Введение к работе
Актуальность темы. Пиридоксаль-5'-фосфат-зависимые ферменты обладают уникальной способностью катализировать широкий спектр реакций в метаболизме аминокислот. На сегодняшний день известно более чем 140 различных ферментов, имеющих в качестве кофактора пиридоксаль-5 '-фосфат. Эти ферменты участвуют в синтезе, превращениях и деградации аминокислот и биогенных аминов, а также в синтезе тетрапиррольных соединений и метаболизме аминосахаров. Свидетельством их ключевой значимости в метаболизме биологически активных соединений является то, что пиридоксаль-5'-фосфат-зависимые ферменты используются в качестве мишеней при разработке лекарственных средств.
Пиридоксаль-5'-фосфат-зависимый метаболизм серосодержащих аминокислот играет важную роль в живой клетке. S-Аденозилметионин, синтезируемый из метионина, является одним из важнейших биорегуляторов. Он служит предшественником в биосинтезе полиаминов, спермина и спермидина, которые участвуют в процессах клеточного деления и донором метальных групп в различных реакциях их переноса. В частности, метилирование РНК необходимо для обеспечения процесса трансляции. В эукариотических клетках метилирование ДНК играет важную роль в таких процессах как транскрипция генов, конденсация хроматина, эмбриональное развитие. Метионин также является предшественником в синтезе пропионил-СоА, образующийся из которого сукцинил-СоА участвует в цикле Кребса, являющимся одним из основных процессов клеточного метаболизма.
Пиридоксаль-5'-фосфат-зависимая метионин - у-лиаза - фермент, участвующий в метаболизме серосодержащих аминокислот, который катализирует реакцию расщепления метионина с образованием метилмеркаптана, аммиака и а-кетобутирата. Наличие метионин - у-лиазы в патогенах - бактериях и одноклеточных эукариотах и отсутствие ее в клетках животных и человека обусловливает перспективность использования этого фермента в качестве биохимической мишени для создания новых антипатогенных лекарственных препаратов. Дизайн препаратов, ингибирующих фермент, требует знания структурно-функциональных аспектов механизма его действия.
Цели и задачи исследования.
Целью данной работы являлось изучение механизма реакции у-элиминирования L-метионина, катализируемой пиридоксаль-5'-фосфат-зависимой метионин - у-лиазой Citrobacter freundii. В работе решались следующие задачи: 1) определение стационарных кинетических параметров взаимодействия метионин - у-лиазы с рядом аминокислот -субстратов и потенциальных ингибиторов и исследование вклада стадий обмена С-а- и С-Р-протонов ингибиторов в ферментативную реакцию; 2) получение кристаллов
холофермента, дающих высокое рентгенографическое разрешение; 3) спектральная идентификация интермедиатов, образуемых ферментом с субстратами и ингибиторами в растворе и кристалле.
Научная новизна и практическая ценность работы.
Исследование кинетических параметров взаимодействия фермента с субстратами и
ингибиторами в растворе позволило предположить скорость-лимитирующую стадию
реакции у-элиминирования L-метионина. Получены кристаллы холофермента, дающие
разрешение 1,35 А. Впервые для пиридоксаль-5'-фосфат-зависимых ферментов
основание Шиффа пиридоксаль-5'-фосфата с аммиаком идентифицировано в кристаллах, полученных в присутствии сульфата аммония. Показано, что кристаллы холофермента каталитически компетентны и их комплексы с аминокислотами могут быть использованы для определения пространственных структур трех интермедиатов реакции у-элиминирования.
Апробация работы. Материалы работы были представлены на международной конференции «Vitamins, Coenzymes, and Biofactors» (Авайи, Япония, 2005 г.), на международной конференции «Biocatalysis - 2007: fundamentals and applications» (Москва - Санкт-Петербург, Россия, июнь 2007 г.), на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, Россия, май 2008 г.) и на международной конференции «Perspectives en Enzymologie» (Сант-Мало, Франция, июль 2008 г.).
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах,
включает рисунка, таблиц и содержит ссылок на литературные
источники. Диссертация состоит из глав: введение, обзор литературы, результаты работы и их обсуждение, методы исследования, выводы и список литературы.
