Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Этапы развития цитогенетики человека 11
1.2. Хромосомные аберрации 12
1.2.1. Численные хромосомные аберрации 13
1.2.2. Структурные хромосомные аберрации 14
1.3. Методы цитогенетического анализа 21
1. 3.1. Методы дифференциального окрашивания хромосом 21
1.3.2. Метод in situ гибридизации нуклеиновых кислот 26
1.3.2.1. ДНК-пробы, используемые в гибридизации in situ 27
1.3.2.2. Супрессионная гибридизация in situ и обратный пэйнтинг 28
1.3.2.3. Интерфазный FISH-анал из 29
1.3.2.4. Многоцветная in situ гибридизация 30
1.3.2.4.1. M-FISH 31
1.3.2.4.2. Спектральное кариотипирование (SKY- Spectral Karyotyping) 31
1.3.2.4.3. RxFISH 32
1.3.2.4.4. Многоцветный бэндинг индивидуальных хромосом (МСВ -Multi Color Banding) 33
1.3.2.5. Сравнительная геномная гибридизация 34
1.3.2.6. Методы идентификации маркерных хромосом 35
1.3.2.6.1. AcroM-FISH 35
1.3.2.6.2. SubcenM-FISH 36
1.3.2.6.3. CenM-FISH 37
1.3.2.7. Методы пренатальной цитогенетической диагностики 38
1.4. Сравнение возможностей использования различных методов цитогенетического анализа для целей диагностики хромосомной патологии человека 40
Глава 2. Материал и методы 41
2.1. Получение препаратов метафазных хромосом 42
2.1.1. Культивирование лейкоцитов периферической крови 42
2.1.2. Фиксация митотических клеток 42
2.1.3. Приготовление препаратов метафазных хромосом для GTG-окрашивания .43
2.1.4. Приготовление препаратов метафазных хромосом для FISH 43
2.1.5. Приготовление препаратов метафазных хромосом для микродиссекции 44
2.2. GTG-дифференциальное окрашивание метафазных хромосом 44
2.3.Микродиссекция метафазных хромосом 44
2.3.1. Подготовка микропипеток и игл для микродиссекции 44
2.3.2. Проведение микродиссекции хромосом 44
2.4. Полимеразная цепная реакция с частично вырожденным праймером (degenerate oligonucleotide primer polymerase chain reaction - DOP-PCR) 45
2.5. Мечение ДНК микродиссекционных ДНК - библиотек 46
2.6. Получение Cot-2 ДНК из плаценты человека 46
2.7. Супрессионная in situ гибридизация 47
2.8. Детекция на цитологических препаратах меченых ДНК-проб 48
2.8.1. Детекция на цитологических препаратах биотин-16-дУТФ меченых ДНК-проб 48
2.8.2. Выявление ДНК-проб, меченых дигоксигенин-11-дУТФ 49
2.9. Создание ДНК*пробы, специфичной теломерным повторам всех хромосом человека методом ПЦР 49
2.10. Получение ДНК-пробы, специфичной ядрышкообразующим районам всех хромосом человека 50
2.11. Получение ДНК-пробы, гомологичной Alu повтору, с помощью ПЦР 50
2.12. Получение ДНК-проб, специфичных эухроматиновому материалу хромосом, методом Inter-Alu ПЦР 51
2.13. Одновременное выявление двух гаптен-меченых ДНК-проб 52
2.14. Многоцветный бэндинг хромосом 52
2.15. Микроскопический анализ препаратов метафазных хромосом 52
Глава 3. Результаты и обсуждение 53
3.1. Первичный цитогенетический анализ хромосомных аномалий 53
3.2. Анализ маркерных хромосом с помощью молекулярно-цитогенетических методов 72
3.2.1. Анализ организации маркерных хромосом (MX) микродиссекцией и in situ гибридизацией ДНК-проб, специфичных MX, а также in situ гибридизацией с ДНК-пробами, специфичными теломерным повторам и рибосомальной ДНК 73
3.2.2. Детекция эухроматиновых районов хромосом человека 79
3.2.2Л. ДНК-пробы для выявления эухроматиновых районов 80
3.2.2.2. Распределение Alu и LINE1 повторенных последовательностей ДНК в хромосомах человека 83
3.2.2.3. ДНК-пробы, основанные на повторенных диспергированных последовательностях 84
3.2.2.4. FISH с метафазными хромосомами человека меченного Alu повтора и продукта Inter-Alu-PCR 85
3.2.2.5. FISH IAP- и Alu-ДНК-проб с MX человека 86
3.3. Анализ делеций с помощью методов микродиссекции и обратного пэйнтинга. 90
3.4. Анализ транслокаций молекулярно-цитогенетическими методами 93
3.4.1. Анализ хромосомных транслокаций с помощью гибридизации с хромосомоспецифичными зондами 93
3.4.2. Анализ хромосомных транслокаций методами микродиссекции и обратного пэйнтинга 95
3.5. Анализ инверсии хромосомы 7 с помощью многоцветного бэндинга 106
Глава 4. Заключение 108
Выводы 111
Список литературы 113
- Структурные хромосомные аберрации
- Многоцветный бэндинг индивидуальных хромосом (МСВ -Multi Color Banding)
- Приготовление препаратов метафазных хромосом для FISH
- Анализ организации маркерных хромосом (MX) микродиссекцией и in situ гибридизацией ДНК-проб, специфичных MX, а также in situ гибридизацией с ДНК-пробами, специфичными теломерным повторам и рибосомальной ДНК
Введение к работе
Актуальность проблемы. Своевременное проведение хромосомного анализа имеет большое значение для выявления причин возникновения и прогнозирования многих наследственных и врожденных пороков развития. В России в практическом здравоохранении исследования кариотипа проводятся с 1966 года. В лабораториях медицинской цитогенетики для анализа хромосомных аномалий используются классические методы цитогенетического анализа, базирующиеся на дифференциальном окрашивании хромосом. Эти методы позволяют выявлять все численные нарушения и значительную часть структурных хромосомных перестроек, таких как транслокации, инверсии, делеции, а также присутствие в клетках пациентов малых сверхчисленных маркерных хромосом. Однако в ряде случаев разрешающей способности этих методов оказывается недостаточно для успешного проведения диагностики хромосомных аномалий, например, для идентификации метариала малых сверхчисленных маркерных хромосом, для точного определения границ точек разрывов при инверсиях и транслокациях, для определения происхождения дополнительного хромосомного материала при несбалансированных транслокациях. При выявлении подобных случаев сложной хромосомной патологии необходима их передача в специализированные федеральные центры, которые используют молекулярно-цитогенетические методы для уточнения диагноза. Следует отметить, что точный цитогенетический диагноз необходим врачу-генетику для составления правильного медико-генетического прогноза. Современные методы молекулярной цитогенетики позволяют точно описать практически любую хромосомную перестройку. Однако полное и надежное описание хромосомных аномалий может быть получено только при комплексном использовании целого ряда таких методов. Поэтому перед исследователем постоянно стоит вопрос о выборе оптимальной стратегии проведения молекулярной диагностики, а также о ее стоимости. В связи с этим, существует потребность в разработке новых, более дешевых и общедоступных методов молекулярно-цитогенетического анализа. Исследование хромосомных аберраций классическими и молекулярно-цитогенетическими методами в сочетании с подробным описанием клинической картины пациентов дадут возможность более детального изучения известных и описания новых
хромосомных синдромов, что необходимо для эффективного медико-генетического консультирования.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлась разработка и адаптация новых методов молекулярно-цитогенетического анализа хромосомных аберраций и отработка системы взаимодействия обычных диагностических лабораторий с исследовательскими лабораториями для повышения точности и надежности описания хромосомных аномалий при проведении клинической диагностики.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
Выявить среди пациентов со структурными хромосомными аномалиями случаи, которые не могли быть однозначно описаны с помощью методов дифференциального окрашивания хромосом и определить частоту данных случаев, требующих уточнения диагноза молекулярно-цитогенетическими методами.
Провести анализ сложных случаев хромосомной патологии с помощью комплекса молекулярно-цитогенетических методов.
Оценить возможности и ограничения использования различных методов диагностики хромосомных аберраций.
Разработать и апробировать новый метод оценки клинического значения сверхчисленных маркерных хромосом человека.
Оценить эффективность проведения комплексного цитогенетического анализа с использованием различных методов диагностики хромосомных аномалий.
Научная новизна и практическая ценность, В проведенном исследовании предложен и использован новый метод оценки возможного клинического значения сверхчисленных маркерных хромосом. Выявлен и детально описан ряд хромосомных аберраций, в том числе уникальных, не имеющих аналогов в литературе. Определена доля пациентов, имеющих структурные аберрации хромосом и нуждающихся в уточнении диагноза молекулярно-цитогенетическими методами. Предложена и отработана схема эффективного взаимодействия клинических и исследовательских лабораторий при проведении детального анализа хромосомных аномалий. Результаты настоящего исследования используются в медико-генетическом консультировании, пренатальной диагностике. Материалы
работы используются в педагогическом процессе в Новосибирской государственной медицинской академии при подготовке и переподготовке врачей различных специальностей и студентов.
Апробация работы. Результаты данного исследования были доложены на следующих конференциях:
Конференция «Генетика человека и патология» (19-21 ноября 2002 г., Томск)
Конференция «Наследственные болезни и патология человека» (23 октября 2003 г., Новосибирск)
Всероссийская научно-практическая конференция «Современные достижения клинической генетики» (25-27 ноября 2003 г., Москва)
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 9 работ:
1. Карамышева Т.В., Матвеева В.Г., Саблина О.В., Сосницкая СВ., Гайнер
Т.А, Рубцов Н.Б. Микродиссекционные технологии в диагностике врожденных
аномалий хромосом человека: опыт медицинских и научно- исследовательских
учреждений. // Материалы научного совета Подпрограммы "Геном человека",
сборник отчетов за 2000 год. Москва 2001. С.97.
2. Н.Б.Рубцов, Т.В. Карамышева, В.Г.Матвеева, О.В.Саблина,
С.В.Сосницкая, О.В.Андреенкова, Т.А. Гайнер, М.М.Дегтярева. Обратная IN SITU
гибридизация ДНК-зондов аномальных хромосом в диагностике хромосомных
патологий. // Генетика. 2001. Т.37. С.1545-1552.
3. Н.Б.Рубцов, Т.В .Карамышева, Т.А.Гайнер. Молекулярно-
цитогенетическая диагностика хромосомных патологий человека: возможности и
перспективы, // "Генетика человека и патология", Сборник научных трудов,
Выпуск 6, Российская Академия Медицинских Наук, Сибирское Отделение,
Томский Научный Центр, НИИ Медицинской Генетики, 2002. С.157-164.
Рубцов Н.Б., Карамышева Т.В., Гайнер Т.А. Сверхчисленные маркерные хромосомы. // Медицинская генетика. 2003. №6. С.248-258.
Гайнер Т.А., Карамышева Т.В., Матвеева В.Г., Рубцов Н.Б. Молекулярно-цитогенетическая диагностика врожденных хромосомных патологий // Современные диагностические технологии на службе здравоохранения: Сборник
научных трудов. Под ред. В.Г. Колоколова, П.Г. Малькова, П.И. Заварзина. Омск: ГУЗ «Омский диагностический центр». 2003. С. 317-318.
Гайнер Т.А., Карамышева Т.В., Рубцов Н.Б., Матвеева В.Г. Диагностика хромосомной патологии: эффективность и возможности ее повышения. // Сборник "Наследственные болезни и патология человека" Новосибирск. 2003. С. 27.
Карамышева Т.В., Гайнер Т.А., Матвеева В.Г., Рубцов Н.Б. Диагностика малых сверхчисленных маркерных хромосом человека. // Сборник "Наследственные болезни и патология человека" Новосибирск. 2003. С. 27.
Рубцов Н.Б., Карамышева Т.В., Гайнер Т.А., Шкляева О.А. Анализ маркерных хромосом: ДНК пробы для оценки возможного клинического значения маркерной хромосомы. //Медицинская генетика. 2003. Т.2. №12. С.520-527.
Н.Б. Рубцов, Т.В. Карамышева, Т.А. Гайнер. "ГЛАВА 6. Современные методы молекулярно-цитогенетического анализа и диагностика хромосомных патологий" в книге "Геномика - медицине". Москва. 2005 г. "Академкнига". С. 219-
244.
Вклад автора. Автор работает врачом-лаборантом-генетиком цитогенетической лаборатории медико-генетического отдела (МГО) Государственного Новосибирского областного клинического диагностического центра (ГНОКДЦ). Ею лично с помощью методов дифференциального окрашивания проведен анализ хромосом пятнадцати из двадцати включенных в данную работу пациентов ГНОКДЦ. Автор принимала участие в планировании и проведении молекулярно-цитогенетических исследований, включая получение ДНК проб и FISH, в микроскопическом анализе результатов FISH и в обсуждении полученных результатов. Исследования проводились на базе цитогенетической лаборатории медико-генетического отдела ГНОКДЦ и лаборатории морфологии и функции клеточных структур Института цитологии и генетики СО РАН.
Структура и объем диссертации. Работа состоит следующих разделов: введение, обзор литературы, материал и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы и список литературы, включающий 141 ссылку. Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста, иллюстрирована 22 рисунками и содержит 1 таблицу.
Структурные хромосомные аберрации
Возникновению любой структурной хромосомной перестройки предшествует один или несколько хромосомных разрывов. Целостность разорванной хромосомы может восстанавливаться ферментами репарации (Natarajan, Zwanenburg, 1982). Если в q-плече акроцентрическоЙ хромосомы происходит разрыв, а затем дериват, содержащий центромеру, дуплицируется и инвертируется, это может приводить к образованию маркерной хромосомы особого типа, так называемой invdup. Ацентрический фрагмент, образовавшийся в результате такого разрыва, теряется при последующих делениях клетки. Если два разрыва происходят в пределах короткого отрезка времени и достаточно близко друг к другу, концы хромосомных фрагментов могут воссоединиться в точках разрыва других хромосом (гомологичных или негомологичных). Это может приводить к возникновению хромосомных перестроек различных типов. Среди структурных аномалий встречаются инверсии, делеции, транслокации, сверхчисленные маркерные хромосомы. Эти аберрации играют важную роль в этиологии наследственных заболеваний.
Инверсии - перестройки, связанные со сменой ориентации участка хромосомы на противоположную. Гетерозиготы по инверсии хромосомы 9 нередко встречаются в популяциях человека, их частота колеблется от I до 2,1 % (Toyota et. al., 2001; Kim et. al., 1999; Teo et. al., 1995). Тюрле с соавторами опубликовали данные цитогенетических исследований 413 спонтанных абортусов, по которым выявленная частота перицентрических инверсий в 36 раз выше частоты в соответствующих популяциях (Turleau et al., 1979), В ряде случаев инверсии не приводят к аномалиям развития. Самой распространенной является перицентрическая инверсия района прицентромерного гетерохроматина хромосомы 9. Долгое время считалось, что она не приводит к каким-либо нарушениям развития. Однако в последние годы появились сообщения о наличии сходных нарушений у носителей такой инверсии. У ряда носительниц перицентрической инверсии хромосомы 9 обнаружены отклонения развития, включающие низкий рост, короткую широкую шею, неразвитые молочные железы, аплазию матки, первичную аменорею. При этом у одного из родителей, имеющих нормальный фенотип, присутствовала сходная инверсия хромосомы 9 («Современные медицинские технологии», с.303).
Делеция - потеря участка хромосомы, приводящая к частичной моносомии по утерянному району. Характер делеции определяет тяжесть клинического проявления. Большое значение имеет, какие гены входят в потерянный участок. Точная локализация точки разрыва при анализе хромосомы с делецией имеет огромное диагностическое и прогностическое значение. У пациентов, имеющих делецию дистального района хромосомы 3 (Зр25—»pter), может наблюдаться как практически нормальное развитие, так и различные нарушения: умственная отсталость, задержка физического развития, микроцефалия, микрогнатия и другие отклонения развития (Philipps et al., 1994). Показано, что при сохранении в аномальной хромосоме 3 близко расположенных локусов D3S1585 и D3S1263 (район Зр25) делеция приводит лишь к несущественным отклонениям от нормального фенотипа. В случае делеции, затрагивающей дистальный, но не затрагивающей проксимальный локус, развиваются значительно более серьезные нарушения, включающие поражение сердечно-сосудистой системы, задержку умственного развития и ряд других аномалий (Drumheller et al., 1996). Особое место в ряду делений занимают микроделеции, которые были открыты в начале 80-х годов XX столетия. В 1980 году Бюлер с соавторами (Btlhler et al„ 1980) сообщили о ребенке с клиническими признаками синдрома Лангера-Гидеона, у которого была обнаружена терминальная делеция q-плеча хромосомы 8 (моносомия по району 8q24-qter). Позднее были описаны другие случаи развития этого синдрома при подобной моносомии (Wilson et al., 1981) и установлен критический сегмент - 8(q24.1), микроделеция которого приводит к развитию указанного синдрома. Так был открыт первый микроделеционный синдром у человека. К настоящему времени известно более десяти микроделеционных синдромов, обусловленных как терминальными, так и интерстициальными делениями разных хромосом. Среди них - del(5)(pl5pl5) (синдром кошачьего крика), del(15)(ql2ql2) (синдромы Прадера-Вилли и Энгельмана), del(17)(p!3.3pl3.3) (синдром Миллера-Диккера), del(22)(qll,2qll.2) (синдром ДиДжорджи) и другие. Фенотипические изменения, вызываемые микроделециями, обычно имеют комплексный характер и проявляются как синдромы множественных врожденных пороков развития и умственной отсталости. Многие дисморфические синдромы были клинически описаны задолго до выяснения их этиологии. Например, заболевание, известное как синдром ДиДжорджи, было впервые описано ДиДжорджи в 1968 году, тогда как микроделеция del(22)(qll.2qll.2) у больных с этим синдромом была открыта в 1991 году. А в 1997 году было обнаружено, что для развития данного синдрома достаточно делеции критического района протяженностью 1,5 Mb («Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике», 2003, с.29). Необходимо отметить, что для диагностики микроделеций необходимо использование современных молекулярно-цитогенетических методов анализа.
Транслокации представляют собой реципрокный обмен участками негомологичных хромосом. Как правило, выявление и идентификация сбалансированных транслокаций возможны с помощью методов дифференциального окрашивания хромосом. Более серьезную проблему для диагностики представляют собой несбалансированные транслокации (Schinzel, 1984). Если в транслокацию вовлечен небольшой хромосомный район (1-3 бэнда), идентификация такой транслокации классическими цитогенетическими методами затруднительна. Исключение составляют случаи, когда несбалансированная транслокация обнаруживается у ребенка, один из родителей которого является носителем сбалансированной транслокации. В этом случае, после анализа кариотипа родителей выясняется, какие именно районы вовлечены в хромосомную перестройку, выявленную у ребенка. Следует отметить, что локализация точек разрыва при несбалансированных транслокациях может иметь огромное значение. Известно, что для развития типичного синдрома может быть достаточно трисомии по небольшому хромосомному району. Например, трисомии по району 21q22 достаточно для развития у ее носителя синдрома Дауна (Ramser et. al., 2000).
Многоцветный бэндинг индивидуальных хромосом (МСВ -Multi Color Banding)
С возникновением цифровой записи микроизображений открылись широкие возможности их компьютерной обработки. В основе многоцветного бэндинга хромосом лежит принцип переведения в псевдоцвета соотношения интенсивностей флуорохромов. Данный метод предназначен для проведения детального анализа отдельной хромосомы (Chudoba et al., 1999a,b). Авторами метода был получен комплект микродиссекционных ДНК-проб, обеспечивающих необходимый профиль интенсивности сигнала в пределах хромосомного района, и разработано специальное программное обеспечение «MetaSystems isis mFISH» для сравнительного анализа уровня свечения различных флуорохромов (Chudoba et al., 1999b). Районоспецифичные ДНК-зонды метят различными флуорохромами. Уровень сигнала каждой из микродиссекционных районоспецифичных ДНК-библиотек варьирует по интенсивности, достигая максимума в центре и постепенно падая, практически до нуля, на его границах. Перекрывание профилей интенсивности сигналов ДНК-проб обеспечивает вариации соотношений интенсивностей флуоресценции различных флуорохромов вдоль хромосомы. Отношение интенсивностей переводится в термины псевдоцвета, и, соответственно, каждой точке изображения приписан свой псевдоцвет. В результате программной обработки изображения каждому из хромосомных районов соответствует свой псевдоцвет (Chudoba et al., 1999b),
Важным является тот факт, что число цветных бэндов при использовании МСВ не зависит от уровня конденсации хромосомы. Это открывает возможности проведения высокоразрешающего хромосомного анализа при окрашивании коротких сильно конденсированных хромосом. Данный вариант многоцветной FISH оказался высокоэффективным как при анализе межхромосомных, так и внутрихромосомных перестроек (Chudoba et al., 1999а). Однако, следует отметить, что исследователь должен предварительно определить хромосому, в детальном изучении которой он заинтересован. Для получения многоцветного бэндинга могут быть использованы, помимо микродиссекционных библиотек, комплекты YAC-ов, несущих фрагменты ДНК соответствующих хромосомных районов (Heller et al., 2000). При этом для получения МСВ индивидуальной хромосомы требуется несколько сот YAC-ов, а информативность полученного таким образом МСВ уступает МСВ, полученному с помощью 3-7 микродиссекционных ДНК-библиотек. Многоцветный бэндинг хромосом в последние годы широко используется как для анализа врожденных хромосомных патологий (Rubtsov et. al., 2000), так и для диагностики хромосомных аномалий, возникающих при онкологических заболеваниях (Chudoba et. al., 1999а).
Метод сравнительной геномной гибридизации (Comparative Genomic Hybridization - CGH) (Du Manoir et. al., 1993) основан на одновременной гибридизации in situ двух различно меченных геномных библиотек ДНК, одна из которых выделена из анализируемой, а другая - из нормальной ткани здорового донора. Полученные ДНК библиотеки метят различными репортерными молекулами. При проведении гибридизации анализируемая и стандартная ДНК смешиваются в отношении 1:1 и с добавлением избытка не меченной высокоповторяющейся C0tl ДНК наносятся на препараты с нормальными метафазными хромосомами. При нарушении в анализируемой ткани баланса хромосомных районов, в этих районах на препарате изменяется соотношение интенсивности сигналов ДНК-зондов из анализируемого и референтного обрзцов. При наличии делеции в анализируемом образце соотношение сигналов будет в пользу сигнала ДНК-зонда референтного образца, а при увеличении копийности какого-либо района будет наблюдаться обратная картина. CGH позволяет выявлять количественные нарушения представленности районов размером не менее 10 Mb. Поскольку данный метод позволяет обойтись без проведения кариотипического анализа исследуемой ткани, он имеет большую ценность при проведении исследования тканей, для которых существуют трудности в получении метафазных хромосом (солидные опухоли и др.). Области применения CGH: анализ хромосомных перестроек в опухолевых тканях, детекция амплификации и делеции генов, скрининг структурных хромосомных аберраций, анализ интеграции вирусов и мобильных генетических элементов в геном (Назаренко, Яковлева, 2001).
Для анализа маркерных хромосом разработаны специальные методы, позволяющие определить происхождение маркерной хромосомы. К ним относятся AcroM-FISH (Langer et. al., 2001), SubcenM-FISH (Starke et al., 2003), CenM-FISH (Nietzel et al., 2001) и ряд других методов молекулярно-цитогенетического анализа. Данный метод (Langer et. al., 2001) используется для анализа маркерных хромосом. Показано, что около 80% маркерных хромосом происходят из акроцентрических хромосом (Blennow et. al., 1994), и авторы AcroM-FISH предлагают на первом этапе проверять, не происходит ли анализируемая маркерная хромосома из одной из акроцентрических хромосом, а если да, то определить: а) из какой именно; б) содержит ли маркерная хромосома материал эухроматиновых районов этой хромосомы (Langer et. al., 2001). В AcroM-FISH одновременно используется девять ДНК-проб: пэйнтинг пробы хромосом 13, 14, 15, 21 и 22; центромерные ДНК-пробы pZ21A (хромосомы 13/21), р14.1 (хромосомы 14/22) и рМС15 (хромосома 15); меченая рибосомная ДНК (EcoRl 11.9 kb и 19.8 kb фрагменты рДНК человека). При тестировании данный метод позволил определить происхождение и присутствие эухроматинового материала в маркерных хромосомах, детальный анализ которых не удалось провести с помощью 24-х цветной FISH. Авторы метода полагают, что отсутствие положительного результата при использовании AcroM-FISH является доказательством происхождения анализируемой маркерной хромосомы из неакроценгрических хромосом. В этом случае они предлагают использовать для дальнейших исследований стандартную M-FISH. В этом случае будет достаточно использовать 19 хромосомоспецифичных ДНК-проб, что позволит несколько увеличить ее чувствительность.
Приготовление препаратов метафазных хромосом для FISH
С момента окончания фиксации до раскапывания суспензию выдерживали не менее суток. Перед приготовлением препаратов хромосом фиксатор, в котором хранились клетки, меняли на холодный, свежеприготовленный фиксатор. После этого суспензию фиксированных клеток раскапывали из пипетки с высоты 20 см на поверхность чистых, холодных и влажных предметных стекол. Стекла высушивали в течение 20 мин, под струей теплого воздуха.
При приготовлении препаратов метафазных хромосом для FISH и микродиссекции использовались суспензии фиксированных митотических клеток, оставшиеся после проведения первичного цитогенетического анализа в медико-генетической лаборатории ГНОКДЦ (заведующая - к.б.н. В.Г. Матвеева).. По одной суспензии нам предоставили Институт акушерства и гинекологии им. Д. О. Отто РАМН (г. Санкт-Петербург), Муниципальный центр планирования семьи и репродукции (г. Новосибирск) и Университет города Сан-Пауло (Бразилия).
Перед приготовлением препаратов хромосом фиксатор, в котором хранились клетки, меняли на холодный, свежеприготовленный фиксатор. Затем суспензию фиксированных клеток раскапывали из пипетки с высоты 30-50 см на поверхность чистых, холодных и влажных предметных стекол. Для лучшего распластывания хромосом и их освобождения от цитоплазмы препараты после легкого подсушивания при комнатной температуре дважды промывали холодным фиксатором и окончательно высушивали либо на термостолике (56С), либо на воздухе при комнатной температуре (18-22С). Препараты хранили под вакуумом не менее четырёх дней.
Покровные стекла (24x60 мм) предварительно выдерживали в 5% растворе додецилсульфата натрия (SDS) не менее трёх часов и тщательно промывали в пяти сменах дистиллированной воды. Суспензию фиксированных клеток раскапывали на холодные влажные покровные стёкла, высушивали и промывали в фосфатном буфере, рН 7.4 (Phosphate buffered saline). Полученные препараты без высушивания окрашивали для получения GTG-дифференциальной исчерченности хромосом.
Для получения GTG-исчерченности метафазных хромосом препараты обрабатывали 0,25% раствором трипсина в фосфатном буфере, рН 7,2 в течение 15-40 сек. при комнатной температуре, ополаскивали в фосфатном буфере, рН 7.4 (Phosphate buffered saline) и окрашивали 8%-ным раствором красителя Гимзы.
Пастеровские пипетки, специально оттянутые на пуллере фирмы LEIZ (диаметр 40-70 мкм, длина оттянутой части 10-15 мм) силиконизировали трехкратным ополаскиванием в 1% растворе диметилдихлорсилана в тетрахлористом углероде с последующей двукратной промывкой водным раствором 1мМ ЭДТА (рН 7,5). После этого микропипетки высушивали в термостате при 60С в течение 30 минут и обрабатывали один час при 100С. Непосредственно перед микродиссекцией силиконизированные пипетки и иглы выдерживали ночь под ультрафиолетом.
Микродиссекцию проводили на микроскопе AXIOVERT 10, оснащенном электронноконтролируемым микроманипулятором MR (Zeiss, Германия) и механическим позиционером, в стерильных условиях специально приготовленными для этого микродиссекционными иглами. Диссектированный материал переносили в микрокаплю (20-40 нл), помещенную в силиконизированную микропипетку. Коллекционная капля содержала ЮмМ Трис НС1 (рН 7,5), ЮмМ NaCl, 0,1% SDS, 30% глицерин, 500 мкг/мл протеиназы К (Boehringer Mannheim). Во время сбора микропипетка находилась во влажной камере при комнатной температуре. По завершению сбора необходимого числа копий хромосом или хромосомных районов, пипетку с диссектированным хромосомным материалом переносили в коробку из нержавеющей стали, помещенную в водяную баню (60С), на 2 часа (Rubtsov et aL, 2000).
Амплификацию ДНК изолированных хромосом и хромосомных районов проводили с помощью DOP-PCR, как описано в следующих статьях (Rubtsov et. al., 2000, Карамышева и др., 2001),
Амплификацию ДНК проводили в два этапа: 8 низкотемпературных циклов с Т7 Sequenase ДНК полимеразой (Amersham) и 33 высокотемпературных цикла с AmpliTaq (Perkin Elmer), Stoffel Fragment (Perkin Elmer) ДНК полимеразой. Материал после обработки в водяной бане переносили в стерильную 0,5 мл пробирку (Eppendorf, Safe Lock), содержащую 5 мкл реакционной смеси следующего состава: (24мМ Трис НС1, рН 7,5; 12мМ MgCl2; ЗОмМ NaCl), 5мкМ DOP-праймера, 200мкМ каждого дНТФ. Инактивацию протеиназы К проводили одновременно с начальной денатурацией ДНК диссектированного материала 6 минут при 96С в амшшфикаторе фирмы Eppendorf (Mastercycler personal) при температуре крышки 105С. Восемь низкотемпературных циклов проводили по следующей схеме: 25С - 2 минуты, 36С - 2 минуты, 94С - 1 минута. 3,25 единиц фермента Sequenase Version 2.0 в 0,25 мкл добавляли каждый цикл при 25С. Разведение исходного фермента осуществлялось в буфере следующего состава: ЮмМ Трис НО, рН 7,5; 5тМ дитиотрейтола (DTT); 0,5 мг/мл БСА в соотношении 1:8. После завершения 8-го цикла добавляли 50 мкл реакционной смеси, содержащей lxStofFel буфер, 200 мкМ каждого дНТФ, 1мкМ DOP-праймера, 2,5мМ MgCl2 и 5 ед. AmpliTaq, Stoffel Fragment ДНК полимеразы. Инкубировали 2 минуты при 94С. После чего проводили 33 высокотемпературных цикла: 94С - 1 минута; 5бС —1,5 минуты; 72С - 2 минуты. По окончании циклов пробирку инкубировали в течение 8 минут при 72С для полного завершения элонгации цепей.
Описанный вариант DOP-PCR проводили в амплификаторе фирмы Eppendorf (Mastercycler personal) с горячей крышкой (105С).
ДНК метили в 17 циклах полимеразной цепной реакции (амплификатор фирмы Eppendorf (Mastercycler personal), температура крышки - 105С). 1 мкл DOP-библиотеки добавляли к 20 мкл ПЦР-смеси: ЮтМ Трис НО, 50тМ КО, рН 8,3, 200 мкМ дАТФ, дЦТФ, дГТФ, 100 мкМ дТТФ и ЮОмкМ биотин-16-дУТФ или дигоксигенин-11-дУТФ, 2 мкМ DOP-праймера, 2,5мМ MgCl2 и 1,5 ед. Ampli Taq ДНК полимеразы. ПЦР проводили в режиме: денатурация 94С - 1 минута; отжиг 56С - 1,5 минуты; элонгация цепей при 72С - 2 минуты; с завершающей элонгацией цепей при 72С - 8 минут.
Меченые продукты анализировали методом электрофореза в 1,5% агарозном геле. На старт наносили 2 мкл реакционной смеси.
Анализ организации маркерных хромосом (MX) микродиссекцией и in situ гибридизацией ДНК-проб, специфичных MX, а также in situ гибридизацией с ДНК-пробами, специфичными теломерным повторам и рибосомальной ДНК
Наиболее важным вопросом при исследовании маркерной хромосомы является выявление в ней эухроматиновых районов или доказательство их отсутствия. В случае отсутствии в составе маркерной хромосомы эухроматиновых районов вопрос о ее происхождении становится академическим, так как такая MX не влияет на фенотип носителя. В связи с этим, представляется целесообразной разработка относительно простой и недорогой системы анализа маркерных хромосом, позволяющей определить наличие в ней эухроматиновых районов.
Общеизвестно, что гетерохроматиновые районы хромосом могут быть выявлены с помощью С-окрашивания. Этот метод можно было бы применить для выявления эухроматиновых районов в маркерных хромосомах, которые оставались бы негативными при С-окрашивании. К сожалению, подавляющее большинство маркерных хромосом (и, соответственно, входящие в их состав эухроматиновые районы) имеют очень небольшие размеры, а С-окрашивание не позволяет выявить эухроматиновые районы размером менее 3 мЬ.
Специфическое окрашивание хромосомных районов FISH может быть достигнуто двумя способами: (1) использованием в качестве ДНК-пробы фрагментов ДНК, локализованных только в интересующем исследователя районе; (2) использованием ДНК-пробы, содержащей кроме фрагментов ДНК данного района хромосомы, ДНК, гомологичную ДНК других районов хромосом, гибридизация которой супрессируется, Наглядным примером второго подхода является использование хромосомоспецифичных ДНК-проб, специфически окрашивающих индивидуальные хромосомы. Такие ДНК-пробы содержат, кроме уникальных последовательностей, огромное количество диспергированных повторенных последовательностей, гибридизация которых супрессируется предгибридизацией с 50-100 кратным избытком C0tl ДНК. Обычно такая супрессия приводит к отсутствию сигнала также в С-гетерохроматиновом районе окрашенной хромосомы. Однако существуют комбинации представленности в ДНК-пробе уникальной ДНК хромосомного района и уровня супрессии гибридизации повторенных последовательностей, при которых FISH может интенсивно окрашивать С-гетерохроматиновые блоки (Рис 12а,б). Учитывая неоднородность С-гетерохроматиновых районов и наличие в них кластеров повторенных и дуплицированных последовательностей, невозможно гарантировать полное подавление в них гибридизации при проведении супрессионной FISH, т.е. дифференциация эу- и гетерохроматиновых районов при CISS-гибридизации может быть значительно осложнена.
Более перспективным для выявления эухроматиновых районов представляется использование ДНК-проб, содержащих ДНК, присутствующую во всех эухроматиновых районах, но отсутствующую в районах С-гетерохроматина.
Основой для получения таких ДНК-проб может быть суммарная кДНК различных тканей человека, фракция уникальных и умеренно повторенных последовательностей геномной ДНК человека, либо диспергированные повторенные последовательности, распространение которых ограничено эухроматиновыми районами хромосом. Результаты секвенирования генома человека показали, что на экзоны в геноме человека приходится приблизительно 4% геномной ДНК (4,15% в R-бэндах и 3.19% в G-бэндах) (Wright et. at, 2001). Даже этой доли достаточно для создания ДНК-пробы, специфически окрашивающей соответствующую хромосому, на базе хромосомоспецифичной кДНК (Yokoyama et al., 1997). К сожалению, при использовании такой ДНК-пробы при выявлении эухроматиновоЙ части MX могут возникнуть следующие проблемы: слабый сигнал в случае присутствия в MX небольших эухроматиновых районов; выявление в MX сигнала, обусловленного наличием в MX кластера дупликонов, состоящего из ДНК, гомологичной ДНК различных генов (Рубцов и др., 2003). Проблема усугубляется относительно невысокой плотностью экзонов в эухроматиновых районах хромосом, при наличии значительного числа гомологичных им последовательностей в кластерах дуплицированных последовательностей, многие из которых локализованы в прицентромерных районах. Крупный кластер дупликонов вполне может быть причиной сигнала, имитирующего присутствие небольшого эухроматинового района. Оценить чувствительность выявления небольших эухроматиновых районов и вероятность ложноположительной диагностики, обусловленной крупными кластерами дупликонов, возможно лишь при наличии детально охарактеризованных MX. При этом наличие такой оценки не решит проблемы межхромосомного полиморфизма по размеру таких кластеров дупликонов (Рубцов и др., 2003; Horvath et. al., 2001).
Другим способом получения ДНК-пробы, специфичной эухроматиновым районам, является удаление повторенных последовательностей из препарата геномной ДНК. Фракция ДНК, обедненная повторенными последовательностями, может быть получена разными способами. Один из них включает в себя денатурацию-ренатурацию ДНК и последующее разделение однонитчатой и двунитчатой ДНК на гидроксиапатите (Остерман, 1985). Другим способом является удаление из пула фрагментов ДНК повторенных последовательностей проведением гибридизации с биотинилированными фрагментами повторенной ДНК и связыванием сформированных дуплексов с авидином, нанесенным на поверхность микрочастиц, которые могут быть удалены из реакционной смеси (Bolzer et. al., 1999). К сожалению, выявление с их помощью небольших эухроматиновых районов представляется проблематичным. Использование ДНК-проб, обедненных повторенными последовательностями, имеет ряд проблем. Следует учитывать, что суммарный сигнал FISH в хромосомном районе зависит от ряда факторов, таких как условия проведения гибридизации, уровень мечения ДНК, размер фрагментов ДНК, упаковка ДНК в хромосоме, число копий соответствующих последовательностей ДНК и т.д.. Наличие кластера повторенных гомологичных последовательностей в ДНК мишени приводит к значительному усилению сигнала в этом районе. При использовании хромосомоспецифичных ДНК-проб нередко можно наблюдать сигнал в С-гетерохроматиновом районе данной хромосомы при подавлении гибридизации повторенных последовательностей в эу- и гетерохроматиновых районах других хромосом (рис. 12 а,б).
При анализе результатов FISH более существенным является не абсолютная интенсивность специфического сигнала, а его превышение над фоновым уровнем, который может быть обусловлен как неспецифической гибридизацией, так и гомологичной гибридизацией повторенных последовательностей ДНК-пробы с соответствующими повторами, локализованными в других хромосомных районах. В результате, амплификация в гетерохроматиновом районе повторенной последовательности, в норме представленной в геноме человека относительно небольшим числом копий, может привести к формированию кластера повторов, который будет выявлен при стандартной супрессии C0tl ДНК и может быть ошибочно идентифицирован как небольшой эухроматиновый район.
