Введение к работе
1.1. Актуальность темы. Обеспечение населения России продовольствием и биологическая защита людей и животных в стране являются основной задачей АПК на современном этапе, что делает актуальными научные исследования в области биотехнологии, направленные на решение этих проблем.
В настоящее время техническая микробиология является активно развивающимся научным направлением, использующим биотехнологические процессы при разработке и производстве широкого спектра биопрепаратов (вакцин, сывороток, диагностикумов, пробиотиков), биологически активных веществ (ферментов, антибиотиков, пребиотиков и др.), добавок к кормам (белков и аминокислот). Их применение в животноводстве и птицеводстве способствует повышению продуктивности животных и птицы, обеспечению ветеринарного благополучия хозяйств, гарантии качества, биологической и экологической безопасности как самой продукции, так и процесса ее производства.
Вступление России в ВТО повышает требования к конкурентоспособности отечественной продукции, что делает необходимым реконструкцию (реинжиринг) производств многих предприятий биологической, химической и пищевой промышленности и разработку новых или усовершенствование традиционных промышленных технологий производства препаратов.
Основы разработки, оптимизации, моделирования технологий микробиологических производств и процессов микробиологического синтеза отражены в работах В.М. Кантере, В.В. Бирюкова, И.М. Грачевой, Ю.П. Грачева (1979 – 1990 г.г.). Эти разработки актуальны и для предприятий, выпускающих лекарственные средства для животных, в том числе и иммунобиологические препараты, с точки зрения обеспечения их безопасности и качества.
Исследования по разработке управляемых режимов культивирования вакцинных штаммов микроорганизмов и режимов сублимационного высушивания проводили А.Я. Самуйленко, Б.А. Никаноров, Е.А. Рубан, А.А. Раевский, М.Я. Ярцев, Э.Ф. Токарик, А.А. Нежута и др. Технология промышленного производства вакцин для ветеринарии с использованием глубинного культивирования микроорганизмов была разработана Н.Д. Скичко, А.Я. Самуйленко, Н.В. Мельником, В.С. Павленко (1980 - 1990гг.).
В настоящее время в области разработки новых и усовершенствования существующих промышленных технологий производства сухих живых бактериальных препаратов не существует единого методологического подхода, основанного на использовании методов системного анализа.
Традиционные технологии разработаны на основе эмпирических подходов и зачастую не удовлетворяют современным национальным и международным требованиям, предъявляемым к технико-технологическим характеристикам (ТТХ) производства и обеспечивающим качество продукции. Поэтому остается много нерешенных технических и технологических проблем совершенствования существующих и создания новых технологий промышленного производства бактерийных препаратов.
Одними из самых сложных объектов с точки зрения технологии изготовления являются вакцины против листериоза и сальмонеллеза. Актуальность производства и применения этих вакцин обусловлена тем, что листериоз и сальмонеллез являются широко распространенными инфекционными болезнями, наносящими значительный ущерб животноводству и представляющими серьезную угрозу здоровью людей. Важное место в борьбе с листериозом и сальмонеллезом занимает специфическая профилактика с помощью инактивированных и живых вакцин. С этой целью наиболее эффективны живые вакцины, изготовленные из авирулентных штаммов бактерий.
Экономический ущерб от листериоза связан с большой летальностью, снижением продуктивности животных (овцы, свиньи и крупный рогатый скот), абортами, а также затратами на ветеринарно-санитарные ограничительные мероприятия. Летальность при нервных формах листериоза может достигать 98 – 100 %, а при септических – 50 %. Листериоз животных зарегистрирован в 82 странах мира, в том числе и в РФ.
Работы видных российских ученых И.А. Бакулова, А.Н. Панина, В.И. Белоусова, В.М. Котлярова, А.Г. Гаврилова, С.П. Карпова, В.Л. Адамовича и др.(1961 -2008 г.г.) посвящены изучению биологии возбудителя листериоза, путей выделения листерий во внешнюю среду, способов заражения, эпизоотологии заболевания, иммунитета, изысканию высокоэффективных средств профилактики заболевания и разработке технологии производства вакцин.
Семейство энтеробактерий объединяет обширную группу грамотрицательных бактерий, к которым относятся роды Escherichia, Edwardsiella, Citrobacter, Salmonella, Shigella и др. Сальмонеллы патогенны для животных многих видов, наиболее часто сальмонеллезы регистрируют у свиней и птиц. Сальмонеллезы имеют большое эпидемиологическое и эпизоотологическое значение. Возбудителями, в основном, являются S. choleraesuis, S. enteritidis, S. typhimurium, S. typhisuis, значительно реже обнаруживают S. gleser, S. dublin, S. voldagsen.
Первая вакцина против сальмонеллеза поросят в нашей стране была изготовлена М.М. Ивановым (1948), против сальмонеллеза телят - А.Г. Малявиным и И.И. Архангельским (1950-1960), усовершенствованием технологии производства вакцин во ВНИИТИБП и на Щелковском биокомбинате занимались Н.Д. Скичко, Н.В. Мельник, А.А. Раевский, Е.Э. Школьников и др.
Группа бактерий, включенная в род Escherichia, насчитывает большое число разновидностей, отличающихся между собой по ферментативным и серологическим свойствам, подвижности, по чувствительности к бактериофагам и колицинам, по степени антагонистической активности и патогенности. Непатогенные виды колибактерий традиционно используются для изготовления пробиотических препаратов (А.Н Панин, 2008; А.Я. Самуйленко, 2010; Н.И. Малик, 2009; В.И. Еремец, 2008 с соавт.).
Симбиоз животных и полезных микроорганизмов играет важную роль в нормальном функционировании организма животных и птицы, а так же реализации их генетического потенциала продуктивности. В настоящее время активно развивается использование симбиотиков не только как антагонистов патогенной микрофлоры, но и как продуцента лизина - незаменимой аминокислоты, которая входит в состав структурных тканевых белков и белковых ферментов, является важным фактором биологически полноценного кормления, способствует улучшению пищеварения, играет важную роль в формировании костяка, повышении продуктивности сельскохозяйственных моногастричных животных (птицы и свиней). Такие симбиотики используются в качестве альтернативы дорогостоящему синтетическому лизину (моногидрохлорид лизина), в основном, импортного производства. Поэтому разработка новых препаратов такой группы и технологии их производства является актуальной проблемой. Начало решения этого вопроса было заложено Л.К. Эрнстом (1985, 2007), В.И. Фисининым (2007), А.Я. Самуйленко (2007), А.А. Раевским (2007), А.А. Нежутой (2009), И.И. Чеботаревым (2007), Е.Э. Школьниковым (2007) и др.
В связи с вышеизложенным, научно обоснованное решение проблемы совершенствования технологий промышленного производства бактерийных препаратов и до настоящего времени является актуальной задачей, имеющей практическую ценность.
1.2. Цель и задачи исследований. Цель работы – усовершенствовать промышленную биотехнологию производства сухих живых бактериальных препаратов и оценить эффективность их применения в АПК РФ на моделях сухих вакцин против листериоза, сальмонеллеза и симбиотического препарата (продуцента лизина).
В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:
1. научно обосновать и разработать алгоритм усовершенствования промышленной технологии изготовления сухих бактериальных препаратов;
2. усовершенствовать промышленную технологию производства сухих вакцин против листериоза и сальмонеллеза, согласно разработанного алгоритма: оптимизировать составы питательных сред на основе перевара Хоттингера для глубинного управляемого процесса культивирования бактерий; оптимизировать управляемый процесс глубинного культивирования листерий и сальмонелл; оптимизировать защитные среды высушивания, используемые при изготовлении сухих вакцин против листериоза и сальмонеллеза.
3. усовершенствовать технологию производства симбиотического препарата «Пролизэр» на основе E.coli по разработанному алгоритму: оптимизация состава питательной среды на основе перевара Хоттингера для глубинного управляемого процесса культивирования E.coli; концентрирование бактериальной массы E.coli; оптимизация защитной среды высушивания, используемой при изготовление симбиотического препарата на основе E.coli; провести доклинические испытания;
4. изготовить опытно-промышленные образцы препаратов;
5. определить их эффективность применения в бройлерном птицеводстве и животноводстве;
6. разработать нормативную документацию на препараты и освоить их промышленный выпуск.
1.3. Научная новизна. Разработан единый подход к усовершенствованию промышленной биотехнологии производства сухих живых бактериальных препаратов. Научно обоснован алгоритм разработки и совершенствования промышленной биотехнологии производства сухих живых бактериальных препаратов. Эффективность его использования экспериментально подтверждена на сложных биотехнологических моделях. Применение математических методов планирования эксперимента позволило определить оптимальные, с точки зрения накопления листерий, сальмонелл и эшерихий, значения концентраций компонентов питательных сред и параметры управляемого режима культивирования бактерий, оптимизировать состав защитных сред для сублимационного высушивания. С использованием разработанного алгоритма усовершенствована технология промышленного производства вакцин против листериоза (патент РФ № 2053790 от 10.02.96 г., в соавторстве), сальмонеллеза сельскохозяйственных животных (патент РФ № 2129016 от 01.10.96 г., в соавторстве) и симбиотического препарата «Пролизэр» (патент RU № 2450051 от 18.08.2010 г., в соавторстве).
Определены эффективные дозы симбиотика для применения в бройлерном птицеводстве и свиноводстве, разработан способ применения симбиотического препарата «Пролизэр» на основе штамма E. coli для бройлеров высокопродуктивных кроссов (положительное решение о выдаче патента по заявке № 2012105907RU от 21.02.2012 г.).
1.4. Практическая ценность работы. Использование предложенного алгоритма позволяет разрабатывать и совершенствовать технологию промышленного производства сухих бактерийных препаратов. Использование алгоритма в научных экспериментах и практике позволяет снизить количество опытов, затрат на эксперименты, что ведет к снижению себестоимости разработки технологических процессов и технологии в целом.
По усовершенствованной технологии на Ставропольской биофабрике изготовлены опытно-промышленные серии вакцины против листериоза, которые испытаны в хозяйствах Ставропольского края, ранее неблагополучных по листериозу, на овцепоголовье (16034 голов). Случаев заболевания листериозом, иммунизированных данной вакциной и поствакцинальных осложнений, не наблюдалось.
По разработанной технологии изготовлены опытно-промышленные серии вакцины против сальмонеллеза животных на Сумской и Ставропольской биофабриках. Вакцины успешно прошли испытания в свиноводческих хозяйствах Костромской области, в течение 6 месяцев случаев заболевания поросят, иммунизированных данной вакциной и поствакцинальных осложнений не зафиксировано.
Промышленный выпуск вакцин на ФГУП Ставропольской биофабрике по усовершенствованной технологии за 2008 – 2012 гг. составил: против листериоза 4115624 дозы, против сальмонеллеза – 15848360 доз и на ФГУП Щелковский биокомбинат против сальмонеллеза - 5 млн. 440 тыс. доз.
Оптимизация технологических этапов производства симбиотического препарата «Пролизэр» позволила сократить время культивирования E. coli, повысить накопление жизнеспособных клеток, стабильность биологических свойств препарата и сохраняемость его в процессе длительного хранения.
По данной технологии изготовлено 58 серий симбиотического препарата. В производственных испытаниях подтверждена их безопасность и эффективность. В хозяйствах проведено 19 испытаний на цыплятах-бройлерах высокопродуктивных кроссов и поросятах.
Использование симбиотического препарата при выпаивании бройлерам и даче свиньям с кормом позволяет полностью заменить использование синтетического лизина, увеличить усвояемость корма, что ведет к снижению его потребности на весь цикл выращивания, повысить продуктивность выращиваемых животных и птицы, увеличить среднесуточный привес бройлеров и поросят послеотъемного периода, а также повысить выход мяса 1-й категории и снизить выход мяса на промышленную переработку.
Применение симбиотического препарата при выращивании бройлеров и свиней позволило получить экономический эффект:
- дополнительная прибыль от применения симбиотика на цыплятах-бройлерах кросса «Смена-7» в расчете на 1000 цыплят-бройлеров составила 652,83 рублей, а экономический эффект в расчете на 1000 цыплят-бройлеров составил 8765,25 рублей.
- дополнительная прибыль от применения симбиотика на поросятах послеотъемного периода в расчете на 1000 поросят составила 446620,0 рублей, а экономический эффект в расчете на 1000 поросят послеотъемного периода составил 1271400,0 руб.
Результаты исследований включены в 7 методических положений, утвержденных на секции «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии академиком-секретарем А.М. Смирновым.
Результаты исследования и методология может быть использована разработчиками и производителями лекарственных средств для ветеринарии, а так же в качестве учебного пособия студентов - биотехнологов.
Результаты работы легли в основу для разработанной во ВНИТИБП «Концепции научного обеспечения создания и развития региональных биологических предприятий по производству препаратов для защиты животных, растений и средств, повышающих эффективность функционирования агропромышленного комплекса Российской Федерации» и одобренной Президиумом Россельхозакадемии, протокол №4 от 21.04.2011г.
1.5. Основные положения диссертационной работы, которые выносятся на защиту
1. Алгоритм усовершенствования промышленной технологии получения сухих живых бактериальных препаратов.
2. Усовершенствованные технологии получения сухих вакцин против листериоза и сальмонеллеза, согласно разработанного алгоритма:
2.1. Оптимизированные составы питательных сред для глубинного управляемого процесса культивирования листерий и сальмонелл;
2.2. Оптимизированные управляемые процессы глубинного культивирования листерий и сальмонелл;
2.3. Оптимизированные защитные среды высушивания, используемые при изготовлении сухих живых вакцин против листериоза и сальмонеллеза.
3. Оптимизированная промышленная технология получения симбиотического препарата на основе E.coli:
3.1. Оптимизированный состав питательной среды для глубинного управляемого процесса культивирования E.coli;
3.2. Режим концентрирования бактериальной массы E.coli;
3.3. Оптимизированная защитная среда высушивания, используемая при изготовление симбиотического препарата на основе E.coli;
3.4. Эффективность применения симбиотического препарата на основе E.coli при выращивании бройлеров и свиней.
1.6. Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены:
- в виде ежегодных отчетов по темам государственных заданий на заседаниях ученого совета и методической комиссии ГНУ ВНИТИБП РАСХН (1992 - 2012 гг.);
- на секции «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (2009-2012 гг.);
- на Международных конгрессах («Биотехнология-2010, 2011», Москва, 2010, 2011 гг.);
- на Всероссийских и Международных конференциях, проводившихся в Москве, Санкт-Петербурге, Омске, Краснодаре, Курске, Сергиевом Посаде, Покрове, Омске, Тюмени, Щелково, Харькове, Ялте, Минске, Витебске, Алматы (1992 – 2012 гг.).
Разработки удостоены: золотой медали и Диплома I степени Международной выставки «Лаборатория Экспо», Москва (2010 г.); золотой медали и Диплома I степени Российской агропромышленной выставки «Золотая осень», Москва (2011 г.); персонального диплома Российской агропромышленной выставки «Золотая осень», Москва (2011 г.); медали «Лауреат ВВЦ» (2011 г.); золотой медали выставки-конференции «Биоиндустрия 2012», Санкт-Петербург (2012 г); серебряной медали Российской агропромышленной выставки «Золотая осень», Москва (2012 г.), за монографию «Энтеробактерии в животноводстве».
1.7. Публикации. Основные положения диссертационной работы опубликованы в 57 научных работах, в том числе в 1 монографии и 25 статьях в изданиях по перечню, рекомендованному ВАК Минобрнауки России для публикации материалов докторских диссертаций. По результатам исследований получено 4 Патента РФ.
1.8. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 471 страницах машинописного текста и состоит из введения; обзора литературы; собственных исследований, включающих материалы и методы, результаты исследований; обсуждения результатов; выводов; практических предложений; списка литературы и приложения. Диссертация иллюстрирована 66 таблицами и 30 рисунками. Список литературы включает 411 источников, из которых 302 отечественных и 109 зарубежных авторов. В приложении представлены таблицы расчетов коэффициентов уравнений, копии документов, подтверждающих достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость.
1.9. Личный вклад автора заключается в формулировании проблемы, постановке цели и задач исследований, методологическом обосновании путей решения поставленных задач, непосредственном планировании экспериментов и выполнении исследований, обобщении и интерпретации результатов, разработке нормативной документации. Автор принимал личное участие в изготовлении и контроле опытных серий препаратов, в подготовке научных публикаций и разработке нормативных и методических документов.
1.10 Благодарности. Автор выражает благодарность научному консультанту, директору ВНИТИБП, академику РАСХН, академику НААН Украины А.Я. Самуйленко. В выполнении некоторых разделов диссертации принимали участие и оказывали практическую и консультативную помощь сотрудники института Е.Э. Школьников, В.И. Еремец, А.А. Раевский, Т.А. Скотникова, Л.Б. Соловьев, Л.В. Анисимова, Л.А. Коротеева, Н.Д. Скичко, А.А. Нежута, Л.А. Неминущая, Е.П. Сапегина, а также И.И. Чеботарев ООО «Биореактор», сотрудники ВНИТИП: И.А. Егоров, Е.Н. Андрианова, И.П. Салеева и сотрудник «Института экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского» (Беларусь, г. Минск) П.А. Красочко - за что выражаю им сердечную благодарность.
