Введение к работе
Актуальность темы. Хитин был открыт в 1811 г. (H. Braconnot, A. Odier), хитозан - в1859 г. (C. Rouget), хотя свое нынешнее название получил в 1894 г. (F. Hoppe-Seyler). В первой половине ХХ в. к хитину и его производным был проявлен заслуженный интерес, в частности к нему имели непосредственное отношение три Нобелевских лауреата: E. Fisher (1903) синтезировал глюкозамин, P. Karrer (1929) провел деградацию хитина с помощью хитиназ и, наконец, W.N. Haworth (1939) установил абсолютную конфигурацию глюкозамина. В России первые работы по хитину относятся к 1933-1934 гг. (П.П. Шорыгин), хотя широкомасштабные исследования были начаты около 30 лет назад. Сегодня интерес к этим биополимерам небывало возрос. Чем больше ученые узнают о свойствах хитина и хитозана, тем шире сфера их практического использования. С каждым годом возникают совершенно новые и неожиданные направления. К числу основных направлений использования хитозана можно отнести медицину, ветеринарию, сельское хозяйство, косметологию и пищевую промышленность.
Источники получения хитозана имеются во многих странах, но промышленное производство этого биопрепарата освоено преимущественно в Японии, США, Корее и Китае.
От способа получения хитозана и метода его контроля зависит его качество и стандартность (К.Г. Скрябин, Г.А. Вихорева, В.П. Варламов, 2002; В.М. Быкова, С.В. Немцев, 2002; А.И. Албулов и др., 2005).
В ряде работ показаны технологические и методические проблемы получения стандартных препаратов хитозана (Д.В. Герасименко, 2005 и др.).
В настоящее время высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) является наиболее информативным методом анализа биологически активных соединений - белков, ферментов, аминокислот, пептидов, моно-, олиго-, и полисахаридов и др. (Я.И. Яшин, А.Я. Яшин, 2003).
Эксклюзионная ВЭЖХ является одним из основных методов определения молекулярно-массового распределения (ММР) полимеров хитозана (Б.Г. Беленький, Л.З. Веленчик, 1978; W. W. Yau,, J. Brugnerotto, J. Desbrieres, G. Roberts, M. Rinaudo, 2001 Ильена, Варламов и др 2001)
Цель и задачи работы. Целью настоящей работы является разработка методов повышения эффективности промышленного производства хитозана с использованием метода ВЭЖХ и разработка методики определения ММР полимерных молекул хитозана и содержания примесных соединений.
Для достижения этой цели поставлены следующие задачи:
1. Усовершенствовать отдельные технологические стадии получения хитозана для повышения эффективности промышленного производства и биологической активности получаемых продуктов.
2. Разработать методику определения качества хитозана с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Оценить пригодность высокосшитого ПДВБ сорбента для приготовления высокоэффективных хроматографических колонок (ВЭХК). Выбрать стандарты молекулярных масс для их градуировки.
3. Применеить метод ВЭЖХ для контроля в технологическом процессе разработки и совершенствования препаратов хитозана для народного хозяйства.
4. Оценить биологическую активность полученного хитозана.
Научная новизна.
Впервые усовершенствованы и оптимизированы технологический процесс производства хитозана с использованием экструдеров для измельчения и деацетилирования хитина.
Впервые использованы коммерческие ферментные препараты, широко используемых в кормопроизводстве для неспецифического гидролиза хитозана и получения низкомолекулярных олигомеров.
Впервые определено ММР полимерных молекул хитозана, содержание хитозан-хитиновых полимерных молекул и хитозан-белковых комплексов в препаратах хитозана при использовании ВЭХК (150 х 3 мм), заполненной моносферическими зёрнами высокосшитого ПДВБ сорбента диаметром 10 мкм [патент России № 2295127].
Впервые в качестве элюента и для растворения проб препаратов хитозана использован 3-4 % водный раствор уксусной кислоты. Определение ММР полимерных молекул хитозана в препаратах хитозана осуществляли на рефрактометрическом детекторе по первому хроматографическому пику, а содержание хитозан-хитиновых полимерных молекула и хитозан-белкового комплекса рассчитывали по площадям второго и третьего хроматографических пиков.
Впервые установлено, что на ВЭХК с высокосшитым ПДВБ сорбентом разделяются полимерные молекулы хитозана по эксклюзионному механизму, а элюирование хитозан-хитиновых полимерных молекул и хитозан-белкового комплекса по сорбционному механизму.
Впервые определены качественные отличия промышленно выпускаемых хитозанов, полученных различными способами.
Впервые показана биологическая активность промышленно получаемых хитозанов с различной молекулярной массой, охарактеризованных по молекулярно-массовому распределению и содержанию примесных соединений.
Практическая значимость работы.
-
Оптимизированы и усовершенствованы существующие технологии промышленного производства хитозана, улучшены его физико-химические характеристики, повышена биологическая активность.
-
Разработана методика определения в препаратах хитозана ММР полимерных молекул хитозана и содержания примесных соединений при использовании ВЭХК (150 х 3 мм), заполненной моносферическими зёрнами высокосшитого ПДВБ сорбента и 3-4 % водного раствора уксусной кислоты в качестве элюента.
-
Разработанная методика позволяет проводить качественный экспресс-контроль на производстве, обеспечивая высокие характеристики препаратов хитозана.
4. Разработанная методика позволяет контролировать физико-химические процессы, протекающие в препаратах хитозана при хранении.
5. Проведённые исследования позволили произвести промышленные партии хитозана с заданными свойствами и исследовать их в качестве лечебных и профилактических препаратов в животноводстве и ветеринарии.
На защиту выносятся:
1. Способы повышения эффективности промышленного производства хитозана.
2. Исследования высокосшитого ПДВБ сорбента, размер пор 500 Е, в виде моносферических зёрен диаметром 10 мкм для приготовления хроматографических колонок. Исследования по оценке подвижных фаз для разделения на ВЭХК, детектированию полимерных молекул хитозана, проведению пробоподготовки высоко- и низкомо-лекулярного хитозана для хроматографического анализа.
3. Исследования ММР высоко- и низкомолекулярного хитозана, содержания примесных соединений в препаратах, полученных различными способами с использованием разработанной методики.
4. Применение метода ВЭЖХ по разработанной методике для определения качественных характеристик в промышленных препаратах хитозана ЗАО “Биопрогресс” и фирмы “Флюка”.
5. Исследование биологических свойств хитозана с дифференцированной молекулярной массой.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на заседаниях Ученого Совета Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности, Щелково, 2004-2006; Международной научно-практической конференции, посвященной 35-летию Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности. Щелково, 2005; Международной научно-практической конференции “Актуальные проблемы ветеринарной медицины в условиях современного животноводства”, посвященной 75-летию института экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского НАН Беларуси и 100-летию со дня рождения академика Р.С. Чеботарева, Минск, 2005; научно-практической конференции “Перспектива и проблемы развития биотехнологии в рамках единого экономического пространства стран содружества”, Минск-Нарочь, 2005; Международной научно-практической конференции “Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов”, Щёлково, 2007; конференции “Основные проблемы ветеринарной медицины и стратегия борьбы с заболеваниями сельскохозяйственных животных в современных условиях”, Махачкала, 2007; VIII Международной конференции “Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана”, Казань, 2006; Всероссийском симпозиуме “Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях”, посвящённом юбилею профессора О.Г. Ларионова, Москва-Клязьма, 2007; Всероссийском симпозиуме “Хроматография и хромато-масс-спектрометрия”, посвящённом 100-летию со дня рождения профессора А.В. Киселёва, Москва-Клязьма, 2008; IХ Международной конференции “Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана”, Ставрополь, 2008.
Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, в том числе патент РФ.
Внедрение. В 2006-2008гг изготовлены и паспортизированы по разработанной методике 80 кг низкомолекулярного хитозана, полученного путем ферментативного и химического гидролиза, 60 кг сукцината хитозана, 40 кг гидрохлорида хитозана. Изготовлена опытная партия зубной пасты с хитозаном в количестве 4 кг.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, список литературы и приложения. Диссертация иллюстрирована 11 таблицами и 10 рисунками. Список литературы содержит 203 источника, в том числе 157 зарубежных.
Похожие диссертации на Повышение эффективности промышленного производства хитозана с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии и разработка методики определения молекулярно-массового распределения
