Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Эффекты введения семакса в течение 3-4 недель постнатального развития крыс в норме и на фоне неонатальной изоляции . 68
1 Оценка показателей физического развития крыс. 68
1.1 Влияние НИ и введения семакса в течение 3-4 недель жизни крыс на возраст открытия глаз. 68
1.2 Влияние НИ и введения семакса в течение 3-4 недель жизни крыс на изменение массы тела крыс 70
1.3 Влияние НИ и введения семакса в течение 3-4 недель жизни 1.4 на уровень глюкозы в крови крыс. 72
1.5 Влияние НИ и введения семакса в течение 3-4 недель жизни рыс на уровень пищевой мотивации 74
2 Оценка ориентировочно-исследовательской активности, уровня тревожности и депрессивных составляющих поведения крыс 77
. 1 Влияние НИ и введения семакса в течение 3-4 недель жизни крыс на параметры поведения в бесстрессорной модификации теста ОП на 30 день жизни 77
.2 Влияние НИ и введения семакса в течение 3-4 недель жизни крыс на параметры поведения в ПКЛ на 31 день постнатального развития 79
.3 Влияние НИ и введения семакса в течение 3-4 недель жизни крыс на параметры поведения в тесте ПКЛ на 60 день постнатального развития 81
2.4 Влияние НИ и введения семакса в течение 3-4 недель жизни крыс
на параметры поведения в стрессогенной модификации теста ОП на 61 день постнатального развития 83
.5 Влияние НИ и введения семакса в течение 3-4 недель жизни крыс на параметры поведения в тесте "принудительное плавание" на 47 день постнатального развития 85
Оценка способности крыс к обучению 87
3.1 Влияние НИ и введения семакса в течение 3-4 недель жизни крыс на способность к обучению с отрицательным подкреплением в тесте УРПИ 87
3.2 Влияние НИ и введения семакса в течение 3-4 недель жизни крыс на способность к обучению с положительным подкреплением
в сложном лабиринте 89
1.4 Влияние НИ и введения семакса в течение 3-4 недель жизни на базальный уровень кортикостерона в крови и гормональный стрессорный ответ 93
ГЛАВА 2. Эффекты введения семакса в течение 1-2 недель постнатального развития крыс в норме и на фоне неонатальной изоляции . 96
2.1 Оценка показателей физического развития крыс. 96
2.1.1 Влияние НИ и введения семакса в течение 1 -2 недель жизни крыс на возраст открытия глаз. 96
2.1.2 Влияние НИ и введения семакса в течение 1-2 недель жизни крыс на изменение массы тела крыс. 98
2.1.3 Влияние НИ и введения семакса в течение 1 -2 недель жизни крыс на уровень глюкозы в крови крыс. 100
2.2 Оценка ориентировочно-исследовательской активности, уровня тревожности и депрессивных составляющих поведения крыс 102
2.2.1 Влияние НИ и введения семакса в течение 1-2 недель жизни крыс на параметры поведения в бесстрессорной модификации теста ОП на 30 день постнатального развития 103
2.2.2 Влияние НИ и введения семакса в течение 1-2 недель жизни крыс на параметры поведения в ПКЛ на 31 день постнатального развития 104
2.2.3 Влияние НИ и введения семакса в течение 1-2 недель жизни крыс на параметры поведения в ПКЛ на 60 день постнатального развития 107
2.2.4 Влияние НИ и введения семакса в течение 1-2 недель жизни крыс на параметры поведения в стрессогенной модификации теста ОП на 61 день постнатального развития 109
2.2.5 Влияние НИ и введения семакса в течение 1-2 недель жизни крыс
на параметры поведения в тесте "принудительное плавание" на 47 день
постнатального развития 111
2.3 Оценка способности крыс к обучению 113
2.3.1 Влияние НИ и введения семакса в течение 1-2 недель жизни крыс на способность к обучению с отрицательным подкреплением в тесте УРПИ 113
2.3.2 Влияние НИ и введения семакса в течение 1-2 недель жизни крыс на способность к обучению с положительным подкреплением
в сложном лабиринте 115
ГЛАВА 3. Эффекты неонатальнои изоляции в течение 1-2 недель жизни крыс 120
3.1 Оценка показателей физического развития крыс. 120
3.1.1 Влияние НИ в течение 1 -2 недель жизни крыс на изменение массы тела. 120
3.1.2 Влияние НИ в течение 1-2 недель жизни крыс на уровень глюкозы в крови. 121
3.2 Оценка ориентировочно-исследовательской активности, уровня тревожности и депрессивных составляющих поведения крыс 121
3.2.1 Влияние НИ в течение 1-2 недель жизни крыс на параметры поведения в бесстрессорной модификации теста ОП на 30 день постнатального развития 121
3.2.2 Влияние НИ в течение 1-2 недель жизни крыс на параметры поведения в ПКЛ на 31 день постнатального развития 122
3.2.3 Влияние НИ в течение 1-2 недель жизни крыс на параметры поведения в ПКЛ на 60 день постнатального развития 123
3.2.4 Влияние НИ в течение 1-2 недель жизни крыс на параметры поведения в стрессогенной модификации теста ОП на 61 день постнатального развития 124
3.2.5 Влияние НИ в течение 1-2 недель жизни крыс на параметры поведения крыс в тесте "принудительное плавание" на 47 день постнатального развития 126
3.3 Оценка способности крыс к обучению 126
3.3.1 Влияние НИ в течение 1-2 недель жизни крыс на способность к обучению с отрицательным подкреплением в тесте УРПИ 126
3.3.2 Влияние НИ в течение 1-2 недель жизни крыс на способность к обучению с положительным подкреплением в сложном лабиринте 127
ГЛАВА 4. Отставленные эффекты хронического неонатального введения флувоксамина и их коррекция препаратом семакс . 131
4.1 Оценка показателей физического развития крыс. 132
4.1.1 Влияние введения флувоксамина на возраст открытия глаз. 132
4.1.2 Влияние флувоксамина и семакса на изменение массы тела крыс 133
4.2 Оценка ориентировочно-исследовательской активности, уровня тревожности и депрессивных составляющих поведения крыс 133
4.2.1 Влияние флувоксамина и семакса на параметры поведения в бесстрессорной модификации теста ОП на 30 день постнатального развития 133
4.2.2 Влияние флувоксамина и семакса на параметры поведения в ПКЛ на 31 день постнатального развития 136
4.2.3 Влияние флувоксамина и семакса на параметры поведения в ПКЛ на 60 день постнатального развития 137
4.2.4 Влияние флувоксамина и семакса на параметры поведения в О-образном лабиринте на 61 день постнатального развития 138
4.2.5 Влияние флувоксамина и семакса на параметры поведения в стрессогенной модификации теста ОП на 61 день постнатального развития 139
4.2.6 Влияние флувоксамина и семакса на параметры поведения в тесте "принудительное плавание" на 47 день постнатального развития 140
4.3 Оценка способности крыс к обучению 141
4.3.1 Влияние флувоксамина и семакса на способность к обучению с отрицательным подкреплением в тесте УРПИ 141
4.3.2 Влияние флувоксамина и семакса на способность к обучению с положительным подкреплением в сложном лабиринте 143
Обсуждение 147
1. Влияние использованных неонатальных манипуляций 147
2. Эффекты НИ 155
2.1 Влияние НИ на физическое развитие 155
2.2 Влияние НИ на исследовательскую активность, уровень тревожности и
депрессивности 156
2.3 Влияние НИ на способность к обучению 159
2.4 Влияние НИ на стресс-рекативность 160
3. Оценка возможности коррекции последствий НИ с помощью введения семакса 161
4. Отставленные эффекты хронического интраназального введения семакса в разные периоды неонатального развития 163
5. Отставленные эффекты хронического неонатального введения флувоксамина 164
Выводы 168
Список литературы
- Влияние НИ и введения семакса в течение 3-4 недель жизни крыс на изменение массы тела крыс
- Влияние НИ и введения семакса в течение 1 -2 недель жизни крыс на возраст открытия глаз.
- Оценка ориентировочно-исследовательской активности, уровня тревожности и депрессивных составляющих поведения крыс
- Оценка ориентировочно-исследовательской активности, уровня тревожности и депрессивных составляющих поведения крыс
Введение к работе
Актуальность проблемы. Важная роль неонатального периода жизни в развитии нейрофизиологических механизмов и дальнейшем становлении ментальных функций не вызывает сомнений. Известно, что болевые воздействия и стресс, перенесенные новорожденными детьми, приводят впоследствии к нарушениям развития нервной системы и значительным изменениям поведения [Poster et al., 1999]. Хотя рядом авторов выявлена корреляция между неонатальными воздействиями и нарушениями поведения взрослого человека, вопрос этот остается недостаточно исследованным [Anand, Scalzo, 2000]. Поэтому изучение долговременных последствий неонатального стресса и поиск возможных путей их коррекции являются актуальной проблемой современной медицины и физиологии. Эффекты неонатального стресса активно исследуются в экспериментах на животных, в частности на крысах и мышах. Эксперименты на животных с использованием различных аверсивных воздействий позволяют определить зависимость отставленных изменений поведения от срока и природы стрессогенного воздействия и способствуют поиску методов коррекции последствий неонатального стресса.
Клинические исследования показали, что нарушение социо-эмоциональной связи матери и ребенка в первый год жизни является серьезным стрессогенным фактором и в дальнейшем повышает риск развития многих психических заболеваний [Roman et al, 2006; Russek, Schwartz, 1997]. В экспериментах на животных показано, что длительное отлучение детенышей от матери (материнская депривация/неонатальная изоляция) в ранний постнатальный период влияет на физическое развитие и вызывает долговременные отставленные изменения поведения животных разных видов. Материнская депривация рассматривается как модель неонатального стресса [Hall, 1998; Anisman et al., 1998]. Оценке отставленных эффектов материнской депривации и неонатальной изоляции посвящены многочисленные исследования. Однако результаты этих исследований крайне противоречивы. Противоречивость полученных результатов может быть связана с различиями в протоколах экспериментов [Rees et al., 2006].
Необходимы дальнейшие исследования отставленных эффектов хронической материнской депривации и неонатальной изоляции, а также разработка адекватной модели неонатального стресса в экспериментах на животных.
Гептапептид семакс является аналогом фрагмента АКТГ(4-10), обладающим пролонгированным ноотропным действием [Ashmarin et al., 1995]. Исследования показали, что этот пептид также обладает нейропротекторными и нейротрофическими эффектами [Левицкая и др., 2002; Dolotov et al., 2006]. В настоящее время семакс используется в медицине в качестве ноотропного и нейропротекторного препарата. Эксперименты на животных показали, что хроническое неонатальное введение семакса приводит в дальнейшем к увеличению исследовательского поведения, снижению тревожности и улучшению обучения крыс. Эффекты носили отставленный долговременный характер [Себенцова и др., 2004]. Изменения поведения животных, получавших семакс в неонатальный период, были противоположны изменениям поведения крыс, перенесших неонатальный стресс, что позволяет предположить возможность компенсации негативных последствий неонатального стресса при помощи семакса.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось исследование долговременных эффектов хронического неонатального стресса, вызванного ранней изоляцией, и неонатального введения селективного ингибитора обратного захвата серотонина, а также оценка возможности коррекции этих эффектов при помощи семакса.
Перед нами были поставлены следующие задачи:
разработка адекватной модели неонатального стресса, вызванного хронической неонатальной изоляцией детенышей белых крыс;
оценка эффектов хронической неонатальной изоляции детенышей белых крыс;
изучение эффектов хронического интраназального введения семакса в различные периоды неонатального развития;
оценка возможности коррекции последствий неонатального стресса при помощи неонатального введения семакса;
- изучение отставленных эффектов хронического неонатального
введения флувоксамина детенышам белых крыс и сопоставление этих
эффектов с эффектами неонатальной изоляции;
- оценка возможности коррекции последствий введения флувоксамина
при помощи препарата семакс.
Научная новизна. В рамках настоящей работы впервые были исследованы долговременные эффекты хронического неонатального стресса, вызванного ежедневной неонатальной изоляцией (НИ) детенышей белых крыс на 5 часов в день в период с 1 по 14 день постнатального развития. Впервые проведена оценка влияния ежедневного интраназального введения семакса в различные периоды раннего постнатального развития на последствия неонатального стресса. Было показано, что НИ приводит к задержке физического развития, изменениям поведения крыс в возрасте 1-2 месяцев, а также снижению гормонального ответа на стрессогенное воздействие в возрасте 2 месяцев. В представленной работе впервые показана возможность коррекции негативных последствий неонатального стресса при помощи препарата семакс. Кроме того, в работе впервые были исследованы отставленные эффекты хронического введения селективного ингибитора обратного захвата серотонина флувоксамина в период раннего постнатального развития, а также проведена оценка возможности коррекции эффектов введения флувоксамина последующим введением семакса. Показано, что неонатальное введение флувоксамина приводит к отставленному снижению массы тела, вызывает долговременные негативные изменения поведения животных и приводит к нарушению способности к обучению. Впервые продемонстрирована возможность нормализации поведения животных, нарушенного введением флувоксамина, последующим введением семакса.
Положения, выносимые на защиту
1. Экспериментальные манипуляции (интраназальные инъекции воды, кратковременное отлучение от матери) в течение первого месяца жизни приводят к снижению уровня тревожности и улучшению способности к обучению у белых крыс. Анксиолитический эффект манипуляций более ярко-
выражен при проведении инъекций с 1 по 14 день жизни, влияние на обучение - при осуществлении инъекций с 15 по 28 день жизни.
Ежедневная НИ (5 ч/день) с 1 по 14 день постнатального развития приводит отставанию физического развития, повышению уровня тревожности, снижению исследовательской активности, повышению степени депрессивности и ослаблению гормонального ответа на стрессогенное воздействие.
Ежедневное интраназальное введение семакса в дозе 0.05 мг/кг с 15 по 28 день жизни ослабляет влияние НИ на физическое развитие, эмоциональное состояние и гормональный ответ на стрессогенное воздействие, а также оказывает стимулирующее действие на обучение с положительным подкреплением.
Ежедневное внутрибрюшинное введение флувоксамина в дозе 10 мг/кг оказывает кратковременное стимулирующее действие на физическое развитие, приводит к отставленному снижению массы тела, повышению уровня тревожности и ухудшению обучения белых крыс.
5. Ежедневное интраназальное введение семакса с 15 по 28 день
постнатального развития ослабляет отставленные эффекты неонатального
введения флувоксамина.
Теоретическое и научно-практическое значение работы.
В представленной работе было проведено исследование отставленных последствий экспериментальных манипуляций (интраназальные инъекции воды, кратковременное отлучение от матери) в течение первого месяца жизни, а также проведено сравнение эффектов манипуляций, осуществляемых на различных этапах раннего постнатального развития крыс. Полученные результаты могут быть использованы при разработке экспериментальных моделей неонатального стресса на животных.
В ходе выполнения работы была разработана модель неонатального стресса у белых крыс. Данная модель может быть использована для дальнейшего изучения механизмов влияния неонатального стресса на физическое развитие и поведенческие функции животных, а также для поисков путей коррекции негативных последствий неонатального стресса.
Проведена оценка отставленных последствий неонатального введения препарата флувоксамин. Флувоксамин относится к группе селективных ингибиторов обратного захвата серотонина, широко используемой при лечении депрессивных и тревожных расстройств, в том числе у беременных и кормящих женщин. В ходе проведенного исследования было показано, что введение флувоксамина детенышам белых крыс в раннем неонатальном периоде вызывает отставленные нарушения эмоционального статуса и способности к обучению животных, сохраняющиеся до 2 месяцев. Полученные данные необходимо учитывать при назначении данного препарата беременным и кормящим женщинам.
Введение семакса с 15 по 28 день жизни ослабляло последствия НИ и введения флувоксамина. Полученные результаты могут послужить основой для расширения клинического применения лекарственного препарата семакс, в частности, для лечения патологий у детей в ранний постнатальный период.
Сопоставление отставленных эффектов НИ и последствий введения флувоксамина в ранний неонатальныи период позволяет предположить, что влияние НИ на уровень тревожности и исследовательское поведение крыс опосредовано изменением активности серотонинергической системы мозга, что может быть использовано для разработки методов коррекции негативных последствий неонатального стресса
Апробация работы. Результаты работы были изложены на конференции "Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга" (Санкт-Петербург, 2008), Всероссийской научно-практической конференции "Физиология адаптации" (Волгоград, 2008), II съезде физиологов СНГ (Молдова, 2008), III Международной конференции "Химия, структура и функция биомолекул" (Минск, 2008), IV и V Российском симпозиуме "Белки и пептиды" (Казань, 2009; Петрозаводск, 2011), Объединенном съезде скандинавского и немецкого физиологических обществ (Копенгаген, 2010), XXI съезде Физиологического общества имени И.П. Павлова (Калуга, 2010), конференции "Физиологическая активность регуляторных пептидов" (Москва, 2010), 1й молодежной школе "Нейротехнологии 2010. Биоэкономика, основанная на знаниях: политика
инновационного пути развития биотехнологии" (Бекасово, 2010), 17й зимней школе CIMO (Тварминне, 2011), 11ом региональном съезде европейского общества нейрофармакологов (Санкт-Петербург, 2011).
Публикации. По теме работы опубликовано 15 печатных работ, из которых 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов работы и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 186 страницах, содержит 72 рисунка и 3 таблицы. Список литературы включает 303 источника.
Влияние НИ и введения семакса в течение 3-4 недель жизни крыс на изменение массы тела крыс
Неонатальный период жизни играет огромную роль в развитии нервной системы и физиологических функций организма. На сегодняшний день проведено большое число исследований, подтверждающих значительную роль негативных воздействий в раннем постнатальном периоде онтогенеза человека в развитии психических отклонений в дальнейшем. Одним из наиболее серьезных факторов риска, приводящих к развитию тревожных и депрессивных расстройств во взрослом возрасте, является тяжелый стресс, перенесенный в детстве. У детей, подвергавшихся насилию в семье и/или выросших в неблагоприятных условиях, значительно повышается риск развития депрессий и повышенной тревожности, по сравнению с детьми, не имевшими такого негативного опыта [Penza et al., 2003]. Эпидемиологические исследования показали, что родительское пренебрежение и плохое обращение в детстве также являются факторами риска развития в дальнейшем психопатологий [Gutman and Nemeroff, 2003]. Например, существует большая вероятность развития депрессии у людей, подвергавшихся в детстве жестокому обращению, и тревожных расстройств и посттравматического синдрома у детей, подвергавшихся психологическому, физическому или сексуальному насилию [Gibb et al., 2007; Springer et al., 2007]. Болевые воздействия и стресс, перенесенные новорожденными детьми, также приводят впоследствии к нарушениям развития нервной системы и значительным изменениям поведения. Дети, перенесшие в неонатальный период серьезные заболевания, подвергаются многочисленным болевым и стрессогенным воздействиям во время длительной госпитализации и необходимых медицинских процедур. Такие воздействия вызывают не только острые изменения, но и приводят к постоянным структурным и функциональным изменениям в ЦНС [Anand, 2000; Poster et al., 1999]. Показано, что нарушение социо-эмоциональной связи матери и ребенка в первый год жизни является стрессогенным фактором и в дальнейшем повышает риск развития многих психических заболеваний [Russak, Schwartz, 1997].
Зачастую проявление психических нарушений у человека, подвергавшегося неонатальному стрессу, может быть индуцировано острым или хроническим стрессом, перенесенным уже во взрослом возрасте [Hammen et al., 1992; Mooy et al., 2000; Norman and Malla, 1994]. Это дает право предположить, что негативные воздействия на ранних этапах развития могут привести к повышенной чувствительности к стрессу в дальнейшем. Такая повышенная чувствительность, в свою очередь, становится причиной развития широкого спектра умственных и психических расстройств, которые, как известно, зачастую появляются или обостряются под воздействием острого или хронического стресса [Heim and Nemeroff, 2001]. Предрасположенность к стрессу и заболеваниям, безусловно, является следствием не только негативных внешних воздействий, но также обуславливается и генетическими факторами [Francis et al., 1999]. Тем не менее, взаимодействие генетических факторов, стресса в раннем возрасте и текущего стресса может окончательно детерминировать индивидуальную предрасположенность к повышенной стрессорной реакции и возникновению психических нарушений. Так, в исследованиях, проведенных на близнецах, были получены данные, говорящие о том, что тяжелая депрессия является следствием сочетания генетической предрасположенности, ранней травмы и стресса в более поздний период [Kendler et al., 1993].
Существует ряд работ, в которых изучаются последствия раннего стресса на людях. Например, было показано, что у детей, перенесших стрессогенные воздействия разной природы в разном возрасте, отмечается снижение уровня кортизола в слюне утром или недостаточное снижение кортизола к вечеру, что свидетельствует о нарушении циркадных ритмов активности гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы (ГГА система) [Carlson and Earls, 1997; Goenjian et al., 1996; Kaufman, 1991]. Концентрация кортизола коррелировала с симптомами депрессии и посттравматического синдрома. Отсутствие снижения уровня кортизола к вечеру у таких детей могло быть связано с большим числом стрессогенных событий в течение дня или повышенной реактивностью ГГА системы на дневной стресс [Heim and Nemeroff, 2001]. В ответ на введение кортикотропин-рилизинг гормона (КРГ) у девочек, подвергшихся сексуальному насилию, отмечался сниженный выброс АКТГ по сравнению с девочками, не подвергавшимися такому стрессогенному воздействию [De Bellis et al., 1994], что отражает отрицательную регуляцию экспрессии рецепторов КРГ в гипофизе в результате гиперсекреции КРГ гипоталамусом. У детей, переживших опыт родительского пренебрежения, отмечалось снижение уровня норадраналина и дофамин-Р-гидроксилазы (фермента, отвечающего за синтез норадреналина) [Rogeness and McClure, 1996].
Однако, хотя рядом авторов показана корреляция между неонатальными воздействиями и нарушениями поведения взрослого человека, вопрос этот остается недостаточно исследованным [Anand, Scalzo, 2000]. Очевидно, что проведение клинических исследований последствий неонатального стресса сопряжено с огромными трудностями. Значительный вклад в исследование данной проблемы вносят эксперименты на животных, в связи с чем возникает вопрос о разработке адекватных моделей неонатального стресса. Эксперименты на животных с использованием различных аверсивных воздействий позволяют определить зависимость отставленных изменений поведения от срока и природы стрессогенного воздействия и способствуют поиску методов коррекции последствий неонатального стресса. Доклинические исследования могут помочь пролить свет на нейробиологические последствия неблагоприятной обстановки в ранний период развития, хотя моделирование условий человеческих ситуаций очень сложно и иногда невыполнимо. Как обсуждается в обзоре Loman and Gunnar [Loman, Gunnar, 2009], дети редко подвергаются какому-то отдельно взятому типу негативных воздействий, в то время как в эксперименте на животных представляется возможным оценить результаты воздействия конкретного негативного фактора. Благодаря этому, доклинические исследования могут быть более полезны для установления причинно-следственных связей, чем клинические исследования.
Существует большое количество исследований, посвященных поиску оптимальной методики стрессирования детенышей и изучению зависимости эффектов неонатального стресса от природы стрессогенного фактора и сроков его воздействия. Важным моментом в вопросе выбора сроков воздействия является то, на каком этапе развития мозга находится детеныш в данном возрасте. Крысы и мыши относятся к незрелорождающимся животным. Интенсивное развитие нейрональных систем мозга у них происходит не только в эмбриональный, но и в неонатальный период развития. Существуют данные, подтверждающие, что уровень развития ЦНС в первую неделю постнатального развития у крысят соответствует уровню развития нервной системы у человека в течение последнего триместра эмбрионального развития. На 7 день жизни головной мозг крысят находится приблизительно на том же этапе развития, что у ребенка в момент рождения [Clancy et al., 2007]. У незрелорождающихся животных первые постнатальные недели развивающийся мозг особенно чувствителен к гормональному влиянию, поскольку данное воздействие происходит в период активной дифференцировки нейронов. Основную роль в стрессорном ответе играет ГГА система. Хотя большинство отделов гипоталамо-гипофизарной системы иннервируется у незрелорождающихся животных к концу внутриутробного развития, промежуточная доля гипофиза получает иннервацию после рождения [Gary, Chronwall, 1992; Davis et al., 1984]. Также в постнатальный период формируются синаптические контакты с клетками-мишенями, причем плотность иннервации увеличивается вплоть до периода полового созревания [Kalsbeek et al., 1992; Ugrumov et al., 1994]. Происходит пространственное усложнение синапсов, а также замещение по мере развития аксосоматических контактов на аксодендритные [Piotte et al., 1988; Ugrumov et al., 1994].
Интересным периодом в развитии нервной системы является период гипореактивности на стрессорные воздействия. Для развития мозга крыс характерен всплеск развития специализированных астроцитов и пирамидных клеток перед рождением. При этом миелинизация и миграция клеток в гранулярный слой зубчатой извилины и клеток обонятельной луковицы и мозжечка происходят только на 7-14 дни постнатального развития [Morgane et al., 2002]. Этот период интенсивной нейрональной перестройки совпадает со временем, когда активность ГГА системы, наиболее важной эндокринной системы, участвующей в стрессорном ответе, имеет своеобразный профиль созревания, известный как период стресс-гипокреактивности. Этот период у крыс длится с 4 по 14 постнатальный день (ПНД 4 - ПНД 14) и соответствует периоду пониженной активности надпочечников и сниженной реактивности на стрессогенные воздействия, которые в норме у взрослых животных вызывают заметный стрессорный ответ [Rosenfeld et al., 1992а]. Стресс-гипореактивный период рассматривается как высоко адаптивная фаза развития, так как поддержание невысокого и стабильного уровня кортикостерона необходимо для роста и развития ЦНС в период раннего онтогенеза [Ballard et al, 1979; Doupe et al., 1985; Meyer and Fairman, 1985; Meyer and Joy, 1985; Sawano et al., 1969]. Период гипореактивности очень подробно изучен у грызунов. При этом вопрос существования аналогичного периода у детей и его природы долгое время оставался открытым. Появление возможности проводить измерение уровня кортизола в слюне способствовало прорыву в изучении данной системы у совсем маленьких детей и позволило показать наличие такого периода у детей [Gunnar and Donzella, 2002]. Хотя на данный момент и существуют исследования, посвященные изучению последствий нарушения активности ГГА системы в этот период у людей, такие работы гораздо удобнее проводить на животных, особенно принимая во внимания большую скорость созревания грызунов.
Влияние НИ и введения семакса в течение 1 -2 недель жизни крыс на возраст открытия глаз.
При исследовании влияния НИ и введения семакса в 1-2 недели жизни для показателя масса тела не было зарегистрировано достоверного взаимодействия между факторами "пол" и "группа" (F(l,38)=0.25, р=0.62), поэтому результаты приведены совместно для самок и самцов. Применение ANOVA-метода для повторных измерений также выявило достоверное влияние факторов "группа" (F(2,66)=17.00, рО.0001), "возраст" (F(29,1914)=2520.8, рО.0001), а также достоверное взаимодействие этих факторов (F(29,1914)=20.44, р 0,0001). Последующий анализ показал, что начиная со второго дня регистрации, масса тела крысят, подвергавшихся НИ в течение 1-2 недель жизни, была достоверно ниже контрольных значений (рис. 29). Введение семакса в те же сроки не влияло на эффекты неонатальной изоляции.
Оценка влияния неонатального введения семакса в течение 1-2 недель жизни на изменение массы тела крысят, не подвергавшимся НИ, не выявила достоверного взаимодействия между факторами "пол" и "группа" (F(l,38)=0.25, р=0.62), что позволило представить результаты, полученные по группе животных обоего пола. Применение ANOVA-метода для повторных измерений показало достоверное влияние фактора "возраст" (F(30,1140)=1912.4, р 0,0001). При этом значимого влияния фактора "группа" (F(l,38)=0.20, р=0.66), так же как и достоверного взаимодействия факторов "группа" и "возраст" не наблюдалось (F(30,1140)=0.12, р=1.00) (рис. 30).
Таким образом, НИ в течение 1-2 недель жизни приводит к задержке соматического роста крысят. Инъекции семакса крысятам, подвергавшимся НИ, не влияли на данный эффект использованного неонатального стресса. Введение семакса в период с 1 по 14 дни жизни крысятам, которых не подвергали НИ, не приводило к изменению массы тела животных относительно контрольных значений. Влияние НИ и введения семакса в течение 1-2 недель жизни крыс на уровень глюкозы в крови крыс. Оценка влияния неонатальной изоляции и введения семакса крысятам, перенесшим НИ, на содержание глюкозы в крови животных не выявила значимого взаимодействия факторов "пол" и "группа" для этого показателя как на 15 день (F(2,38)=0.85, р=0.44), так и на 48 день жизни крыс (F(2,28)=0.16, р=0.85), поэтому результаты приведены совместно для самок и самцов. При этом было зарегистрировано достоверное влияние фактора "группа" на 15 (F(2,38)=8.95, р=0.0007) и 48 (F(2,28)=8.26, р=0.002) дни жизни животных.
Дальнейший анализ показал значимое снижение содержания глюкозы в крови животных, подвергавшихся НИ, на 15 и на 48 день жизни (рис. 31). Введение семакса в течение 1-2 недель жизни крысам, перенесшим НИ, не влияло на эффекты неонатальной изоляции на 15 день жизни. Однако на 48 день жизни у животных, подвергавшихся НИ и получавших инъекции семакса, отмечалась тенденция к повышению уровня глюкозы в крови по сравнению с группой "НИ 2" (р=0.09).
Влияние неонатальной изоляции и семакса на содержание глюкозы в крови крысят в возрасте 15 и 48 дней. Семакс вводили и/н в дозе 0.05 мг/кг ежедневно с 1 по 14 дни жизни крыс. Число животных в группе: для ПНД15 п (конт 2А) = 17; п (НИ 2) = 12; п (НИ-сем 2) = 16; для ПНД 48 п (контр 1) = 11; п (НИ 2) = 11; п (НИ-сем 2) = 12. Значимое отличие от группы конт 2д (р 0.05) отмечено ,
При изучении влияния неонатального введения семакса в течение 1-2 недель жизни на содержание глюкозы в крови крысят, не подвергавшимся НИ, не было зарегистрировано достоверного взаимодействия между факторами "пол" и "группа" для крыс в возрасте 15 (F(l,31)=0.25, р=0.62) и 48 (F(l,26)=0.55, р=0.47), что позволило представить результаты, полученные по группе животных обоего пола. Также не было отмечено значимого влияния фактора "группа" при измерении уровня глюкозы на 15 (F(l,31)=0.39, р=0.54) и 48 (F(l,26)=2.08, р=0.16) дни жизни крыс (рис. 32).
Следовательно, введение семакса в течение 1-2 недель жизни крыс, не подвергавшихся НИ, не влияло на уровень глюкозы крыс в возрасте 15 и 48 дней. Таким образом, у животных, подвергавшихся ежедневной неонатальной изоляции в течение 1 -2 недель жизни, наблюдается снижение содержания глюкозы в крови на 15 день жизни, т.е. через сутки после окончания последней процедуры изоляции. Введение семакса не влияет на содержание глюкозы в крови 15-и дневных крыс как подвергавшихся, так и не подвергавшихся НИ. На 48 день жизни (через 2 недели после окончания процедуры изоляции) у животных, перенесших НИ, сохраняется пониженное содержание глюкозы относительно контрольных значений. При этом введение семакса приводит к незначительному повышению этого показателя по сравнению с группой крыс, перенесших НИ и не получавших инъекции препарата. Следовательно, пептид незначительно ослабляет последствия неонатального стресса.
Оценка ориентировочно-исследовательской активности, уровня тревожности и депрессивных составляющих поведения крыс
Ориентировочно-исследовательская активность и уровень тревожности животных оценивали в бесстрессорной и стрессогенной модификации теста "открытое поле" (ОП) на 30 и 61 дни жизни соответственно, а также в тесте "приподнятый крестообразный лабиринт" (ПКЛ) на 31 и 60 дни жизни. Депрессивные составляющие поведения крыс оценивали в тесте "принудительное плавание" на 47 день жизни.
Влияние НИ и введения семакса в течение 1 -2 недель жизни крыс на параметры поведения в бесстрессорной модификации теста ОП на 30 день постнатального развития В возрасте 30 дней в первой серии не было зарегистрировано взаимодействия факторов "пол" и "группа" (F(26,142)=0.59, р=0.94) для параметров поведения в бесстрессорной модификации теста ОП. Достоверного влияния фактора "группа" на параметры поведения в данном тесте также не было выявлено (F(26,142)=0.71, р=0.847). В обеих группах животных, перенесших НИ, отмечалось значимое увеличение пробега в первые 30 секунд тестирования относительно контрольных значений ("конт 2А": 9,7±0,8; "НИ 2": 11,4±0,8; "НИ-сем2": 12,2±0,9). По остальным параметрам отличий во всех трех группах зарегистрировано не было (рис. 33).
Оценка ориентировочно-исследовательской активности, уровня тревожности и депрессивных составляющих поведения крыс
Суммируя данные, полученные в 4 части работы, можно заключить, что введение флувоксамина с 1 по 14 дни жизни приводило к замедлению соматического роста крысят. Влияние препарата на данный показатель было отставленным - отличие от контроля становилось достоверным только к 42 дню жизни и сохранялось до 56 дня жизни. При этом у крысят, получавших инъекции флувоксамина, глаза открывались в более раннем возрасте, чем у животных, получавших инъекции воды. Известно, что хроническое введение селективного блокатора обратного захвата серотонина приводит к повышению времени нахождения этого медиатора в синаптической щели и, в результате, увеличению его воздействия на рецепторы [Maciag et al., 2005]. Известно, что в период активного развития нервной системы моноамины играют роль трофических факторов. Серотонин является сигнальным фактором в процессах клеточной пролиферации и дифференцировки в ЦНС [Verney et al., 2002]. Показано, что в критический период развития мозга (у крыс с 18 дня пренатального до 22 дня постнатального развития) уровень серотонина и триптофан гидроксилазы в ядрах шва возрастает в 35 раз [Rind et al., 2000]. Можно предположить, что увеличение активности серотонинергической системы в этот период приведет к ускорению развития. Вероятно, именно с этим связано более раннее открытие глаз в группе крыс, получавших флувоксамин. В течение первых двух недель жизни, на фоне введения флувоксамина, и в последующие две недели крысята, получавшие SSRI, несколько отставали от контроля по массе тела, но отличие это не достигало уровня достоверности. Однако после 31 дня жизни отставание по массе от контроля увеличивается и к возрасту 56 дней достигает 25 г. Следует отметить, что в возрасте 31 день крысят отделяли от матери и они переходили на самостоятельное питание. Согласно данным литературы, неонатальное введение SSRI влияет на пищевое поведение животных [Ansorge et al., 2004], а также вызывает ангедонию [Рора et al., 146 2008]. Можно предположить, что зарегистрированное нами замедление роста крысят, получавших флувоксамин, также связано с изменением пищевого поведения крыс.
Введение флувоксамина приводило к повышению тревожности и снижению исследовательского поведения в бесстрессорной и стрессогенной модификациях теста ОП, в тесте ПКЛ и О-лабиринт. Данный эффект сохранялся до 2-месячного возраста. Влияния неонатального введения флувоксамина на депрессивные компоненты поведения в тесте "принудительное плавание" выявлено не было. Отмеченные изменения эмоционального состояния животных, получавших флувоксамин, близки к изменениям поведения, зарегистрированным у крыс, перенесших неонатальную изоляцию.
Введение флувоксамина ухудшало способность крысят к обучению с положительным подкреплением и сохранение навыка в тесте на обучение с отрицательным подкреплением.
Хроническое и/н введение семакса с 15 по 28 дни жизни ослабляли влияние флувоксамина на массу тела животных, практически полностью снимало протревожный эффект флувоксамина в ПКЛ и в О-лабиринте, ослабляло эффекты флувоксамина в ОП. Семакс не снимал негативное влияние флувоксамина на обучение с отрицательным подкреплением и ослаблял влияние на обучение с положительным подкреплением.
Первые три части нашей работы посвящены изучению эффектов неонатальной изоляции крыс в период с 1 по 14 дни постнатального развития и оценке возможности коррекции негативных эффектов НИ с помощью и/н введения семакса в разные сроки. Во всех трех сериях была использована одинаковая методика НИ, однако эффекты различались в разных сериях. Сравнение основных эффектов НИ в трех сериях показало, что: 1) во всех трех сериях НИ в период с 1 по 14 дни жизни приводила к задержке физического развития крысят, что проявлялось в задержке соматического роста и более позднему открытию глаз. 2) поведенческие эффекты НИ различались в разных сериях. В первой серии наблюдалось ярко-выраженное снижение исследовательской активности и повышение тревожности в возрасте 1 и 2 месяцев у животных, подвергавшихся НИ. Во второй серии у животных, подвергавшихся НИ, отмечалось лишь снижение исследовательской активности в ПКЛ в возрасте 1 месяца. В третьей серии НИ вызывала повышение тревожности у самцов в возрасте 1 месяца и, напротив, повышало исследовательскую активность животных в возрасте 2 месяцев. Влияние на депрессивные компоненты поведения было отмечено только в первой серии - НИ приводила к повышению депрессивности животных. 3) Влияние НИ на способность животных к обучению было зарегистрировано только в третьей серии. В данном случае НИ оказывала положительное воздействие на обучение с положительным подкреплением.
Такая разница эффектов НИ может быть связана с, казалось бы, незначительными различиями в экспериментальных манипуляциях, которым подвергались животные в разных сериях. Так в первой серии крысята получали и/н инъекции в течение 3-4 недель постнатального развития, во второй серии - в течение 1-2 недель, в третьей серии крысята не подвергались никаким манипуляциям, кроме НИ.
Влияние НИ на изменение массы тела, уровень глюкозы в крови и возраст открытия глаз было практически одинаковым во всех сериях. Так, масса тела животных контрольных групп в возрасте 63 дня значимо не отличалась друг от друга. В группах животных, перенесших НИ, масса тела в этом возрасте была на 11-15% ниже контрольных значений, значимых отличий между этими группами отмечено не было (рис. 69). Следовательно, во всех трех сериях было зарегистрировано негативное влияние использованного неонатального стресса на физическое развитие крыс.
Оценка ориентировочно-исследовательской активности, уровня тревожности и депрессивных составляющих поведения крыс
Оценка влияния введения семакса с 1 по 14 день жизни животным, не подвергавшимся НИ, не выявила взаимодействия факторов "пол" и "группа" в данном тесте (F(13,10)=0.71, р=0.72).
На 61 день жизни в стрессогенной модификации теста "открытое поле" у нестрессированных животных, получавших инъекции семакса, было отмечено увеличение пробега, а также тенденция к увеличению числа стоек (р=0.08), отходов от стенок арены (р=0.09) и выходов в центр арены (р=0.09), что говорит о повышении исследовательской активности у животных данной группы (рис. 40).
Таким образом, НИ и введение семакса на фоне НИ не влияли на поведение животных в стрессогенной модификации ОП на 61 день жизни, в то время как введение семакса нестрессированным животным приводило к некоторому увеличению исследовательской активности в данном тесте.
Влияние семакса на параметры поведения в стрессогенной модификации теста "открытое поле" на 61 день постнатального развития. Семакс вводили и/н в дозе 0.05 мг/кг ежедневно с 1 по 14 дни жизни крыс. Число животных в группе: п (конт 2Б)=27; П (сем 2)=31. Значимое отличие от группы конт 2Б (р 0.05) отмечено .
Влияние НИ и введения семакса в течение 1-2 недель жизни крыс на параметры поведения в тесте "принудительное плавание" на 47 день постнатального развития
Для показателей длительность клайминга (F(2,66)=3.32, р=0.04) и длительность иммобилизации (F(2,66)=3.82, р=0.03) было выявлено достоверное взаимодействие факторов "пол" и "группа". Поэтому влияние НИ и семакса на поведение в тесте "принудительное плавание" проанализировано отдельно для подгрупп самцов и самок.
НИ не вызывала значимого изменения параметров поведения в тесте "принудительное плавание" ни у самцов, ни у самок крыс. Эффекты введения семакса на фоне неонатального стресса в данном тесте различались у самцов и самок. В подгруппе самцов у животных, получавших инъекции семакса на фоне стресса, было отмечено увеличение длительности клайминга и уменьшение длительности иммобилизации по сравнению с контролем, а также увеличение длительности активного плавания, увеличение числа актов активного плавания и тенденция (р=0.06) к уменьшению длительности иммобилизации по сравнению со стрессированными животными, получавшими инъекции воды (рис. 41).
В подгруппе самок, напротив, у стрессированных животных, получавших семакс, наблюдалось уменьшение длительности клайминга увеличение длительности иммобилизации по сравнению с крысятами, подвергавшимися НИ и получавшими инъекции воды (рис. 41).
Введение семакса нестрессированным животным не влияло на параметры поведения животных в тесте "принудительное плавание" (рис. 42).
Таким образом, НИ в течение 1-2 недель жизни не влияла на депрессивные составляющие поведения животных в тесте "принудительное плавание" в возрасте полутора месяцев. Введение семакса нестрессированным животным в этот период было
Влияние использованных воздействий на способность животных к обучению с отрицательным и положительным подкреплением оценивали в тесте выработки условной реакции пассивного избегания болевого раздражителя (УРПИ) и в тесте выработки реакции на место в сложном пищевом лабиринте ("сложный лабиринт") соответственно.
Обучение в тесте УРПИ проводили на 34 день жизни, проверку выработки навыка и проверку сохранения навыка на 37 и 41 день жизни соответственно. Обучение в сложном лабиринте проводили с 42 по 46 день жизни, проверку сохранения навыка осуществляли на 53 день жизни.
В данной серии для параметров поведения, характеризующих способность к обучению в тесте УРПИ, не было зарегистрировано достоверного взаимодействия между факторами "пол" и "группа" (F(26,102)=1,21, р=0,24), что позволяет представить результаты по всей группе животных. Влияния фактора "группа" также не наблюдалось (F(26,102)=0.82, р=0.72). Следовательно, НИ, так же как и введение семакса на фоне НИ в первые недели жизни не влияла на способность к обучению с отрицательным подкреплением. Эффектов НИ не было отмечено ни при проверке выработки навыка через 3 дня после обучения, ни при проверке сохранения навыка через неделю после обучения. Введения семакса на фоне НИ также не влияло на способность к обучению в данном тесте (рис. 43).
Анализ влияния неонатального введения семакса в течение 1-2 недель жизни крысятам, не подвергавшимся НИ, на параметры поведения в тесте УРПИ не показал достоверного взаимодействия факторов "группы" и "пол" (F(13,40)=0.79, р=0.67), поэтому результаты приведены совместно для самцов и самок. Применение ANOVA-метода не выявило достоверного влияния фактора "группа" на параметры поведения в тесте УРПИ (F(13,40)=0.84, р=0.62), однако дальнейший анализ с использованием
конт 2А НИ 2 03 НИ-сем Рис. 43. Влияние неонатальной изоляции и семакса на параметры обучения в тесте УРПИ. Семакс вводили и/н в дозе 0.05 мг/кг ежедневно с 1 по 14 дни жизни крыс. Число животных в группе: п (конт 2д)=22; п (НИ 2)=22; п(НИ-сем 2)=27. ЛП1 -латентный период захода в темный отсек в день обучения, ЛП 2 - латентный период захода в темный отсек при проверке выработки условной реакции. непараметрических методов показал, что введение семакса в течение 1 -2 недель жизни приводил к увеличению разницы ЛП захода в темный отсек при обучении и при проверке выработки навыка, что свидетельствует о положительном эффекте семакса на обучение (рис. 44). Следовательно, введение семакса в 1-2 недели жизни животным, не подвергавшимся НИ, оказывало положительное действие на выработку навыка пассивного избегания.
