Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время в организме человека и животных обнаружены сотни эндогенных олигопептидов. Короткие пептиды действуют на всех уровнях межклеточной сигнализации - от ауто- и пара-кринного до гормонального. В нервных клетках пептиды могут служить ней-ромедиаторами или модуляторами действия медиаторов иной химической природы (Ашмарин, 1996). Некоторые пептиды, обладающие биологической активностью, не являются эндогенными, а всасываются в кровь через слизистую кишечника после неполного расщепления белков пищи (Hartmann, Mei-sel, 2007). Доля пептидов среди продуктов ферментативного расщепления белков особенно велика в кишечнике грудных детей в связи с возрастными особенностями пищеварения (Зуфаров, 1998).
Одной из наиболее активно изучаемых групп регуляторных пептидов является семейство опиоидов. Эндогенные опиоидные пептиды играют важную роль в контроле болевой чувствительности, врожденных поведенческих реакций, обучения и других функций центральной и периферической нервной системы. Опиоидные пептиды, попадающие в организм с пищей, объединяются под общим названием «экзорфины». У ряда опиоидных пептидов обнаружены не только эффекты, проявляющиеся сразу после введения, но и отставленное действие, регистрируемое через несколько недель и даже месяцев после получения пептида. Отставленные эффекты особенно выражены при хроническом введении пептида в раннем возрасте (Малиновская, 2001; Беляева, 2005, 2007).
Все опиоидные пептиды обладают рядом общих свойств, но отличаются друг от друга по первичной структуре и по сродству к разным типам опиоидных рецепторов, а следовательно, и по спектру физиологического действия. При изучении влияния пептидов на центральную нервную систему обычно используют интрацеребровентрикулярный (i.c.v.) способ введения, гарантирующий попадание рассматриваемого вещества в мозг в нужной дозе. Однако i.c.v. введение плохо подходит для изучения поведения, поскольку эксперимент включает хирургическую операцию по вживлению канюли, вызывающую сильный стресс у подопытных животных. В то же время внутри-брюшинная инъекция является одним из наименее травматичных способов введения веществ и при этом обеспечивает высокую их биодоступность. Данных о действии опиоидных пептидов на ЦНС при системном способе введения в литературе в настоящее время мало. При этом многие пептиды с высокой вероятностью являются потенциально пригодными для применения в фармацевтике в качестве препаратов для мягкой коррекции разнообразных нарушений, в том числе заболеваний нервной системы (Левицкая, Каменский, 2003). С другой стороны, при некоторых особенностях диеты избыток экзорфинов, попадающих в организм (особенно детский) с пищей, потенциально может оказывать нежелательные эффекты. Опиоидные фрагменты растительных пищевых белков рассматриваются в качестве факторов, способствующих развитию аутизма и даже синдрома внезапной остановки дыхания (Kidd et al., 2002). Это подтверждает актуальность изучения как немедленного (развивающегося в течение минут-часов после введения), так и отставленного (наблюдаемого через недели и даже месяцы) эффектов, наблюдаемых при системном введении различных опиоидных пептидов экспериментальным животным, в особенности - детенышам. Представляется важным, во-первых, подтвердить или опровергнуть наличие влияния пептидов на пове-
дение при выбранном способе инъекции; во-вторых, попытаться оценить баланс положительных и отрицательных (с точки зрения возможного применения в клинике) последствий введения пептидов на разных этапах постнаталь-ного развития.
Цель и задачи исследования. Целью представленной диссертационной работы явился анализ поведенческих эффектов трех олигопептидов опиоидной природы при однократном и хроническом системном (внутри-брюшинном) введении белым крысам на разных этапах постнатального развития. Исследовались пептиды YPFF-NH2 (эндогенный эндоморфин-2), YPFVV-NH2 (амидированный экзогенный пептид сойморфин) и FGGF-NH2 (амидированный N-концевой фрагмент эндогенного пептида ноцицептина). Изучались как немедленные (при остром введении), так и отставленные (при хроническом введении в первые 14 дней постнатального развития) эффекты пептидов. В работе были поставлены следующие задачи:
изучить влияние острого введения вышеуказанных пептидов на врожденные формы поведения (исследовательскую активность, уровень тревожности, поведенческие проявления депрессивности и болевую чувствительность) детенышей крыс и сравнить полученные результаты с последствиями острого введения этих же пептидов взрослым крысам;
изучить отставленное действие хронического введения пептидов в первые дни жизни на те же параметры врожденного поведения экспериментальных животных;
исследовать эффекты острого и хронического введения пептидов в экспериментах с обучением детенышей крыс новым навыкам;
установить участие опиоидных рецепторов в развитии обнаруженных эффектов пептидов с помощью фармакологических блокаторов этих рецепторов.
Научная новизна. Практически все полученные нами результаты можно классифицировать как новые и не имеющие аналогов в литературе. Работа является продолжением скрининга пептидных лигандов опиоидных рецепторов, начатого в нашей лаборатории еще в 1980-х годах.
Пептид FGGF-NH2, являющийся укороченным аналогом молекулы ноцицептина, исследован впервые. В литературе нет данных о действии этого пептида в экспериментах in vivo, хотя более длинные фрагменты молекулы ноцицептина активно изучаются. Такая модификация пептида была выбрана нами для работы, потому что малый размер молекулы увеличивает ее потенциальную способность преодолеть гемато-энцефалический барьер, а амиди-рование повышает устойчивость пептида к пептидазам, содержащимся в крови и тканевых жидкостях. Пептид сойморфин-5 из группы экзорфинов был обнаружен в 2007 году, и о его влиянии на организм до сих пор известно очень мало. В опытах на мышах показано анксиолитическое действие сой-морфина, а также его способность подавлять пищевую мотивацию (Ohinata et al., 2007; Kaneko et al, 2010). В нашей работе использовался амидированный аналог сойморфина-5. Эндогенный амидированный пептид эндоморфин-2 изучен достаточно подробно, но его эффекты при системном введении исследуются впервые. Учитывая литературные данные о действии эндоморфи-на при центральном введении, можно с большой вероятностью предсказать ожидаемые последствия системного введения этого пептида. Поэтому эндоморфин-2 можно рассматривать как вещество сравнения для двух других пептидов.
В представленной работе впервые показано, что все изученные пептиды при остром системном введении оказывают влияние на баланс ориентировочно-исследовательской активности и тревожности. При этом была выявлена общая для всех пептидов тенденция: подавление ориентировочно-исследовательской реакции (ОИР) у крысят в раннем возрасте, сменяющееся усилением ОИР в середине полового созревания (возраст 42 дня), отмечаемым и у взрослых животных. Для всех изученных пептидов при хроническом введении выявлено отставленное действие на способность крыс к обучению, зависимое от пола. Отрицательное влияние на обучение отмечалось чаще, чем положительное. Впервые обнаружено, что все три рассмотренных пептида при системном введении проявляют анальгетическое действие. Впервые показано, что на фоне налоксона поведенческие эффекты от системного введения всех трех изученных пептидов не проявляются, что подтверждает участие опиоидных рецепторов в реализации этих эффектов.
Несмотря на ряд общих закономерностей, большинство полученных результатов указывает на значительные отличия физиологической активности исследованных пептидов в сравнении друг с другом. Причиной этого, очевидно, являются различия их первичной структуры, а следовательно — разная селективность по отношению к потенциальным мишеням: опиоид-ным рецепторам д-, 5- и к-типов, а также к ноцицептиновому рецептору ORL! (и разным изо формам каждого типа рецепторов). В большинстве случаев направленность эффектов эндоморфина-2 и сойморфин-5-амида зависела от пола животных. В случае аналога ноцицептина также было отмечено влияние фактора пола животных на выраженность эффектов, но реже отмечалась разная направленность действия пептида на самцов и самок.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты позволяют значительно расширить представления о физиологической роли опиоидных пептидов разных групп. Показана способность амиди-рованных олигопептидов вызывать центральные эффекты при внутрибрю-шинном способе введения. Показано, что опиоидные пептиды при попадании в организм детенышей млекопитающих способны оказывать существенное нейротропное (изменяющее поведение) действие. В первую очередь, это относится к уровню исследовательской активности, тревожности, а также способности к обучению. В значительной части случаев это действие имеет отставленный характер, проявляется через несколько недель после окончания введения пептида и сохраняется в течение длительного времени. Большинство обнаруженных эффектов оказались негативными с точки зрения применения в клинике (усиление тревожности, нарушение способности к обучению и др.) При исследовании немедленных последствий введения пептидов показана зависимость эффектов не только от пола, но и от возраста подопытных животных, что увеличивает объем имеющейся информации о возрастных изменениях опиоидной медиаторной системы. Практическая значимость представленной работы связана с выявлением ряда негативных отставленных эффектов от введения опиоидных пептидов в раннем возрасте. Это информация, которую следует учитывать при оценке побочного действия белковых компонентов искусственных смесей для питания новорожденных. Согласно полученным нами результатам, опиоидные пептиды, попадающие в организм в первые дни жизни, являются физиологически значимыми факторами, от присутствия которых зависит реализация многих важнейших поведенческих реакций детеныша. Известно, что даже достаточно длинные пептиды у ново-
рожденных детей всасываются из пищеварительного тракта в кровь в относительно больших количествах (Зуфаров, 1998). С учетом этого факта наши результаты подтверждают необходимость контроля за содержания в заменителях молока белков, содержащих опиоид-подобные последовательности (в частности, широко применяемых в смесях для детского питания соевых белков).
Основные положения, выносимые на защиту
-
Все изученные в работе пептиды при системном (внутрибрюшинном) введении способны изменять поведение животных. Это косвенно доказывает способность пептидов преодолевать гемато-энцефалический барьер.
-
Действие пептидов осуществляется с участием опиоидных и ORLi-рецепторов.
-
Действие пептидов при остром введении может иметь разную направленность в зависимости от пола и возраста животных.
-
При хроническом введении пептидов в первые дни жизни отставленные эффекты зависят от пола животных, но мало изменяются с возрастом, что позволяет предположить программирующее действие пептидов на созревание нервной системы крысят.
Апробация работы. Результаты представленного диссертационного исследования доложены и обсуждены на XIII школе-конференции молодых ученых по физиологии высшей нервной деятельности и нейрофизиологии (Москва, 2009), на IV, V и VI российских симпозиумах «Белки и пептиды» (Казань, 2009; Петрозаводск, 2011; Уфа, 2013), XVI и XVII международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2009, 2010), 5-й Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2010), конференции «Физиологическая активность регуляторных пептидов» (Москва, 2010), 15-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2011), 23-м международном конгрессе ECNP (Амстердам, 2010), 11-й региональной конференции ECNP (Санкт-Петербург, 2011), 8-м Международном форуме FENS (Барселона, 2012), IV Съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012), 24-й Международной конференции ISN/ASN (Канкун, 2013), а также на заседаниях кафедры физиологии человека и животных Биологического факультета МГУ.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования, их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 210 страницах, содержит 27 рисунков и 10 таблиц. Список литературы включает 332 источника, из них 26 отечественных.
