Новосибирск, 2004 г.
Публикации. Основное содержание диссертации изложено в восьми печатных работах, включая три свидетельства на полезную модель.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, трех разделов, выводов, списка литературы Общий объем работы составляет 108 страниц, в том числе 48 рисунков и 3 таблицы. Список литературы содержит 78 источников.
PoflRubus, подрод Idaeobatus
Все представители рода Rubus (Tourn.) L.5 который включает малину, ежевику и росянику, объединены под общим термином brambles., или колючие кустарники. Этот род состоит из крайне гетерозиготной серии видов и межвидовых гибридов. У немногих других родов растений существует такая путаница в номенклатуре и идентификации. Сообщалось о 400—500 видах, отнесенных к этому роду, главным образом из холодной и умеренной зон северного полушария; однако некоторые были найдены в тропических горных районах южного полушария и за Полярным кругом, а также на многих океанических островах (Gruber et al., 1962). Систематика рода была сильно затруднена вследствие скудости и неполноты гербарных образцов, собранных во многих районах земного шара, но, тем не менее, Л. Бейли сохранил огромное количество образцов. Многие природные и выведенные формы были сочтены гибридами исходя из предположений об их происхождении (Jennings, 1988).
Плоидность у Rubus при основном числе хромосом х=7 колеблется от диплоидов 2п=14 до додекаплоидов 2п=84. Большинство форм малины диплоиды (2п=14), за исключением немногих триплоидов, а также естественных и индуцированных тетраплоидов, тогда как ежевики имеют большой и непрерывный ряд плоидности и включают многочисленные межвидовые гибриды (Thompson, 1995, 1997).
Морфология хромосом у видов Rubus и вторичная конъюгация в мейозе полиплоидных форм, указывают, что набор хромосом состоит из семи основных хромосом (х = 7) длиной от 1,5 до 7,0 мк. Анализ хромосом в стадии пахитемы у R. parvifolius показал их высокую дифференциацию: положение центромер легко определяется по хроматическим участкам с каждой стороны, и каждая хромосома заканчивается хорошо обрисованными телохромомерами. Сравнение хромосом не было возможно по их абсолютной длине, но было надежным исходя из соотношения плеч и хроматического рисунка. У диплоидных R. idaeus и R. ulmifolius Schott. были обнаружены две хромосомы спутники (Heslop-Harrison, 1953; Bammi, 1965).
Розанова (1939) определила три автотетраплоидные расы R. idaeus, основываясь на хорошем образовании пыльцы и образовании квадри-валентов в мейозе. Биологические особенности малины
Малина — это кустарник с жесткими, прямостоячими дуговидными или стелющимися побегами. Большинство форм образует двухлетние побеги, но некоторые виды этого же рода — побеги только многолетние. Большинство видов Rubus теряет листья осенью, но имеются также немногие вечнозеленые виды. Размножение может быть и апомиктичным и половым.
В настоящее время все сорта малины разделяют в основном на две группы - это сорта с летним типом плодоношения и с ремонтантным типом плодоношения.
Сорта с летним типом плодоношения в первый год жизни образуют побеги замещения и корневые отпрыски, которые растут в длину и толщину. Их высота может достигать 1,5-3 метров, в зависимости от сортовых особенностей и условий выращивания. Интенсивный рост побегов происходит обычно в первой половине вегетации, когда их удлинение происходит не только в результате деятельности верхушечной меристемы, но и в значительной степени интеркалярно. Плодоношение начинается на втором году вегетации, после чего побеги отмирают (Е. И. Ярославцев, 1979; Казаков И. В.,2001).
Ремонтантные сорта формируют урожай на однолетних побегах и, следовательно, начинают плодоносить в первый год жизни. Возделывание ремонтантной малины по типу однолетней культуры значительно упрощает борьбу с болезнями и вредителями и, как правило, исключает применение химических средств защиты, что в свою очередь приводит к получению экологически чистой продукции. Это достигается, прежде всего, ежегодным удалением отгшодоносивших стеблей, что резко снижает уровень грибной инфекции и количество зимующих на побегах вредителей, так, например, практически снимается проблема вредоносности малинного и паутинного клещей, а также таких грибковых болезней, как дидимелла и антракноз (Казаков и др., 1999; Казаков, 1994).
Однолетний цикл формирования урожая в позднелетние сроки нарушает синхронизацию прохождения взаимосвязанных фенофаз развития растения и отдельных паразитов. Благодаря этому, например, ягоды малины осеннего урожая не повреждаются личинками малинного жука, которые уходят в почву еще до цветения однолетних побегов малины (Кичина В.В.,. Казаков И.В., 1995; Казаков, 1989).
Ягоды ремонтантных сортов малины значительно меньше подвержены загниванию, по сравнению с обычными сортами, так как их формирование происходит при контрастных дневных и ночных температурах (суточные колебания достигают 10-17 С), что сдерживает развитие серой гнили и, в то же время, стимулирует образование более плотной мякоти и толстой кожицы ягод (Казаков И.В., 1999; Кичина В.В., 1984).
Объекты исследований
Выделение растительной ДНК по методу Дорохова и др.} 1996.
1. Свежую растительную ткань в виде фрагмента листа (около 60 мг) или 1-2 листовых высечек, полученных при закрывании крышки пробирки типа Eppendorf объемом 1.5 мл (в этой пробирке проводили дальнейшее выделение ДНК),
2. Интенсивно гомогенизировали при комнатной температуре с использованием ручного тефлонового пестика в течение 30-40 с в 400 мкл экстракционного буфера (200 мМ трис-HCl, рН 7.5; 250 мМ NaCI; 25 мМ EDTA; 0.5% SDS). Гомогенизацию заканчивали интенсивным встряхиванием на Vortex в течение 5 секунд.
3. Пробирки помещали на водяную баню и проводили экстракцию 15 мин при 65С, периодически осторожно перемешивая содержимое пробирки.
4. После экстракции в пробирки добавляли по 200 мкл 5 М ацетата калия (предварительно охлажденного), тщательно перемешивали содержимое пробирки и инкубировали на ледяной бане 10 мин.
5. Пробирки центрифугировали при 16000 g 20 мин при комнатной температуре.
6. Осторожно отбирали 500 мкл супернатанта (следя за тем, чтобы не захватить частицы осадка) и переносили в чистую пробирку типа Eppendorf объемом 1.5 мл и добавляли 500 мкл изопропанола, тщательно перемешивали и оставляли при комнатной температуре на 3-5 мин. На этой стадии можно наблюдать дисперсный осадок ДНК или образование, небольшой "медузы".
7. Содержимое пробирок центрифугировали при комнатной температуре при 16000 g в течение 10 мин.
8. Осадок промывали 65%-ным этанолом, охлажденным при -20С, и центрифугировали при 16000 g 10 мин. Последнюю процедуру проводили дважды.
9. Осадок ДНК подсушивали JB на столе, открыв крышки пробирок и v растворяли в 100 мкл стерильной бидистиллированной и деионизиро-ванной воды.
Метод выделения по Van der Beek et al, 1991
1. Делали высечку молодых листьев путем закрывания крышечки микропробирки типа Eppendorf.
2. Отобранный материал растирали в пробирках объёмом 1,5 мл в охлаждённом буферном растворе DEB (1 мл) (Сорбитол - 0,35 М, Tris - 100 мМ, ЭДТА - 5 мМ, рН 7,5).
3. Полученную смесь центрифугировали 10 минут при 4С на 14000 оборотов в минуту.
4. После удаления надосадочной жидкости к осадку добавляли 125 мкл DEB. Содержимое пробирки ресуспендировали встряхиванием.
5. К полученной суспензии добавляли 175 мкл буфера для лизиса ядер (NLB) (Tris-HCl - 200 мМ, ЭДТА - 50 мМ, NaCl - 2 М, СТАВ - 2% в. р.) и 60 мкл 5%-го саркосила. Смесь инкубировали в водяной бане в течение 60 минут при 65С.
6. После инкубации и охлаждения в смесь добавляли раствор хлороформа и изоамилового спирта в соотношении 24:1 (750 мкл) и аккуратно перемешивали в течение 15 минут.
7. После центрифугирования в течение 10 минут на 14000 оборотах в минуту надо садочный раствор ДНК перенесли в отдельную пробирку.
8. К раствору добавили равный объём изопропилового спирта, охлаждённого до -20С.
9. После центрифугирования в течение 5 минут на 14000 оборотах в минуту удалили надосадочную жидкость, а осадок высушили.
10.Осадок растворили в 30 мкл деионизированной воды.
Модифицированный метод выделения ДНК на основе вышеприведенной методики по Дорохову и др.
Выделение ДНК малины
В настоящее время широкое применение быстрых и динамичных методов анализа ДНК, на основе нолимеразной цепной реакции, вызвало необходимость создания быстрых и эффективных микрометодов выделения ДНК. Это позволило значительно ускорить анализ генома растения и проводить его на ранних стадиях онтогенеза.
Для проведения своих исследований мы выбрали два, наиболее часто встречающихся в литературе, метода. Первый метод Van der Beek et al., 1991, а второй - Дорохова и др., 1996.
Два этих протокола привлекли нас своей простотой и экономичностью, однако при их использовании мы столкнулись с рядом сложностей. В первую очередь это связано с высоким содержанием в тканях листа малины феноль-ных соединений и полисахаридов, избавиться от которых используемыми нами методами оказалось невозможно. Вследствие чего препараты ДНК получались сильно загрязненными фенольними соединениями, которые инги-бировали действие Tafg-полимеразы при проведении ПЦР. Введение дополнительных очисток фенолом, хлороформом и изоамиловым спиртом не привело к значительному улучшению качества препаратов ДНК для обеих методик, но значительно увеличило время выделения.
На данном этапе мы посчитали целесообразным отказаться от метода предложенного Van der Beek et al., (1991) в связи с тем, что являясь более сложным и длинным, по отношению к методу Дорохова и др., (1996), он при дальнейшем его изменении еще больше усложнялся, не приводя к значительным улучшениям качества выделяемого препарата ДНК. При этом второй метод отличался большей простотой и скоростью выделения, а так же присутствием ряда этапов которые значительно способствовали повышению выхода ДНК и стандартизировали препараты по концентрации - это инкубация экстракта при 65С в течении 15 мин и преципитация 5 М ацетатом калия.
Для получения препаратов растительной ДНК высокой чистоты, свободных от фенольных примесей, нами были внесены ряд изменений во вторую методику. Мы ввели в буфер поликлар AT, который способствует адсорбции окисленных, не окисленных и конденсированных полифенолов и оказывает ингибирующее действие на полифенолоксидазу (Бузун, 1972). Так же мы дополнительно ввели в буфер антиоксиданты: 2-меркаптоэтанол (0,1%) и о-третбутилоксианизол (50 мг/л).
Для осаждения нуклеиновых кислот мы использовали равный объем 20% -ого полиэтиленгликоля ( мол. масса 6000), что позволяло избавиться от ряда пигментов, которые оставались в растворе, и полисахаридов (Lis, 1980). В тех случаях когда экстракция ДНК велась из однородного растительного материала выращенного в тепличных условиях или in vitro то опускалась обработка хлороформом, так как это не приводило к ухудшению качества препаратов ДНК.
В редких случаях, когда не удавалось получить качественный препарат ДНК, из-за использования пигментированного растительного материала, с явными признаками стрессового воздействия, собранного в полевых условиях, мы применяли дополнительную доочистку ДНК хлористым литием. Суть метода сводилась к следующему: к раствору ДНК добавляли % объема ЮМ LiCl и оставляли на 2 часа при -20С, что способствовало осаждению РНК, денатурированной ДНК, полисахаридов и пигментов (Verwoerd et al., 1988).
В результате препараты ДНК малины, выделенные модифицированным нами методом, получались однородными по концентрации и не деградированными (рис. 1).
