Содержание к диссертации
Стр.
ВВЕДЕНИЕ 9
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 16
1.1. МИТОХОНДРИАЛЬНАЯ ДНК ЖИВОТНЫХ КАК
ПОТЕНЦИАЛЬНЫЙ ОБЪЕКТ ДЛЯ СОЗДАНИЯ
ЧЕЛНОЧНЫХ ВЕКТОРОВ 16
1.1.1. СТРУКТУРА И ФУНКЦИЯ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО
ГЕНОМА 16
Организация мтДНК 16
Число молекул мтДНК в клетках животных. Феномен гетероплазмии 17
Наследование мтДНК 18
Организация мтДНК в клетке 19
Тонкая структура мтДНК 20
Структура Н-цепи мтДНК 23
Структура L-цепи мтДНК 25
Митохондриальный генетический код 26
Видовые особенности организации митохондриальных геномов 27
Репликация мтДНК животных 28
1.1.1.7.1. Инициация репликации Н-цепи мтДНК 2 8
1.1.1.7.1.1. Ферменты, принимающие участие в инициации
репликации мтДНК 30
1.1.1.7.2. Инициация синтеза L-цепи мт ДНК 31
1.1.1.7.3. Trans-активирующие факторы, принимающие участие в
росте и созревании вновь синтезированных цепей ДНК 32
1.1.2. ЭКСПРЕССИЯ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ГЕНОМА 34
1.1.2.1. Транскрипция мтДНК 3 4
Ферменты и некоторые факторы, обеспечивающие транскрипцию мтДНК 35
Инициация транскрипции мтДНК 37
Процессинг первичного транскрипта мтДНК 39
Дифференциальная экспрессия митохондриальных генов 40
*
1.1.2.2. Биосинтез белков в митохондриях 41
Особенности трансляции в митохондриях 41
Митохондриальные факторы трансляции 43
1.1.2.3. Митохондриальные болезни 44
1.1.2.3.1. Создание моделей для изучения некоторых
митохондриальных патологий 46
1. 2. СИСТЕМЫ, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИЕ ПЕРЕНОС И
РЕАЛИЗАЦИЮ ЧУЖЕРОДНЫХ ГЕНОВ В
КЛЕТКАХ ЖИВОТНЫХ 48
ЧЕЛНОЧНЫЕ ВЕКТОРЫ 48
Векторы для межродового переноса ДНК у бактерий 49
Векторы для клонирования ДНК в системе
бактерии-дрожжи 50
Векторы типа Yip 51
Векторы типа Yep 51
Векторы типа Yrp 52
Векторы типа Yep 52
В екторы типа YAC 5 3
Челночные векторы для системы клетки Е. coli - клетки
животных 54
Репликон вируса SV40 54
Репликон вируса папилломы быка (BPV) 55
Репликон вируса Эпштейна-Барр (EBV) 56
Векторы на основе ретровирусов 57
Аденовирусные векторы 59
ТРАНСФОРМАЦИЯ ЖИВОТНЫХ КЛЕТОК И
СИСТЕМЫ ДОСТАВКИ ГЕНОВ 61
Основные методы трансформации животных клеток 62
Кальций фосфатный метод 62
Электропорация 63
Баллистическая трансфекция 64
Трансфекция с помощью вирусных векторов 65
Искусственные макромолекулярные системы
трансфекции 66
»
1.2.2.2. Системы доставки чужеродной ДНК, используемые
в генной терапии 66
1.2.2.3. Введение генов в половые клетки. Получение
трансгенных животных 68
2. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ
ОБСУЖДЕНИЕ 70
2.1. МИТОХОНДРИАЛЬНАЯ ДНК - ВОЗМОЖНЫЙ
ВЕКТОР ДЛЯ ПЕРЕНОСА ГЕНЕТИЧЕСКОЙ
ИНФОРМАЦИИ 70
2.1.1. Материалы и методы 71
Материалы 71
Методы 71
Выделение митохондриальной ДНК из печени крысы 71
Мечение фрагментов ДНК изотопом I 73
Трансформация клеток Sacharomyces cerevisiae 74 II. 1.2. Исследование активности митохондриального
репликона в бактериальной системе при наличии
плазмидного репликона 74
Конструирование рекомбинантных плазмид, содержащих фрагмент мтДНК крысы и ДНК плазмиды pBR322 75
Трансформация клеток Е. coli polAl и роІАб ДНК pBR-MtB-A 77
Трансформация клеток Е. coli ро1А12 (ts-мутанты KS55)
ДНК pBR-MtB-A 80
2.1.2.4. Исследование сохранения вставки мтДНК крысы в
клетках Е. coli штаммов polA, трансформированных
ДНК pBR-MtB-A 82
2.1.2. Изучение функционирования рекомбинантных плазмид
на основе мтДНК в бактериальных клетках при
отсутствии плазмидного репликона 88
2.1.3.1. Конструирование рекомбинантной ДНК рмтКС,
содержащей фрагмент мтДНК крысы и
бактериальный ген устойчивости к канамицину 88
2.1.3.2. Анализ структуры рекомбинантной плазмиды pmtKC 1 90
2.1.4. Перенос бактериальных генов устойчивости к
антибиотикам рекомбинантными плазмидами на
основе мтДНК крысы 94
2.1.5. Изучение экспрессии некоторых продуктов мтДНК при
клонировании фрагментов мтДНК в клетках бактерий 97
2.1.5.1. Синтез полипептидных цепей цитохромоксидазы крысы в
клетках Escherichia coli 97
2.1.5.2. Экспрессия гена апоцитохрома b крысы в клетках
Escherichia coli 104
2.1.6. Создание векторов для низших эукариотов (дрожжей) на
основе фрагментов мт ДНК крысы 110
Конструирование ДНК pYMt 1, содержащей фрагмент мтДНК крысы и дрожжевой ген 1еи2 110
Функционирование ДНК pYMt 1 в дрожжевых клетках 112
2.1.6.3. Стабильность ДНК pYMtl в клетках дрожжей 114
2.2. ПЕРЕНОС ЧУЖЕРОДНОЙ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ
ИНФОРМАЦИИ В КЛЕТКИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ 122
2.2.1. Перенос чужеродной ДНК в соматические клетки
ивотных 122
2.2.1.1 Материалы и методы 123
Материалы 123
Методы 124
Трансформация ККМ методом кальций фосфатной преципитации и культивирование трансформированных клеток 124
Выявление ККМ, трансфецированных плазмидной ДНК 125
Обнаружение Т-антигена вируса SV40 в трансфецированных ККМ 126
Определение активности тимидинкиназы вируса герпеса
в трансформированных ККМ 126
Определение тимидина в биологической пробе 127
Выявление клеточной и вирусной тимидинкиазы в
клетках селезенки трансгенных мышей 128
2.2.1.2. Трансформация клеток костного мозга грызунов
рекомбинантной плазмидой pBRSV 129
2.2.1.2.1. Эффективность трансформации ККМ плазмидной ДНК
и стабильность трансформированных клеток 129
2.2.1.2.2. Исследование функциональной активности плазмидной
ДНК в трансформированных клетках 133
2.2.1.3. Доминантная селекция тимидином
трансформированных клеток костного мозга животных 137
2.2.1.3.1. Выявление in vitro ККМ, содержащих ген
тимидинкиназы вируса герпеса, при
доминантной селекции тимидином 137
2.2.1.3.2. Выявление in vivo ККМ, содержащих ген
тимидинкиназы вируса герпеса, при доминантной
селекции тимидином 139
2.2.2. Перенос чужеродной генетической информации в
половые клетки животных 144
2.2.2.1. Материалы и методы 144
Материалы 144
Методы 145
Трансфекция плазмидной ДНК в клетки спермиев 145
Получение меченых радиоизотопами ДНК плазмид 145
Получение трансгенных животных 145
Анализ сыворотки крови трансгенных крыс 146
2.2.2.1. Исследование возможности введения чужеродной
ДНК в половые клетки самцов мышей 146
2.2.2.1.1. Получение сперматозоидов и введение в них
чужеродной ДНК 146
Введение в сперматозоиды плазмидной ДНК, адсорбированной на Са-Р - кристаллах. 147
Обсуждение полученных данных в
свете возможности использования спермиев для
целевой доставки чужеродных генов 151
2.2.2.2. Перенос генетической информации в яйцеклетку
животных. Экспрессия гена а-1-антитрипсина (ААТ)
«
»
человека у трансгенных крыс 158
2.2.2.2.1. Создание рекомбинантных ДНК, содержащих
последовательности полноразмерной ААТ-кДНК
человека 160
2.2.2.2.2. Экспрессия а-1-антитрипсина человека у трансгенных
крыс 162
2.2.2.2.3. Анализ потомства на содержание последовательностей
кДНК ААТ человека 163
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 168
ВЫВОДЫ 180
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 182
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В ТЕКСТЕ
ААТ АТФ АТФ-аза
кДНК
мтДНК
НАДН
мРНК
рРНК
тРНК
п.н.
т.п.н.
Apr, Aps
Cmr, Cms
Kmr, Kms
Tcr, Tcs
Ori OXPHOS-
патологии
rk"mk", rk+mk+
a-1 -антитрипсин
аденозинтрифосфорная кислота
митохондриальная олигомицинчувствительная
АТФ-синтетаза
комплементарная дезоксирибонуклеинова кислота
митохондриальная дезоксирибонуклеиновая кислота
клетки костного мозга
мегадальтон
никотинамидадениннуклеотид
матричная (информационная) рибонуклеиновая кислота
рибосомная РНК
транспортная РНК
пара нуклеотидов
тысяча пар нуклеотидов
тимидинкиназа
признаки фенотипа, определяющие устойчивость (resistance) или чувствительность (sensibility) бактериальных клеток к антибиотикам ампициллину, хлорамфениколу, канамицину и тетрациклину соответственно точка инициации репликации ДНК
болезни, вызываемые различными нарушениями в митохондриальной системе окислительного фосфорилирования (oxidative phosphorylation system) обозначения, указывающие на отсутствие (-) или наличие (+) в бактериальных клетках компонентов системы рестрикции-модификации (R-M системы)
«
Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время трансгеноз (перенос и реализация генетической информации) превращается в стратегическое направление исследований, дающее ответы на множество фундаментальных вопросов. Трансгеноз представляет универсальный методический подход к исследованиям отдельных этапов сложных многостадийных процессов и их взаимосвязи. В настоящее время разрабатываются и совершенствуются методы, накапливается и систематизируется информация о работе основных молекулярно-генетических систем в организме (системы репликации, транскрипции и трансляции). Данные по изучению функционирования репликонов, промоторов, энхансеров, механизмов действия транскрипционных факторов, а также многих других механизмов реализации генетической информации создают фундамент разработки новых подходов для решения проблем биологии и медицины. Трансгеноз применяют в иммунологии, эмбриологии, нейрологии, при изучении механизмов кроветворения, в исследовании факторов, определяющих рост и дифференцировку мультипотентных стволовых клеток, и, наконец, при анализе механизмов канцерогенеза. Помимо решения фундаментальных медико-биологических проблем, с помощью трансгеноза пытаются создавать новые породы животных и растений, которые могут стать дополнителдьным источником получения фармакологических препаратов и пищевых продуктов. Развитие такого нового направления в медицине, как генная терапия, во многом зависит от достижений теоретических и экспериментальных исследований в области трансгеноза. Поэтому каждый научный факт, полученный при проведении исследований по изучению процессов передачи и реализации чужеродной генетической информации, ценен и будет востребован.
На протяжении нескольких последних десятилетий в Лаборатории биохимической генетики, а затем в Отделе молекулярной генетики, Института экспериментальной медицины РАМН проводились систематические исследования молекулярно-генетических механизмов, лежащих в основе ряда наследственных болезней человека (гепатолентикулярная дегенерация или болезнь Вильсона-Коновалова, муковисцидоз, недостаточность а-1-антитрипсина, семейная гиперхолестеринемия и др.). Общее развитие таких исследований потребовало разработки новых и совершенствования уже
общепринятых методов для переноса генов и их экспрессии в клетках- или организмах-реципиентах. В связи с этим в конце 70-х годов руководитель лаборатории С.А. Нейфах, чл.-корр. АМН СССР, инициировал разработку новых векторных систем для клонирования и исследования генов животных и человека, а также систем доставки чужеродной генетической информации в соматические и половые клетки животных, обеспечивающих направленное полноценное функционирование переносимых генов. Клонирование генов животных и человека как тогда, так и теперь требует создания полифункциональных, челночных, векторов, способных обеспечивать репликацию рекомбинантных ДНК в организмах, принадлежащих к разным биологическим видам.
Многолетнее, с начала 60-х годов, изучение тонкой структуры митохондриальной ДНК (мтДНК) животных, ее физическое и функциональное картирование привели к идее создать челночные векторы на ее основе. Особенности природы мтДНК, ее структура и механизмы функционирования реально могли обеспечить эффективную амплификацию клонируемых генов в бактериях и, далее, адекватную реализацию встроенной генетической информации в клетках эукариотов. Последнее требовало подбора и разработки различных методов доставки чужеродной ДНК в соматические и половые клетки животных.
Цель работы. Исследование возможности создания челночных векторов на основе мтДНК животных для клонирования генов в клетках прокариотов и эукариотов, а также разработка и совершенствование методов доставки в различные клетки животных чужеродной генетической информации с целью ее полноценной реализации.
Для ее достижения были поставлены задачи исследования:
1. Создать генно-инженерные конструкции, содержащие различные
последовательности мтДНК крысы, а также последовательности ДНК
бактериальных плазмид и маркерные гены дрожжей, позволяющие проводить
исследования их функционирования в системах прокариотов и низших
эукариотов.
2. Исследовать способность митохондриального репликона обеспечивать
репликацию рекомбинантной ДНК в клетках прокариотов: а) в присутствии
плазмидных репликативных элементов в бактериальных клетках, дефектных по
ДНК-полимеразе І; б) при отсутствии в составе ДНК Огі плазмид, в) в клетках низших эукариотов - дрожжах.
3. Проверить возможность использования бактериальных маркеров устойчивости
к антибиотикам для селекции клеток прокариотов, содержащих рекомбинантные
ДНК с последовательностями мтДНК животных, а также ауксотрофных
дрожжевых маркерных генов в случае функционирования исследуемых ДНК в
клетках низших эукариотов.
4. Проанализировать структуру и определить локализацию изучаемых
рекомбинантных ДНК, содержащих фрагменты мтДНК крысы, при их
клонировании в исследуемых клетках бактерий и дрожжей.
Исследовать возможность экспрессии некоторых митохондриальных генов, входящих в состав изучаемых рекомбинантных ДНК, в бактериальных клетках.
Применить и совершенствовать метод трансформации клеток костного мозга (ККМ) плазмидными ДНК для разработки методов доставки чужеродных генов и изучения их экспрессии в клетках животных in vitro и in vivo.
Выяснить возможность введения чужеродной ДНК в половые клетки самцов с целью дальнейшей разработки спермий-опосредованной доставки исследуемых генов в клетки-мишени.
Используя метод микроинъекции ДНК в оплодотворенную яйцеклетку, как один из способов доставки чужеродных генов, получить трансгенных животных, в которых происходит экспрессия гена а-1-антитрипсина человека под контролем промоторных элементов гена металлотионеина мыши.
Основные положения, выносимые на защиту. 1. Природа, структурная и функциональная организация митохондриальной ДНК животных дают реальные предпосылки создания на ее основе челночных векторов для переноса чужеродной генетической информации:
а) мтДНК крысы имеет ряд участков узнавания для эндонуклеаз
рестрикции, что позволяет практически полностью клонировать ее
последовательности в составе рекомбинантных плазмид, а, следовательно,
позволяет вести направленный подбор необходимых фрагментов ДНК,
содержащих определенные функциональные единицы;
б) митохондриальный репликон животных способен обеспечивать
репликацию рекомбинантных плазмид в бактериальных клетках в условиях,
когда плазмидный репликон не функционирует или полностью отсутствует;
в) репликативные элементы мтДНК крысы обеспечивают эффективную
репликацию рекомбинантных ДНК в клетках низших эукариотов - дрожжах;
г) маркерами для селекции клеток, трансформированых рекомбинантными
ДНК, которые содержат фрагменты мтДНК животных, могут служить
бактериальные гены устойчивости к антибиотикам, дрожжевые маркерные гены,
а также продукты митохондиальных генов, входящие в состав используемых
последовательностей мтДНК.
2. При трансформации клеток костного мозга методом Са-фосфатной
преципитации ДНК отбор клеток-трансформантов можно производить в
неселективных условиях, используя ДНК с однозначно детектируемыми
маркерами или с применением метода доминантной селекции.
3. Чужеродная ДНК может быть инкорпорирована в половые клетки самцов, что
дает возможность рассматривать спермин как средство доставки необходимых
чужеродных генов в экспериментах по трансгенозу.
4. Методом инъекции ДНК в оплодотворенную яйцеклетку получены
трансгенные животные, у которых в двух поколениях определялось наличие
последовательностей кДНК а-1-антитрипсина человека и в первом поколении
отмечена экспрессия исследуемого белка.
Научная новизна настоящей работы состоит в следующем:
1. Сконструированы и проанализированы рекомбинантные плазмидные ДНК,
содержащие различные фрагменты мтДНК крысы, последовательности
бактериальных плазмидных ДНК, а также последовательности дрожжевых
маркерных генов.
2. Впервые показано, что митохондриальный репликон обеспечивает
репликацию гибридных плазмид, содержащих фрагменты мтДНК крысы: а) в
клетках прокариотов в условиях, когда плазмидный репликон не работает или
отсутствует; б) в клетках низших эукариотов - дрожжах.
Установлено, что для селекции рекомбинантных плазмид, содержащих фрагменты мтДНК животных, обеспечивающие их репликацию, можно использовать: а) бактериальные гены устойчивости к различным антибиотикам; б) дрожжевые маркерные гены; в) гены митохондриальных полипептидов, входящие в клонированные последовательности мтДНК.
Обнаружено, что некоторые последовательности мтДНК крысы в процессе клонирования в бактериальных клетках элиминируются, в то время как большая
часть последовательностей этих ДНК успешно клонируется в составе бактериальных плазмид как под контролем собственных, так и плазмидных репликативных элементов.
Установлено, что рекомбинантная плазмида, содержащая участок инициации репликации мтДНК крысы, последовательности ДНК бактериальной плазмиды с Огі и генами устойчивости к антибиотикам, а также дрожжевой маркерный ген 1еи2, реплицируется в клетках дрожжей с эффективностью, сравнимой с репликацией дрожжевых плазмидных ДНК, содержащих дрожжевую 2 микронную ДНК.
Показано, что рекомбинантная плазмида, содержащая фрагмент мтДНК крысы и дрожжевой лейциновый ген встраивается в хромосому трансформированных дрожжевых клеток, не вызывая дестабилизацию и выщепления дрожжевого гена 1еи2 и сцепленных с ним маркеров 3-ей хромосомы.
Впервые при трансформации клеток костного мозга была использована методика Са-фосфатной преципитации ДНК и при этом в неселективных условиях получены стабильные результаты экспрессии вносимого Т-антигена вируса SV40
Предложен метод доминантной селекции трансформированных клеток костного мозга в присутствии тимидина.
Одновременно и независимо с аналогичными исследованиями в других лабораториях, показано, что чужеродная ДНК в соответствующих условиях инкорпорируется в клетки спермиев в постакросомальные части их головок.
10. Создана генно-инженерная конструкция, содержащая полноразмерную кДНК
а-1-антитрипсина человека под контролем промотора мышиного гена
металл отионеина.
11. Впервые были получены трансгенные крысы, в которых зафиксирована
экспрессия гена а-1-антитрипсина человека под контролем промотора гена
металлотионеина мыши.
Научно-практическое значение. Представленная работа носит в основном теоретический характер. Так, изучение возможности использования мтДНК крысы для создания челночных векторов выявило ряд фактов, касающихся репликации и экспрессии мтДНК в клетках бактерий и низших эукариотов. Митохондриальный репликон, используя ферментную систему бактерий и дрожжей, обеспечивает полноценную репликацию изучаемых рекомбинантных
ДНК и достаточную копийность таких гибридных молекул в исследуемых системах. Особенности репликации мтДНК животных, такие как наличие двух точек инициации репликации, расположенных в молекуле на значительном расстоянии друг от друга, требуют встраивания в рекомбинантные плазмиды примерно 2/3 митохондриального генома. А это, в свою очередь, обеспечивает транскрипцию значительной части митохондриальных генов, продукты которых могут служить маркерами при скриннинге трансформантов. Кроме того, эффективная репликация и транскрипция рекомбинантных плазмид на основе мтДНК животных позволяет использовать для отбора также бактериальные и дрожжевые маркеры. Всестороннее изучение структуры и функционирования рекомбинатых плазмид на основе мтДНК дает возможность разрабатывать эффективные челночные векторные системы для переноса чужеродной информации. Следует также отметить, что представленные структурные и функциональные особенности митохондриального генома и рекомбинантных ДНК на его основе могут быть использованы при создании моделей ряда митохондриальных болезней.
Значение данных, полученных в экспериментах с клетками костного мозга и трансгеннымих по а-1-антитрипсину человека животными определяется временем получения, а также их востребованностью на определенном этапе работ по переносу генетической информации и реализации ее в трансформированных клетках. Представленный нами метод отбора трансформантов по определению Т-антигенной активности ДНК с последовательностями ДНК вируса SV40, а также метод доминантной селекции тимидином может успешно применяться при анализе трансформантов в отсутствие у реципиентных клеток мутаций по какому-либо признаку.
Несомненно теоретическое значение данных, впервые полученных при изучении инкорпорирования чужеродной ДНК в мужские половые клетки. Спермин могут быть трансфецированы чужеродной ДНК. Этот факт побудил исследователей в ряде зарубежных лабораторий приступить к разработке спермий-опосредованного переноса чужеродных генов в клетки зародышей и репродуктивного тракта.
Апробация работы. Основные результаты, вошедшие в настоящую работу, докладывались на: 6-й Конференции биохимиков прибалтийских республик, БССР и Ленинграда, Рига, 1981; 4-ом двустороннем (СССР-ФРГ)
симпозиуме по структуре и транскрипции генома, Ереван, 1981; 2-ом Всесоюзном генетическом Съезде, Кишинев, 1982; Всесоюзном симпозиуме по применению достижений химии высокомолекулярных соединений в синтезе лекарственных препаратов, Рига, 1982; 2-ой Всесоюзной конференции "Рекомбинантные ДНК", Пущино-на-Оке, 1982; 5-ом Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов", Москва, 1983; 5-ом двустороннем симпозиуме (СССР-ФРГ) "Молекулярное разнообразие организации и экспрессии генома", Москва, 1983; Международном симпозиуме "Макромолекулы и функции клетки", Ереван, 1986; Всесоюзном Совещании "Биологии клетки в культуре", Москва, 1987; 9-ом Всесоюзном Симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра", Черноголовка, 1987;5-ом Всесоюзном Съезде генетиков и селекционеров, Москва, 1987; 2-ой Всесоюзной Конференции "Геном Человека", Переславль-Залесский, 1991.
Похожие диссертации на Разработка подходов для переноса и реализации чужеродной генетической информации
