Содержание к диссертации
Введение
Раздел 1. Обзор литературы . 15
1.1. Актуальность развития сельскохозяйственных геномных и клеточных биотехнологий . 15
1.2. Современные направления применения молекулярно-генетических методов в работе с сельскохозяйственными видами животных . 24
1.3. Геномная нестабильность и методы ее выявления у животных сельскохозяйственных видов . 36
1.4. Дестабилизация геномов и структурно-функциональная организация ретровирусов на примере вируса бычьего лейкоза 48
1.5. Эмбриональные стволовые клетки и проблемы подбора векторов для их генетической трансформации . 72
1.6. Мезенхимальные стволовые клетки . 99
Раздел 2. Материалы и методы исследования 107
2.1. Геномные технологии . 107
2.2. Клеточные технологии 111
2.3. Статистическая обработка результатов . 120
Раздел 3. Результаты и их обсуждение . 121
3.1. ISSR-PCR маркеры для полилокусной оценки геномов животных разных пород крупного рогатого скота 121
3.2. Интегральная оценка геномной нестабильности с использованием цитогенетических характеристик соматических клеток крупного рогатого скота 138
3.3. Идентификация животных, инфицированных вирусом бычьего лейкоза 160
3.4. Генетические взаимоотношения по ISSR-PCR маркерам между инфицированными BLV и свободными от инфекции коровами хозяйства «Можайское» . 171
3.5. Методы прогноза «горячих» сайтов мутирования в структурных генах ретровирусов на примере вируса бычьего лейкоза 183
3.6. Эмбриональные стволовые клеточные популяции 197
3.7. Мезенхимальные стволовые клетки . 227
Заключение . 233
Выводы 238
Практические рекомендации 240
Список сокращений . 242
Список литературы 243
Приложение 1 298
Приложение 2 . 299
Приложение 3 . 300
Приложение 4 . 301
- Современные направления применения молекулярно-генетических методов в работе с сельскохозяйственными видами животных
- Дестабилизация геномов и структурно-функциональная организация ретровирусов на примере вируса бычьего лейкоза
- Статистическая обработка результатов
- Интегральная оценка геномной нестабильности с использованием цитогенетических характеристик соматических клеток крупного рогатого скота
Введение к работе
Актуальность применения геномных и клеточных технологий в целях ускорения селекционной работы, размножения и преимущественного сохранения животных с желательным проявлением фенотипических признаков, консолидации имеющихся и получения генетически трансформированных животных не вызывает сомнений на протяжении нескольких последних десятилетий (Зиновьева Н.А., Эрнст Л.К., 2006; Эрнст Л.К., Зиновьева Н.А., 2008, 2010; Самуйленко А.Я. и др., 2000, 2013; Харченко П.Н., Глазко В.И. 2006; FAO, 2007 – 2012; Pedersen L.D. et al., 2012). Однако до сих пор использование этих технологий не приобрело массового масштаба и во многих случаях не выходит за рамки экспериментальных исследований. Одной из причин такого отставания практического применения накопленных технологий, по-видимому, может являться отсутствие концепции последовательных этапов их применения в целях увеличения эффективности и сокращения времени традиционной селекционной работы. Первым этапом такой технологической цепочки должен быть комплекс методов, позволяющий отбирать и подбирать животных с повышенной вероятностью желательного проявления характеристик продуктивности и адаптивного потенциала в их потомстве. В целях прогноза продуктивности в настоящее время, в частности, в молочном скотоводстве, применяются методы «геномной селекции», когда на основании геномного сканирования по мононуклеотидным заменам (SNP) отбираются группы полилокусных генотипов, объединяющие быков с высокой молочной продуктивностью их дочерей. В дальнейшем такие комплексные генотипы используются для отбора среди молодых бычков наиболее перспективных для ускорения генетического прогресса (Weller J., Ron M., 2011; Dekkers J.C.M., 2012, Lenstra J. A. et al., 2012; Schwarzenbacher Y. et al., 2012). Однако оказалось, что селекционная ценность быков, оцениваемая по молочной продуктивности их дочерей, существенно зависит от эколого-географических условий воспроизводства коров-дочерей с применением искусственного оплодотворения спермопродуктами, получаемыми от одних и тех же быков (Hammami H et al., 2008, 2009). Более того, соответствующий анализ показал, что в разных условиях воспроизводства существенно меняется вклад в общую фенотипическую изменчивость характеристик молочной продуктивности паратипической и генетической компонент (Hammami H et al., 2008, 2009; ., 2012). Из этого следует, что одним из условий успешности применения методов геномной селекции является контроль адаптивного потенциала животных.
В условиях России одной из проблем сниженного адаптивного потенциала молочного скота является высокая инфицированность вирусом бычьего лейкоза (BLV), по результатам многих исследований тесно связанная с повышенной молочной продуктивностью коров (Гладырь Е.А и др., 2011; Виноградова И.А., 2012). В этой связи при отборе и подборе животных в целях получения стад с высокой молочной продуктивностью особую актуальность приобретает развитие методов выявления инфицированных животных этим ретровирусом. К настоящему времени накоплено много данных по применению в этих целях полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами к наиболее консервативным участкам провирусного генома (например, Гладырь Е.А. и др., 2011; Зиновьева Н.А. и др., 2012). В то же время, оценка консервативности того или другого гена провирусного генома основывается на ограниченном (не более нескольких десятков) количестве секвенированных полных последовательностей таких структурных генов BLV, как gag, pol, env, представленных в GenBank. Это существенно повышает вероятность ошибок при таком способе идентификации зараженных животных, особенно с учетом высокой скорости и сетевых особенностях эволюции ретровирусов (Llorens C et al., 2009; Benachenhou F et al., 2013). В этой связи особую актуальность приобретают поиски методов, позволяющих прогнозировать наличие «горячих» точек мутирования в провирусном геноме ретровируса, связанных, в частности, с наличием в нем участков ДНК, предрасположенных к формированию неканонических структур ДНК, таких как G4 квадруплексы, которые ассоциированы с повышенной частотой двуцепочечных разрывов ДНК (Sharma S, 2011).
Сложности отбора и подбора животных в целях получения достаточно продуктивных стад с высоким адаптивным потенциалом требуют особого внимания к необходимости упрощения и увеличения надежности применения клеточных технологий для их репродукции. Одним из таких направлений является разработка и стандартизация методов суперовуляции у крупного рогатого скота для получения большого количества эмбрионов с последующей эмбриотрансплантацией реципиентам. Тем не менее, не смотря на то, что работы по эмбриотрансплантациям развиваются в течение нескольких последних десятилетий, до сих пор остаются недостаточно исследованными причины их относительно низкой эффективности по сравнению с ожидаемыми результатами по генетическому прогрессу стад с использованием таких приемов.
Другое направление применения клеточных технологий для размножения животных с желательным потенциалом продуктивности и адаптивности связано с эмбриональными стволовыми клеточными линиями. К настоящему времени получено несколько сотен эмбриональных стволовых клеточных линий из эпибластов мышей лабораторных линий (D’Hulst C., 2013). Получение таких клеточных линий у крупных млекопитающих оказалось существенно более сложной задачей. Причем причины таких отличий до сих пор остаются недостаточно исследованными. В этой связи, до сих пор остается актуальным получение первичных примордиальных клеточных популяций у крупных млекопитающих, разработка условий для их продолжительного пассирования и изучение возможных причин сниженного потенциала для образования из них постоянных клеточных линий (Ruggeri R. R. еt. al., 2012).
Сложности получения постоянных эмбриональных стволовых клеточных линий привели к необходимости поиска других источников клеточных популяций с сохраненным полипотентным потенциалом клеточной дифференцировки. В последние годы в этом направлении активно развиваются методы использования для получения полипотентных стволовых клеток клеточных популяций мезенхимальной стромы, в основном, костного мозга и жировой ткани (Dominici M, 2006). Это направление имеет особое значение, поскольку в ряде исследований была наглядно показана успешность применения мезенхимальных стволовых клеток (МСК) для решения ряда ветеринарных проблем у животных сельскохозяйственных видов (Калиновский А.А., 2012). В то же время, до сих пор недостаточно развиты методы, позволяющие оценивать наличие МСК по их полипотентному потенциалу к клеточной дифференцировке среди мезенхимальных стромальных клеток, выделенных из разных органов. Это, соответственно, сдерживает разработки приемов по воспроизводимому получению МСК от индивидуальных животных для решения проблем применения МСК, в частности, в репродуктивных технологиях.
Целенаправленные разработки для создания единой концепции получения животных с желательным продуктивным и адаптивным потенциалом с использованием геномных технологий, усовершенствования методов применения клеточных технологий для их размножения могли бы способствовать увеличению эффективности традиционной селекционной работы с животными сельскохозяйственных видов
Цель данной работы – оптимизация клеточных и геномных технологий для устойчивого воспроизводства желательных групп млекопитающих на примере крупного рогатого скота (КРС).
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
-
Подбор методов полилокусного генотипирования в целях выявления генофондных отличий на примере животных, принадлежащих к молочным и примитивным породам.
-
Усовершенствование методов выявления животных, инфицированных ретровирусными инфекциями, на примере вируса бычьего лейкоза (BLV).
-
Разработка методов прогноза наиболее полиморфных участков провирусного генома ретровируса с целью оптимизации подбора праймеров для идентификации провирусной ДНК с использованием методов биоинформатики.
-
Оценка применения трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота с учетом необходимости предупреждения накопления генетического груза в потомстве.
-
Получение эмбриональных стволовых клеточных популяций из бластоцист крупного рогатого скота, развившихся в культуральных условиях после оплодотворения ооцитов in vitro.
-
Оценка генетической гетерогенности представителей эмбриональных стволовых клеточных линий на примере модельного объекта – эмбриональных и герминативных стволовых клеточных линий, полученных от разных линий мышей.
-
Разработка условий выделения и пассирования мезенхимальных стволовых клеток с применением имитирования трехмерной организации тканей для увеличения жизнеспособности клеток и их дифференцировки в желательном направлении.
Научная новизна исследования
Разработан комплексный подход к выделению животных с желательным фенотипом с использованием методов геномного сканирования, к усовершенствованию методов применения клеточных технологий для репродукции крупного рогатого скота. Вперые получены данные об эффективности использования полилокусного генотипирования по фрагментам ДНК, фланкированным инвертированными повторами ряда микросателлитов, для выявления отличий между специализированными молочными и примитивными породами крупного рогатого скота. С применением этого же метода впервые оценена внутрипородная дифференциация инфицированных животных вирусом бычьего лейкоза (BLV) с разным потенциалом по молочной продуктивности. Разработана оригинальная мультиплексная RT - PCR тест-система по двум консервативным участкам генов провирусной ДНК gag и pol с внутренним положительным контролем (ablim2, кодирующий белок, принадлежащий к семейству актин-связывающих белков) для выявления в геномах животных провирусной ДНК BLV. Впервые обоснована необходимость и возможность выделения наиболее консервативных участков провирусной ДНК ретровирусов с учетом предрасположенности к формированию неканонических структур ДНК – маркеров геномной нестабильности, в нуклеотидных последовательностях провирусноой ДНК ретровируса. Впервые оценены возможности применения различных подходов к индукции суперовуляции у крупного рогатого скота и выявлена положительная статистически достоверная корреляция между частотой встречаемости отдельных цитогенетических аномалий в клетках периферической крови у коров-доноров и количеством полученных от них эмбрионов. Подобраны условия для получения первичных популяций эмбриональных стволовых клеток из бластоцист крупного рогатого скота, полученных при оплодотворении ооцитов in vitro. Впервые выявлены отличия по успешности трансфекции плазмидой pEGFP-N1 ооцитов, фетальных фибробластов и клеток кумулюса, позволяющие предположить определенную агрессивность популяции сперматозоидов по отношению к ДНК плазмиды, используемых при оплодотворении ооцитов. Впервые разработаны методы выделения и пассирования клеток, выделенных из костного мозга и жировой ткани, с их иммобилизацией на 3-х мерных матриксах из желатиновых криогелей, доказана их принадлежность к мезенхимальным стволовым клеткам путем успешного создания условий и выявления маркеров дифференцировки клеток в хондроциты и адипоциты.
Защищаемые положения
-
Полилокусное генотипирование с применением ISSR-PCR (Inter Simple Sequence Repeats) маркеров позволяет выявлять отличия между животными, принадлежащими к специализированным молочным и примитивным породам КРС.
-
Применение в Real-time PCR комплекса праймеров к разным генам провирусной ДНК BLV на ряду с «внутренним контролем» к структурному гену генома хозяина (КРС) позволяет увеличить надежность выявления инфицированных BLV животных по сравнению с разработанной для исследований тест-системой GenPakTM DNA PCR test (ООО «Лаборатория Изоген»).
-
Прогноз консервативности участков провирусного генома ретровирусов, выполняемый при подборе праймеров для их выявления, необходимо проводить с учетом контекстных особенностей провирусного генома и предрасположенности его различных участков к формированию неканонических структур ДНК, в частности, G4 квадруплексов маркеров геномной нестабильности.
-
Применение технологий эмбриотрансплантаций должно сопровождаться цитогенетическим контролем коров-доноров эмбрионов для предупреждения накопления генетического груза в потомстве.
-
Получение эмбриональных стволовых клеточных линий с целью их использования в биотехнологических процедурах требует контроля их генетической стабильности, отличающейся у клеточных популяций разного происхождения.
-
Использование 3-мерных матриксов для иммобилизации мезенхимальных стволовых клеток позволяет выделять и поддерживать клеточные клоны, способные к дифференцировке в производные мезенхимального листа, проявляя таким образом, идентификационные характеристики мезенхимальных стволовых клеток.
Практическая значимость исследования
Данные о высокой эффективности дифференциации животных по специализации в отношении молочной продуктивности при использовании методов геномного сканирования с применением генотипирования по фрагментам ДНК в диапазоне длин до 2000 пар оснований (п.о.), фланкированных инвертированными повторами микросателлитов, могут непосредственно применяться при отборе и подборе животных с целью повышения их потенциала по молочной продуктивности. На практике подтверждена относительно повышенная эффективность использования для выявления инфицированных BLV животных разработанной оригинальной тест-системы по сравнению с имеющейся для исследований GenPakTM DNA PCR test (ООО «Лаборатория Изоген»). Метод прогноза «горячих» точек мутирования на основании выявления нуклеотидных последовательностей с высокой предрасположенностью к формированию неканонических структур ДНК, в частности, G4 квадруплексов, может быть прямо использован для разработке праймеров при создании тест-систем на основе ПЦР для выявления интеграции провирусной ДНК патогенных ретровирусов. Полученные экспериментальные данные о положительной корреляции между частотой встречаемости отдельных цитогенетических аномалий в клетках периферической крови коров-доноров и количеством полученных от них эмбрионов свидетельствует о необходимости обязательного контроля при использовании биотехнологических процедур в целях предупреждения накопления генетических дефектов в стадах крупного рогатого скота. Данные, полученные при выделении и культивировании эмбриональных стволовых клеток крупного рогатого скота, позволяют разработать методику по получению и поддержанию культур этих клеток с целью их дальнейшего использования в биотехнологических процессах. Разработанная методика культивирования и дифференцировки мезенхимных стволовых клеток, иммобилизованных на 3-х мерных матриксах, в хондроциты позволяет использовать данные клетки для получения тканеинженерных конструкций.
Результаты исследований включены в 8 методических положений, 2 методических пособия, 3 методические рекомендации утвержденных на секции «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии академиком-секретарем А.М. Смирновым.
Результаты исследования и методология может быть использована разработчиками и производителями диагностических и лечебных средств для ветеринарии.
Результаты работы использованы в курсах лекций по инновационным биотехнологиям для бакалавров, магистров и аспирантов зооинженерного факультета РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева.
Апробация работы
Материалы диссертационного исследования представлены, доложены и обсуждены:
в виде ежегодных отчетов по темам государственных заданий на заседаниях ученого совета и методической комиссии ГНУ ВНИТИБП Россельхозакадемии (2009-2012 гг.);
в виде ежегодных отчетов по темам государственных заданий на заседаниях ученого совета ГНУ ЦЭЭРБ Россельхозакадемии (2012-2013 гг.);
на секции «Ветеринарная биотехнология» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии;
на международных и Всероссийских конференциях и конгрессах, ниже представлены основные из них: 60th AAAAI Annual Meeting (San Francisco, March 19-23, 2004); Международной конференции «Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты» (г.Москва, 2005); Международной научной конференции "Наследие Н.И. Вавилова - фундамент развития отечественного и мирового сельского хозяйства» (г.Москва, ноябрь 2007); I Научно-практической конференции по профпатологии «Актуальные вопросы профпатологии»(г. Северодвинск, 2007); IV Международной научно-практической конференции (г.Томск, апрель 2007); IRPA regional congress for Central and Eastern Europe (Romania, 2007); Международном конгрессе «Восстановительная медицина и реабилитация-2007»; Российско-китайской научно-практической конференции «Диагностика и профилактика инфекционных болезней животных» (Харбин, 10-13 июля 2009 г); Международной научно-практической конференции, посвященной 40-летию ВНИТИБП РАСХН «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (Щелково, 9-10 декабря 2009 г.); Международном Конгресс-Партнеринге и Выставке по биотехнологии и биоэнергетике (Москва, 13-15 апреля 2010); II-Международной научно-практической конференции «Молодые ученые в решении актуальных проблем в науке» (Владикавказ, 2011); III международной научно-практической конференции «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки» (Владикавказ, 2012); Международной научно-практической конференции "Научные основы производства и обеспечения качества биологических препаратов для АПК" (Щелково, 5-7 декабря 2012); V Международной научно-практической конференции « Ветеринарнiпрепарати: Розробка, контроль якостi та застосування» (м.Львiв, 2-4 жовтня 2013); Первом Южно-Российском международном ветеринарном конгрессе (г. Ростов-на-Дону 26-27.09.2013); II Международной научно- практическая конференции: «Новейшие достижения биотехнологии» (м.Кiев 24-25 жовтня 2013); III Международной научно-практической конференции "Сельскохозяйственные науки и агропромышленный комплекс на рубеже веков" (Новосибирск, 27 сентября 2013 г.); 2013" (Москва, 19 февраля 2013); VII Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 19-22 марта 2013г.); VII Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Наука и устойчивое развитие» (Нальчик 2013); II конференция участников российского биомаркерного консорциума "БИОМАРКЕРЫ Московская конференция по молекулярной вычислительной биологии «MCCMB'13» (25–28 июля 2013 года, Москва).
Разработки удостоены 8 дипломами, 7 золотыми и одной бронзовой медалью Российской агропромышленной выставки «Золотая осень», Москва (2010 г., 2012 г., 2013 г.).
Публикации
Материалы диссертационного исследования опубликованы в одной монографии, одних методических рекомендациях, 82 печатных работах, из которых 25 статей в научных журналах, включающих 17 статей в журналах из перечня, рекомендованного ВАК Минобрнауки России для публикации материалов докторских диссертаций, остальные работы опубликованы в сборниках научных трудов, материалах международных и Всероссийских научных конгрессов и конференций. По результатам исследований получено 3 патента РФ на изобретение, одно положительное решение на выдачу патента РФ на полезную модель.
Структура и объем диссертации
Современные направления применения молекулярно-генетических методов в работе с сельскохозяйственными видами животных
Развитие молекулярной биологии, в частности, молекулярной генетики, привело к изменениям во многих представлениях о путях и методах прогноза и лечения заболеваний как у человека, так и у животных [43]. Медицинская молекулярная биология, так же как и ветеринарная, в несколько последних десятилетий вышла на ускоренные темпы развития. Появились качественно новые методы диагностики генетически детерминированных заболеваний, распространения инфекционных агентов, а также профилактики и лечения различных заболеваний. Изменения в поисках новых методов лечения, в общем, сводятся к нескольким главным направлениям. К ним относятся такие, как увеличение точности, «адресовки» терапевтических средств на разных уровнях организации биологического материала, начиная от коротких регуляторных нуклеотидных последовательностей, методов «адресного» трансгеноза, подгонки синтетического лекарства к домену белка – ключевых посредников запуска каскада патологических изменений, до разработки биопрепаратов с целью вытеснения патогенов из метагенома многоклеточных организмов. По своей сути, это направление является развитием работ Пауля Эрлиха (1854-1915 гг), мечтавшего найти «золотую пулю» для инфекционных агентов, а также измененных клеток при развитии онкологических процессов. Другое близкое к этому, но менее «репрессивное» направление – разработка терапевтических средств коррекции патологических изменений метаболома (совокупности метаболических реакций) на основании накопления информации о ключевых звеньях патологических биохимических изменений, таких, например, как дефекты антиоксидантных систем, сниженная активность ферментов детоксикации и ряд других. Это направление смыкается с разработками новых методов помощи многоклеточным организмам на основе активации собственных защитных систем, направленных не столько на адресованное уничтожение «агрессоров» (патогенов, собственных измененных клеток), а на выстраивание такой линии терапии, которая позволяет собственным клеточным популяциям, в том числе и симбионтам, заблокировать патогенный процесс. Основателем этого направления был Илья Ильич Мечников (1845 – 1916 гг), создавший теорию клеточного иммунитета, оздоровления с помощью «болгарской палочки», разрабатывавший теорию автотрофного питания человека и других работ [85]. Закономерно, что Пауль Эрлих и И.И. Мечников вместе стали Нобелевскими лауреатами в 1908 г «За труды по иммунитету» в области физиологии и медицины. В последние годы, в связи с необходимостью интенсификации животноводства, глобальными экологическими изменениями, распространением монопородности и генетической эрозии пород, актуальность в животноводстве развития применения всех этих направлений существенно возросла. Не смотря на то, что их зарождение относится к концу XIX, началу XX веков, направления исследований и их прикладная значимость не изменились, но создание новых инструментов и методов позволило перейти на новый масштаб исследований, в область нанобиотехнологий [15, 273]. В связи с методами секвенирования геномов, активно развивается направление, суть которого связана с надеждами выделить такие биомаркеры, контроль которых мог бы позволить предсказывать устойчивость организмов не только к инфекционным заболеваниям, но и к другим, абиотическим, неблагоприятным факторам окружающей среды. Ранее наиболее широко, для выявления биомаркеров устойчивости к различным заболеваниям, создания генетически обоснованных программ сохранения генофондов пород с.-х. видов животных, исключения ошибок происхождения, контроля и ускорения селекционного процесса, использовали ограниченное количество молекулярно-генетических маркеров полиморфизма, как правило, кодирующих последовательности структурных генов (группы крови, электрофоретические варианты белков), в последующем — анонимные маркеры ДНК, затем — генотипирование микросателлитов. Фирма «Прикладные биосистемы» (www.appliedbiosystems.com) по согласованию с Food and Agricultural Organization (FAO) и International Society of Animal Genetics (ISAG) для крупного рогатого скота разработала тест-систему для генотипирования 11 микросателлитов (необходима закупка соответствующего оборудования, программ анализа и расходных материалов). Очевидно достоинство этих микросателлитов, поскольку известна их локализация на хромосомах крупного рогатого скота (микросателлиты: TGLA227, BM2113, TGLA53, ETH10, SPS115, TGLA126, TGLA122, INRA23, ETH3, ETH225, BM1824). Обычно такие работы включали генотипирование в среднем, примерно 10 локусов. В последние годы широкое распространение получили методы одновременного генотипирования на ДНК-матрице одного животного полиморфизма нескольких десятков участков ДНК, фланкированных инвертированными повторами микросателлитов (Inter-Simple Sequence Repeat — ISSR-PCR), или терминальными районами мобильных генетических элементов (IRAP-PCR). Благодаря разработке методов использования ДНК-микроматриц, на которых прикреплены миллионы эталонных фрагментов ДНК, в настоящее время успешно оценивают в одном геноме десятки тысяч мононуклеотидных полиморфизмов (Single Nucleotide Polymorphism — SNP). Совокупность этих методов получила название «геномного сканирования» и обеспечила возможность перейти к сравнению генотипов не по штучным генам или локусам, а одновременно по целым геномам. Геномное сканирование может варьировать от использования нескольких десятков или сотен маркеров до истинного геномного сканирования путем полного секвенирования геномов.
Дестабилизация геномов и структурно-функциональная организация ретровирусов на примере вируса бычьего лейкоза
Ускоренное накопление результатов секвенирования геномов различных организмов изменили представления о структуре и механизмах изменчивости самого аппарата наследственности. Оказалось, что большая часть генетического материала, в частности, у животных, представлена мобильными генетическими элементами (транспозонами – ТЕ). Суммарно TE составляют 45%, 38%, 15–22%, 12%, и 9% геномов человека, мыши, плодовой мушки и домашней курицы соответственно, в секвенированных геномах крупного рогатого скота они занимают 46,5% [400], домашней лошади – 36% [416].
В некоторых геномах обнаружено, что накопление ТЕ в различных геномных участках тесно связано с сегментыми дупликациями, с изменчивостью копийности коротких участков ДНК (Copy Number Variability – CNV) [400]. Получены данные о том, что частота встречаемости CNV, например, у крупного рогатого скота, существенно выше ( 1/10000 пар нуклеотидов) по сравнению с мононуклеотидными заменами (Single Nucleotide Polymorphism – SNP) ( 1/50000 пар оснований). Выраженный полиморфизм и видоспецифичность ТЕ, высокая скорость их дивергенции даже за короткое время расхождения групп организмов от общего предка, наглядно описанная на примере геномов лабораторных линий мышей [321], свидетельствуют о том, что основным источником геномной изменчивости являются ТЕ. Следует подчеркнуть, что диспергированные повторы, представленность которых в геномах животных сельскохозяйственных видов насчитывает несколько десятков процентов, являются либо прямым результатом встройки в геном экзогенных ретровирусов, либо их последовательной деградации уже после интеграции в геном, либо вовлечением в транспозиции неавтономных элементов. Классификация диспергированных повторов с указанием взаимосвязей между ними представлена на (рис.1). Рисунок 1. Схемы структурной организации мобильных генетических элементов второго класса – ДНК транспозоны и первого класса – ретротранспозонов [280, 345]. Не смотря на дискуссионность и общие сложности таксономии [348], в макромасштабе сохраняются традиции, соответствующие предложениям Международного комитета по таксономии вирусов (1975-1978) в связи с которыми семейство Retroviridae (ретровирусы) делится на три подсемейства: Oncovirinae (онковирусы), Lentivirinae (лентивирусы), и Spumavirinae (спумавирусы). Последние два подсемейства немногочисленны и мало изучены.
Спумавирусы найдены как инфекционные загрязнители первичных клеточных культур. Они вызывают их “пенную деградацию”. Обнаружены у различных представителей млекопитающих, включая кошек, коров, приматов и человека. Они могут вызывать хроническую инфекцию.
Лентивирусы характеризуются тем, что вызывают заболевание после довольно долгих латентных периодов. Среди них наиболее изучены вирусы овец, такие как вирус висны и вирус Маеди. Первый вызывает прогрессирующие нейродегенеративные заболевания, другой - хроническую пневмонию. У овец и коз найдены еще и другие вирусы, которые относятся к данному подсемейству.
Онковирусы - это самое многочисленное семейство. Они распространены среди рыб, пресмыкающихся, птиц и млекопитающих, включая человека. Онковирусы наиболее детально изучены. При классификации представителей подсемейства учитывается строение, морфогенез, принадлежность к виду-хозяина.
Различают четыре основных типа онковирусных частиц - А, В, С и D. Обозначение типов введены по морфологическим признакам вирионов, которые обнаруживаются при электронной микроскопии тонких срезов зараженных клеток.
Основная часть онковирусов относится к С-типу. Наиболее изученными возбудителями заболеваний животных являются следующие: вирус лейкоза крупного рогатого скота (BLV); вирусы лейкоза и саркомы кошачьих (FeLV, FeSV); вирусы лейкоза и саркомы павианов, гиббонов и шерстистых обезьян (BEV, GALV, SSV); вирусы ретикулоэндотелиоза, саркомы и лейкоза птиц (REV, ASV, ALV); вирусы саркомы и лейкоза мышей (MuSV, MuLV) и др. Для человека известна целая группа ретровирусов, которые вызывают заболевания, связанные с нарушениями функции иммунной системы. Так, HTLV-I, II, IV, - вызывают Т-клеточные лейкозы, которые в основном приводят к летальному исходу. Группа вирусов, которую связывают с развитием СПИДа у человека, включает в себя HIV-I и HIV-II.
Ретровирусы были первыми среди открытых инфекционных онкогенных агентов. Первым признанным онкогенным вирусом стал фильтрующийся агент выделенный из спонтанной саркомы кур [359]. Пейтон Раус получил его в 1911 году и показал, что он способен вызывать саркомы у зараженных цыплят. Вирус саркомы Рауса (RSV) наиболее детально изучен среди всех ретровирусов, и именно для него было сформулировано большинство принципов, характеризующих жизненный цикл этого подсемейства, которые применимы и для других ретровирусов. Ретровирусы имеют ряд уникальных свойств, что привлекает к ним особое внимание. В то время, когда вирусы других семейств (семейства Poxviridae, Adenoviridae, Picornaviridae, Caliciviridae) вызывают гибель зараженной клетки, ретровирусы, как правило, вызывают хроническую инфекцию чувствительных клеток. Продолжительная экспрессия вирусных генов, как правило, не сопровождается цитотоксическим эффектом. Ретровирусная инфекция может сопровождаться усилением клеточной пролиферации. Механизм репликации ретровирусов уникален. Хотя вирусный геном представлен одноцепочечной РНК, во время его репликации в клетки он проходит стадию формирования двухцепочечной ДНК, которая эффективно интегрирует в геном хозяйской клетки. Процесс преобразования вирусной РНК в форму линейной двухцепочечной ДНК осуществляет вирусная РНК -зависимая ДНК-полимераза (RT). Еще одна характерная черта ретровирусов, также связана с особенностями их репликации, это существование некоторых из них в форме эндогенных провирусов, которые интегрированы в геном клеток хозяина и передаются вертикально (от родителей к потомкам). Ряд ретровирусов передаются только горизонтально, как большинство инфекционных агентов.
Статистическая обработка результатов
Выбор животных для их использования в биотехнологических процедурах требует разработки объективных критериев их оценки, независящих от влияния факторов окружающей среды. Информация по генетическому разнообразию существенна для разработки стратегий по оптимизации сохранения и использования генетических ресурсов животных сельскохозяйственных видов. Принято считать, что новые инструменты молекулярной биологии могут разрешить идентифицировать гены, участвующие в формировании многих признаков, включая адаптивные признаки, и нуклеотидный полиморфизм, приводящий к функциональным генетическим вариантам (QTN – нуклеотиды количественных признаков - Quantitative Trait Nucleotides). В связи с сокращением биоразнообразия в животноводческом секторе, повышением затратности животноводства и негативным влиянием на окружающую среду все более приоритетным для управления генетическими ресурсами является сохранение пород и групп животных с уникальными фенотипическими признаками. Среди них главное значение имеют такие признаки, как устойчивость к инфекционным заболеваниям, высокий уровень адаптированности к меняющимся факторам окружающей среды, способность выживать и давать продукцию в условиях рискованного животноводства. Комплекс признаков, таких как адаптация и устойчивость к заболеваниям, не являются видимыми или легко измеряемыми. Они могут быть исследованы в экспериментах, в которых животные подвергаются специфическим средовым воздействиям или инфицируются соответствующими агентами. Однако такие эксперименты трудны и дороги для проведения. В этой связи, особенно в последние годы, ведутся поиски молекулярно-генетических маркеров полиморфизма различных участков ДНК, которые могли бы позволить надежно маркировать альтернативные состояния генов, критических для формирования не только хозяйственно ценных признаков, но и систем, связанных с такими косвенными характеристиками, как способность к адаптации, устойчивости к инфекциям, нетребовательность к кормам и ряд других сложных признаков. Такие маркеры могут быть получены разными способами, в частности, методами геномного сканирования или полилокусного генотипирования.
Использование моногенных фенотипических признаков как «сигналиев» полиморфизма генов впервые было предложено А.С.Серебровским в 20-х годах XX столетия [105]. Однако они были редки, отличались низким уровнем полиморизма и требовали сложного генетического анализа. Следующим поколением молекулярно-генетических маркеров полиморфизма геномных участков, кдирующих белки, были группы крови, выявляемые с использованием эталонных антител, получаемых от иммунизированных животных – доноров. Но такой полморфзм описывал достаточно узкую по своей функции систему белков, локализованных на плазматических мембранах эритроцитов. Далее появились электрофоретические варианты белков с широким спектром биохимических функций, которые отражали нуклеотидные замены в кодиующих последовательностях, но только ту их часть, которая приводила к изменению электрического заряда белковой молекулы. Кроме того, в эпоху секвенирования геномов оказалось, что кодирующие аминокислоты последовательности занимают в геномах млекопитающих всего около 2% всех нуклеотидов.
Следующим этапом стало генотипирование животных по микросателлитным локусам с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР или PCR). Но, во-первых, микросателлиты занимают малую часть генома у высших млекопитающих, по сравнению, в частности, с диспергированными повторами, как мы уже отмечали в разделе Обзор литературы (табл. 1.1, 1.2). И во-вторых отличаются по очень специфическому механизму своего полиморфизма, реализуемого путем вставок и делеций полноразмерной элементарной единицы тандемного повтора, предполагаемого «проскальзывания» при репликации [135]. В наших исследованиях были подобраны условия для генотипирования крупного рогатого скота черно-пестрой голштинизированной породы по локусам микросателлитов, рекомендованным ISAG для исключения ошибок происхождения у крупного рогатого скота. Подбор выполнялся на основании данных фирмы «Прикладные биосистемы» (www.appliedbiosystems.com), которая по согласованию с Food and Agricultural Organization (FAO) и International Society of Animal Genetics (ISAG) для крупного рогатого скота разработала тест-систему для генотипирования 11 динуклеотидных микросателлитов (TGLA227, BM2113, TGLA53, ETH10, SPS115, TGLA126, TGLA122, INRA23, ETH3, ETH225, BM1824). У исследованной группы (10 голов) голштинизированного крупного рогатого скота не выявлено полиморфизма по локусам BM1824 (присутствовал аллель длиной в 188 нуклеотидов), ETH10 (аллель длиной в 219 нуклеотидов), TGLA122 (аллель 143 нуклеотида), TGLA227 (аллель 97 нуклеотидов), BM2113 (аллель длиной в 135 нуклеотидов), TGLA126 (аллель длиной в 117 нуклеотидов), SPS115 (аллель длиной в 248 нуклеотидов). Только по двум микросателлитам был обнаружен полиморфизм – два аллеля по локусу INRA023, длиной в 206 и 214 пар нуклеотидов, и по локусу ETH225, длиной в 148 и в 150 пар нуклеотидов.
Интегральная оценка геномной нестабильности с использованием цитогенетических характеристик соматических клеток крупного рогатого скота
Генотоксические эффекты и породная принадлежность. Для оценки геномной нестабильности или генотоксичности какого-либо воздействия традиционно используют подсчет генных мутаций, хромосомных аберраций и микроядерный тест [5]. Однако накопленные данные наглядно свидетельствуют о широкой индивидуальной изменчивости как спонтанных частот встречаемости цитогенетических аномалий, так и их изменений в ответ на генотоксические воздействия. Так, например, у человека описано наличие годовой и сезонной изменчивости частот встречаемости цитогенетических аномалий в клетках периферической крови [120]. Обнаружено также, что клеточные популяции, полученные от одного донора, могут существенно отличаться друг от друга по чувствительности к ионизирующему облучению [119]. По-видимому, сложная зависимость различных типов мутаций от различных внутренних и внешних факторов приводит к традиционной дискуссионности результатов таких оценок.
Учитывая высокую зататность современных биотехнологий и скорость развития международных рынков сбыта их конечной продукции, оценки геномной нестабильности используемых в них клеточных популяций и животных сельскохозяйственных видов, становится все более и более актуальными. Особую важность оценка дестабилизации генетического материала имеет при решении вопросов репродукции животных сельскохозяйственных видов с применением и искусственного осеменения, экстракорпоральных технологий, эмбриотрансплантаций в связи с их очевидной экономической значимостью. Так, в частности, обнаружено, что высокая частота встречаемости цитогенетических аномалий в клетках периферической крови статистически достоверно коррелирует с количеством аномальных сперматозоидов у крупного рогатого скота и, таким образом, может служить показателем вероятности снижения репродуктивной функции животных [361]. Такие же взаимосвязи выявлены и у человека [310].
Для того, чтобы оценить индивидуальную изменчивость по частотам встречаемости различных цитогенетических аномалий у крупного рогатого скота, а также их возможную связь с генотоксическими эффектами низкодозового ионизирующего излучения, в настоящей работе выполнен сравнительный анализ клеток периферической крови группы черно-пестрого голштинизированного скота хозяйства «Куповатое» (30-км зона Чернобыльской АЭС) и группы салерсов (агроколледж «Пущино»). Исследования выполнялись с использованием архива цитогенетических препаратов, созданных из краткосрочных культур периферической крови разных групп крупного рогатого скота. В анализ вошли образцы крови 6 коров 2-5 летнего возраста черно-пестрого голштинизированного скота, содержавшегося в условиях хозяйства «Куповатое» (30-км зона Чернобыльской АЭС), в котором уровень загрязненности почв, по данным И.В.Чижевского [113], достигал по 90Sr и 137Cs, соответственно, 76,4±±16,3 и 266,1±±70,3 кБк/м2. По данным этого же автора, поглощенная доза у этих животных в среднем не превышала 0,2 Гр/год, что соответствует представлениям о низкодозовом диапазоне ионизирующего облучения [6]. Образцы крови 6 коров (2-4 летнего возраста) породы салерс были взяты у животных, содержавшихся в экспериментальном хозяйстве агроколледжа «Пущино» Московской области.
Среди метафазных пластинок оценивали частоты встречаемости метафаз с ассоциациями хромосом по центромерным районам по типу робертсоновских транслокаций; хромосомными аберрациями (хромосомные, хроматидные разрывы; кольцевые хромосомы, фрагменты); асинхронным расщеплением центромерных районов хромосом; доли полиплоидных и анеуплоидных клеток. Рассчитывали два типа анеуплоидии: АI и AII. АI - доля клеток с числом хромосом от 53 до 63. Очевидно, что в изменчивость данной характеристики существенный вклад могут вносить особенности гипотонической обработки клеток и изменчивость стабильности их плазматических мембран. Ко второму типу анеуплоидии (АII) относили метафазы, в которых число хромосом было или 59, или 61 (то есть 2n±1). Этот тип анеуплоидии с относительно большей вероятностью может быть связан с нарушениями расхождения хромосом в митозе, чем при АI. Количество двуядерных лимфоцитов (ДЯ) (Приложение 1) и одноядерных лимфоцитов с микроядрами (МЯ) (Приложение 2) подсчитывали на тех же препаратах в клетках с сохраненной цитоплазмой. Количество митозов (митотический индекс - МИ), частоты встречаемости ДЯ, МЯ рассчитывали в 3000 клеток и выражали в промилях (, на 1000 клеток). В клетках периферической крови групп крупного рогатого скота подсчитаны частоты встречаемости метафазных пластинок с различными типами цитогенетических аномалий – хромосомных аберраций (ХА), полиплоидов (ПП), анеуплоидов (двух типов – АI и АII, 2n± 10 хромосом и 2n±1), с межхромосомными слияниями по перицентромерным районам по типу робертсоновских транслокаций (РБ), а также с асинхронностью расщепления центромерных районов хромосом в конце метафазы (АРЦХ). Полученные данные представлены в табл. 3.2.1.
Сравнительный анализ частот встречаемости анеуплоидов (АІ – 2n± 10; АІI – 2n±1), полиплоидов, метафаз с межхромосомными ассоциациями по типу робертсоновских транслокаций (РБ), хромосомных аберраций (ХА), асинхронностью расщепления центромерных районов хромосом (АРЦХ) в клетках периферической крови черно-пестрого голштинизированного скота (хозяйство «Куповатое») и салерсов (Пущино, Московская обл.). Кол-во животных Кол-во метафаз АІ АІІ ПП частота встречаемостиметафаз (в %)
У черно-пестрых животных статистически достоверно выше (P 0,05) были частоты встречаемости анеуплоидных клеток (АI и АII), но различия по остальным показателям были статистически недостоверны, хотя наблюдается определенная тенденция к более высоким значениям частот встречаемости метафаз с ХА, ПП, АРЦХ. Частоты ХА близки к наблюдавшимся у крупного рогатого скота при их содержании в условиях индустриального загрязнения [333]. Следует отметить также, что в ряде исследований высказываются предположения о том, что АРЦХ тесно связано с механизмами формирования анеуплоидных клеток [1, 11, 12, 415]. В этих же препаратах были оценены частоты встречаемости двуядерных (ДЯ), одноядерных клеток с микроядрами (МЯ), митозов (МИ) и апоптозов (табл. 3.2.2). Обнаружено, что у черно-пестрого голштинизированного скота статистически достоверно (P 0,01) выше частота встречаемости МЯ, но ниже (P 0,05) – доля апоптозных клеток, чем у салерсов. Можно было бы ожидать, что полученные данные свидетельствуют о том, что относительно повышенная частота встречаемости цитогенетических аномалий в клетках периферической крови у черно-пестрого скота являются следствием низкодозового ионизирующего облучения, которым подвергались животные в условиях хозяйства «Куповатое» на границе зоны отчуждения Чернобыльской АЭС.
Похожие диссертации на Клеточные и геномные технологии в повышении эффективности животноводства
