Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Общая характеристика цианобактерий 9
1. Морфология, классификация и распространение в природе 9
2. Особенности метаболизма 12
3. Адаптация к недостатку питательных элементов в среде 15
Глава 2. Молекулярный водород в метаболизме микроорганизмов 17
1. Гидрогеназы 18
2. Метаболизм Нг у цианобактерий 26
2.1. Поглощающая гидрогеназа 28
2.2. Нитрогеназы 34
Глава 3. Обратимая гидрогеназа цианобактерий 37
1. Распространение и физиологическое значение 37
2. Организация генов и их экспрессия 41
3. Регуляция активности и синтеза 45
4. Биохимические и каталитические свойства 48
Глава 4. Объекты и методы исследования 53
1. Организмы и условия их культивирования 53
2. Методы исследования 57
2.1. Определение ростовых параметров 57
2.2. Определение гидрогеназной активности 58
2.3. Определение скорости образования и поглощения Н2 интактными клетками 59
2.4. Получение бесклеточных экстрактов и частичная очистка гидрогеназы 59
2.5. Аналитические методы 60
2.6. Молекулярно-биологические методы 60
2.6.1.ОчисткаДНКиРНК 60
2.6.2. Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами и электрофорез в агарозном геле 62
2.6.3 Создание праймеров и полимеразные цепные реакции 62
2.6.4. Гибридизация по Саузерну 63
2.6.5. Клонирование и создание частичных библиотек генов 65
2.6.6. Определение и анализ последовательностей нуклеотидов 66
2.7. Другие методы 71
2.8. Обработка данных и воспроизводимость измерений 71
Глава 5. Гидрогеназная активность G. alpicola 72
1. Влияние света и Ог 73
2. Влияние обеспеченности культуры азотом 74
3. Физиологические реакции гидрогеназы 79
Глава 6. Молекулярно-генетические свойства гидрогеназы G. alpicola 84
1. Идентификация и характеристика генов, кодирующих гидрогеназу G. alpicola 84
2. Анализ транскрипции hoxHn hoxYb условиях, благоприятных для развития
гидрогеназной активности 90
Глава 7. Каталитические свойства изолированной гидрогеназы G. alpicola 94
Глава 8. Метаболизм Нг у С. thermalis 104
1. Рост культуры и гидрогеназная активность 104
2. Идентификация и характеристика генов, кодирующих гидрогеназу С. thermalis 107
Глава 9. Обсуждение результатов 111
Выводы 118
Литература 120
Публикации по теме диссертации 140
- Морфология, классификация и распространение в природе
- Распространение и физиологическое значение
- Организмы и условия их культивирования
- Влияние обеспеченности культуры азотом
Введение к работе
Актуальность проблемы. Способность к поглощению и выделению молекулярного водорода обнаружена у микроорганизмов различных таксономических групп. Метаболические пути, в которых участвует H2, очень разнообразны, так же, как его функции в жизнедеятельности клеток. В последние годы, в связи с поиском альтернативных источников энергии, резко увеличилось количество исследований, посвященных метаболизму водорода. Н2 - один из наиболее перспективных кандидатов на роль экологически чистого и возобновляемого топлива будущего. Во многих странах разрабатываются методы синтеза водорода с помощью биосистем.
Метаболизм молекулярного водорода включает процессы восстановления FT и окисления Н2 в соответствии с простейшей химической реакцией:
2ІҐ + 2ЄІ5Н2.
В большинстве случаев она катализируется специфическими ферментами -гидрогеназами. Это очень древняя группа ферментов, сложность организации и функционирования которых контрастирует с внешней простотой осуществляемой ими реакции. Последняя рассматривается как прототип всех реакций, катализируемых металлоферментами. Таким образом, изучение гидрогеназ обладает не только прикладным, но и фундаментальным значением, поскольку помогает понять общие принципы ферментативного катализа и эволюции метаболических процессов.
Использование цианобактерий как возможных продуцентов Н2 особенно заманчиво, поскольку они образуют водород за счёт конверсии солнечной энергии и не требуют сложных дорогостоящих питательных сред. Цианобактерий располагают, по меньшей мере, тремя ферментами, ответственными за окисление Нг и/или восстановление протонов - нитрогеназой и двумя железо-никель-содержащими гидрогеназами. Нитрогеназа катализирует образование водорода как побочного продукта при восстановлении N2. Поглощающая гидрогеназа ре-утилизирует Нг, выделяющийся в клетках с активной нитрогеназой. Это мем-браносвязанная гидрогеназа, которую кодируют гены hupSL - гидрогеназа Нир-типа. Электроны от поглощающей гидрогеназы через цитохром передаются в пластохиноновый пул. Гидрогеназа, представляющая собой мультимерный фермент, который кодируют гены hoxEFUYH — гидрогеназа Нох-типа. Она не имеет отношения к фиксации азота. У изученных штаммов она катализирует и образование, и поглощение Нг, поэтому названа обратимой. Данных о её каталитических и биохимических свойствах немного; не вполне понятно, с какими естественными донорами/акцепторами электронов она взаимодействует. Анализ последовательностей Лох-генов позволил предположить, что это пиридин-нуклеотиды. Существует гипотеза, согласно которой обратимая гидрогеназа ассоциирована с дыхательным комплексом I и передаёт ему электроны. Вопрос о
! оэ од*>8»#лэ 1
том, каково значение этого фермента в жизнедеятельности цианобактерий, до сих пор остаётся открытым.
Цель и задачи исследования. Цель исследования - сравнительная характеристика водородного метаболизма, участвующих в нём гидрогеназ и его физиологического значения у одноклеточных неазотфиксирующих цианобактерий Gloeocapsa alpicola и Chroococcidiopsis thermalis.
Задачи работы состояли в следующем:
-
выявить физиологические факторы, влияющие на гидрогеназную активность клеток G. alpicola и С. thermalis, и определить условия, оптимальные для её проявления;
-
идентифицировать и охарактеризовать гены, кодирующие гидрогеназы G. alpicola и С. thermalis;
-
исследовать регуляцию синтеза гидрогеназы G. alpicola на уровне транскрипции в условиях, благоприятных для развития гидрогеназной активности;
-
изучить каталитические свойства очищенной гидрогеназы G. alpicola с целью определения её первичных физиологических доноров/акцепторов электронов.
Научная новизна работы. Данное исследование расширяет наши знания о метаболизме водорода у неазотфиксирующих цианобактерий и о свойствах цианобактериальной обратимой гидрогеназы. Как выяснилось, именно она ответственна за наблюдаемые реакции образования и поглощения Н2 у обоих изученных штаммов, поскольку в геномах последних найдены полные кластеры hox-генов, но не гены hup. Однако по характеру проявления и уровню гидрогеназной активности G. alpicola и С. thermalis значительно различаются.
На примере С. thermalis впервые показано, что обратимая гидрогеназа может служить, главным образом, для окисления Н2 - клетки данной цианобактерий поглощают водород на свету, используя 02 как акцептор электронов. Гид-рогеназная активность, измеренная по образованию Н2 с искусственными переносчиками электронов, крайне низка и не зависит от таких факторов, как содержание кислорода в среде и обеспеченность культуры азотом.
G. alpicola проявляет высокий уровень гидрогеназной активности в реакции образования Н2 in vitro. В отличие от гетероцистных цианобактерий, активность обратимой гидрогеназы G. alpicola не увеличивается при росте клеток в микроаэробных условиях, но возрастает при лимитировании роста культуры светом и, в большей степени, нитратом. Показано, что при переходе в состояние азотного голодания в клетках G. alpicola осуществляется ряд адаптивных изменений, следствием которых становится снижение окислительно-восстановительного потенциала внутри клеток. Выдвинуто предположение о том, что внутриклеточный Е|, является тем фактором, который прямо или опосредованно контролирует активность обратимой гидрогеназы G. alpicola. Получены оригинальные данные, показывающие, что механизмы регуляции фермента у G. alpi-
cola отличаются от таковых у гетероцистных форм: у АпаЬаепа variabilis синтез обратимой гидрогеназы регулируется и на транскрипционной, и на посттранскрипционных стадиях, тогда как у G. alpicola в условиях недостатка азота -только на постранскрипционных. Изучение каталитических свойств изолированной гидрогеназы G alpicola показало, что она эффективно катализирует и окисление Н2, и восстановление протонов. Получены убедительные данные, свидетельствующие, что физиологическими донорами/акцепторами электронов, с которыми взаимодействует этот фермент, являются пиридиннуклеотиды. Продемонстрировано, что G. alpicola способна поглощать Н2 in vivo на свету, независимо от присутствия (. и выделять водород в темновых анаэробных условиях.
Полученные данные позволяют заключить, что обратимая гидрогеназа у разных цианобактерий подчиняется различным регуляторним механизмам и по-разному проявляет активность, катализируя поглощение или образование Нг, в зависимости от внешних факторов и особенностей метаболизма данного штамма.
Апробация работы. Материалы диссертации представлены на 2-й и 3-й Конференциях молодых ученых (Пущино, 1998 и 1999 гг.), на XI Конференции северных стран по азотфиксации (Стокгольм, Швеция, 2000 г.), на 6-й Международной конференции по молекулярной биологии гидрогеназ (Потсдам, Германия, 2000 г.), на конференции «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 2000 г.), на конференции «Научные исследования в наукоградах Московской области» (Пущино, 2001 г.), на конференции «BioHydrogen 2002» (Эде, Нидерланды, 2002 г.), на 5-м Европейском совещании по молекулярной биологии цианобактерий (Стокгольм, Швеция, 2002 г.) и на 7-й Международной конференции по солнечной энергии и прикладной фотохимии, объединённой с 4-м Международным совещанием по фотохимии окружающей среды (Луксор, Египет, 2003 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ, из них пять статей в реферируемых журналах.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзорэ литературы по теме, описания объектов и методов исследования, изложения и обсуждения экспериментальных данных, выводов и списка цитированной литературы из 238 пунктов. Текст работы занимает 141 страницу, содержит 37 рисунков и 19 таблиц.
Морфология, классификация и распространение в природе
Цианобактерий - обширная и рано обособившаяся группа прокариот, исключительно разнообразная по форме и условиям обитания. Возраст наиболее древних остатков цианобактерий порядка 3,5 млрд. лет [Whitton, Potts, 2000]. Уникальной особенностью цианобактерий, по сравнению с другими прокариотами, является способность к оксигенному фотосинтезу, нередко сочетающаяся со способностью к азотфиксации. Считается, что в докембрианскую эпоху цианобактерий сыграли решающую роль в эволюции жизни, наполнив атмосферу Земли кислородом [Schopf, 2000; Kasting, Siefert, 2002].
Исторически первое название цианобактерий - сине-зеленые водоросли. Долгое время их относили к низшим растениям, и лишь позднее было установлено, что цианобактерий имеют типичную прокариотическую организацию генома, рибосомальных РНК и клеточной стенки, следовательно, являются бактериями [Кондратьева, 1996, с. 110-111; Lee, 1999, с. 67; Пиневич, Аверина, 2002, с. 154]. Они имеют грамоотрицательный морфотип, главный признак которого - наличие периплазмы, пространства между цитоплазматиче-ской и наружной мембранами. Важной особенностью цианобактерий, по сравнению с большинством других прокариот, является присутствие у них развитой внутриклеточной мембранной системы [Пиневич, Аверина, 2002, с. 154].
Цианобактерий исключительно разнообразны по своим морфологическим и репродуктивным признакам [Кондратьева, 1996, с. 105-110; Whitton, Potts, 2000]. Они бывают одноклеточными и нитчатыми; нити могут проявлять полярность и множественное ветвление. Деление может быть бинарным и множественным, в том числе с образованием меньших по размеру дочерних клеток - беоцитов. В определённых условиях некоторые нитчатые формы размножаются короткими участками нитей - гормогониями [Lee, 1999, с. 80]. Ряд видов обладают способностью к образованию специализированных клеток — гете-роцист и акинет, первые из которых приспособлены для осуществления азотфиксации (см. разд. 2.2 главы 2), а вторые служат для переживания неблагоприятных условий [Lee, 1999, с. 76-78]. Среди цианобактерий нет жгутиковых форм; движение клеток происходит с помощью специальных газовых вакуолей или за счёт скольжения, механизм которого пока не ясен [Oliver, Ganf, 2000; Mann, 2000].
Эти качества цианобактерий лежат в основе современной классификации (табл. 1, с. 11), которая до сих пор служит предметом спора между ботаниками и бактериологами. Её недостатком является то, что она слабо отражает эволюционные связи между различными формами цианобактерий [Пиневич, Аверина, 2002, с. 154-159]. Не так давно для определения этих связей стали использоваться молекулярно-биологические критерии. Краеугольным камнем в исследованиях такого рода была расшифровка полного генома Synechocystis sp. РСС 6803 [Kaneko et al, 1996]. К настоящему времени полностью секве-нированы геномы ещё семи цианобактерий [Kaneko et al, 2001; Meeks et al, 2001; Nakamura et al, 2002; http://www.vcu.edu/cyanonews/V17/GenomeProjects.html]. Филогенетическая система цианобактерий и классификация, учитывающая и фенотипические, и ге-нотипические признаки, разрабатываются в настоящее время, но данных пока недостаточно. Тем не менее, именно такие исследования позволяют отнести к цианобактериям про-хлорофиты (роды Prochloron, Prochlorotrix) - прокариоты, также осуществляющие окиси-генный фотосинтез, но имеющие ряд особенностей в организации фотосинтетического аппарата (см. разд. 2) [Lee, 1999, с. 73; Пиневич, Аверина, 2002, с. 154-159].
По своим генетическим свойствам и структурным особенностям цианобактерий близки хлоропластам фотосинтезирующих эукариот [Кондратьева, 1996, с. 112]. Теория симбиогенеза предполагает, что пластиды эукариотических клеток ведут своё происхождение от древних симбиотических цианобактерий [Bhattacharya, Medlin, 1998]. Среди современных цианобактерий много факультативно симбиотических форм, которые в условиях симбиоза снабжают организм хозяина продуктами фотосинтеза и азотфиксации или одного из этих процессов [Meeks, Elhai, 2002].
Свободноживущие цианобактерий растут при самых разных химических и физических параметрах среды (доступность питательных элементов, качество и интенсивность света, температурный и осмотический режим), включая экстремальные места обитания -стерильные озера Антарктики, горячие источники [Whitton, Potts, 2000]. Температурный оптимум для многих видов лежит в пределах 20-30С, но есть и термофильные формы: максимальная температура, при которой они сохраняют жизнеспособность - 70-74С (Synechococcus lividus). Оптимальное значение рН для большинства цианобактерий - 6,5-8,0; они более устойчивы к защелачиванию, чем к закисленню среды, но некоторые выдерживают рН до 4,5-5,0 (Mastigocladus) [Ward, Castenholz, 2000]. Широкие адаптивные возможности цианобактерий, наряду с их способностью к фотоавтотрофии и азотфиксации, делают их весьма значимым компонентом современных экосистем.
Метаболические возможности цианобактерии разнообразны. В качестве источника углерода все цианобактерии используют СОг, ассимиляция которого происходит, главным образом, в цикле Кальвина (причём, как у эукариотных фототрофов, в качестве восстановителя используется НАДФН) [Кондратьева, 1996, с. 123]. По этой причине их долгое время считали облигатными фотоавтотрофами. К настоящему времени обнаружено, что, по крайней мере, половина исследованных цианобактерии является факультативными фо-тогетеротрофами, хотя усваиваемые ими органические субстраты обычно ограничиваются глюкозой, фруктозой и сахарозой [Tandeau de Marsac et al, 1994]. Есть также штаммы, способные к хемогетеротрофии [Lee, 1999, с. 81]. В природных условиях цианобактерии часто осуществляют конструктивный метаболизм смешанного (миксотрофного) типа [Гусев, Минеева, 1992, с. 310].
В отличие от фототрофных бактерий, имеющих лишь одну фотосистему (ФСІ), для цианобактерии характерен растительный тип фотосинтеза, который осуществляется при участии двух фотосистем (ФСІ и ФСП) и сопровождается выделением Ог. Фотосинтетический аппарат цианобактерии представлен тилакоидными мембранами, содержащими хлорофилл а, (5-каротин, оксикаротиноиды, компоненты электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) и специфические пигменты этой группы микроорганизмов - фикобилипротеины, образующие антенные структуры фикобилисомы. Хлорофилл а снабжает энергией ФСІ [Кондратьева, 1996, с. 113-117; Lee, 1999, с. 74]. Фикобилисомы передают энергию, главным образом, на ФСП, но также на ФСІ, и, возможно, способны к перемещению между двумя фотосистемами [Bhaya et al, 2000]. Прохлорофиты, помимо хлорофилла а, содержат хлорофилл Ь; фикобилипротеины у них нередко отсутствуют [Гусев, Минеева, 1992, с. 316; Пиневич, Аверина, 2002, с. 154].
Распространение и физиологическое значение
Обратимая гидрогеназа - фермент, способный катализировать как образование, так и окисление Нг при наличии специфичного донора/акцептора электронов. Гидрогеназная активность обратимого типа обнаружена у различных форм цианобактерий: одноклеточных - Chroococcidiopsis [Almon, Boger, 1988], Microcystis [Asada, Kawamura, 1984], Synechocystis, Synechococcus, Aphanocapsa [Howart, Codd, 1985], Cyanothece [Van der Oost et al, 1987]; нитчатых негетероцистных - Oscillatoria [Belkin, Padan, 1978], Spirulina [Llama et al, 1979; Tian-quin, Pei-zhen, 1987]; гетероцистных - Anabaena [Tel-Or et al, 1977; Hallenbeck, Benemann, 1978; Serebryakova et al, 1994], Nosloc [Tel-Or et al, 1977; Houchins, Burris, 1981a-c], Mastigocladus [Houchins, 1984]. В последние годы было показано, что данный фермент не столь широко распространён среди цианобактерий, как считалось ранее. Обнаружены штаммы, у которых его нет, такие, как гетероцистные Nostoc sp. РСС 73102 [Tamagnini et al, 1997], Nosloc sp. Mitsui 38901, Nostoc sp. ACOI 578 [Tamagnini et al, 2000] и негетероцистная Leptolyngbya РСС 73110 [Tamagnini et al, 2000].
Обратимая гидрогеназа не имеет отношения к азотфиксации; она синтезируется как в гетероцистах, так и в вегетативных клетках [Tel-Or et al, 1977; Houchins, 1984; Boison et al, 2000; Tamagnini et al, 2002a]. У большинства неазотфиксирующих цианобактерий она, по-видимому, является единственным ферментом, катализирующим ключевые реакции метаболизма водорода. Для Synechocystis sp. РСС 6803 это можно считать доказанным: во-первых, в его геноме найден только один набор генов, обнаруживающих сходство с известными гидрогеназами, а во-вторых, мутант с нарушенным геном hoxH не проявляет активности ни по поглощению водорода на свету, ни по выделению Нг с МВ+ [Appel et al, 2000]. Никаких корреляций между наличием/отсутствием обратимой гидрогеназы у разных цианобактерий и особенностями организации и экологии последних пока не выявлено.
Физиологическое значение обратимой гидрогеназы в жизнедеятельности клеток -один из наиболее спорных аспектов в изучении метаболизма водорода у цианобактерий. Попытки продемонстрировать роль этого фермента с помощью мутантов A. variabilis и А. nidulans с нарушенным синтезом обратимой гидрогеназы не привели к успеху: отсутствие её активности никак не сказывалось на росте культур [Mikheeva et al, 1995; Sveshnikov et al, 1997; Boison et al, 1996]. Существовало предположение о том, что обратимая гидрогеназа - реликтовый фермент, занимавший важное место в метаболизме цианобактерий на ранних стадиях эволюции, когда атмосфера Земли была восстановленной [Кондратьева, Гоготов, 1981; Smith, 1990], но не являющийся жизненно важным в настоящее время. Однако было бы странно думать, что столь сложно организованный белок, требующий для своего синтеза больших энергозатрат, сохранился бы до наших дней, если бы полностью утратил физиологическое значение. Изучение молекулярных свойств обратимой гидроге-назы и реакций, в которых она проявляет активность in vivo, позволило предложить несколько гипотез, объясняющих, каковы могут быть её функции в современных условиях.
В природе цианобактерий, например, симбионты или обитатели микробиальных матов, нередко оказываются в темновых анаэробных условиях. В этом случае они могут осуществлять сбраживание эндо- или экзогенных углеводов, причём зачастую Нг является одним из продуктов брожения [Ikuta et al, 1997]. Spirulina platensis NIES-46 продуцирует при брожении Нг, этанол и низкомолекулярные органические кислоты, причём продуктивность брожения по водороду увеличивается при инкубации цианобактерий в условиях азотного голодания [Aoyama et al, 1997]. Суспензии клеток Anabaena с активной обратимой гидрогеназой выделяют Нг в присутствии экзогенных углеводов; максимальная скорость была отмечена на фруктозе [Серебрякова и др., 1992]. Способность к темновому анаэробному образованию водорода выявлена и у других видов Anabaena [Houchins, Burris, 1981с; Asada, Kawamura, 1986], а также у различных штаммов родов Microcystis [Asada, Kawamura, 1984; Asada et al, 1997; Moezelaar, Stal, 1994], у Chroococcidiopsis ther-malis ATCC 29380 [Almon, Boger, 1988], Microcoleus chtonoplastes [Moezelaar et al, 1996], Lyngbya langerheimii, Oscillatoria agardii, Phormidium ambiguum [Asada, Kawamura, 1986], Cyanothece sp. PCC 7822 [Van der Oost et al, 1989], Synechocystis sp. PCC 6803 [Cournac et al, 2002]. По всей видимости, образование Нг при брожении обусловлено активностью именно обратимой гидрогеназы, которая служит для удаления избытка восстановительных эквивалентов, образующихся в данных условиях, и регенерации акцепторов электронов [Stal, Moezelaar, 1997].
Когда цианобактерий лишены возможности осуществлять нормальный фотосинтез, как бывает, например, при избыточном освещении или недостатке в среде СОг, они также нуждаются в дополнительных способах освобождения клеток от избытка восстановителя [Smith, 1990]. Одним из таких способов может быть образование водорода. При аноксигенном фотосинтезе в присутствии сульфида клетки О. limnetica вьщеляют Нг с помощью обратимой гидрогеназы, причём скорость процесса сопоставима с активностью фермента, измеренной в реакции с МВ+ [Belkin, Padan, 1978]. Усиление образования Нг при сульфид-зависимом аноксигенном фотосинтезе отмечено и для N. muscorum [Fry et al, 1984]. Выделение Нг клетками Anabaena sp. РСС 7120, в нормальных условиях обусловленное работой нитрогеназы, значительно увеличивается, когда клетки обесцвечиваются на ярком свету, что связано, по-видимому, именно с индукцией обратимой гидрогеназы [Laczko, 1985; Smith, 1990]. Масс-спектрометрический анализ позволил зафиксировать кратковременное выделение Нг клетками Oscillatoria chalybea [Abdel-Basset, Bader, 1998] и Synecho-systis sp. PCC 6803 [Abdel-Basset, Bader, 1998; Cournac et al, 2002] при переносе их из темноты на свет. Недавние исследования показали, что мутант Synechocystis sp. РСС 6803 с инактивированной обратимой гидрогеназой медленнее адаптируется к изменению интенсивности света, по сравнению с диким штаммом; окисление ФСІ у него также происходит медленнее [Appel et al, 2000]. Предполагается, что во всех этих случаях обратимая гидро-геназа функционирует как клапан для сброса избытка низкопотенциальных электронов, генерируемых при световой реакции фотосинтеза [Smith, 1990; Appel et al, 2000].
Высокое сродство обратимой гидрогеназы к Нг [Houchins, Burris, 1981b] позволяет предположить, что процессы поглощения водорода с её помощью также имеют место in vivo и играют определённую роль в метаболизме цианобактерий.
Способность к поглощению Нг в темноте в аэробных условиях, осуществляему при участии обратимой гидрогеназы, выявлена у многих цианобактерий [Howart, Codd, 1985; Appel et al, 2000]. Для Synechosyslis sp. PCC 6803 отмечено, что в присутствии разобщителя электронного транспорта KCN реакция прекращается. Этот факт может свидетельствовать о том, что электроны от гидрогеназы поступают на кислород по дыхательной цепи [Appel et al, 2000]. Использование Нг как субстрата для дыхания, позволяет цианобактери-ям синтезировать дополнительное количество АТФ [Кондратьева, 1996, с. 122].
Исходя из того, что в состав обратимой гидрогеназы входит диафоразная часть, о чём будет подробно рассказано ниже, была предложена теоретическая модель структурно-функциональной связи данного фермента с ЭТЦ [Appel, Schulz, 1996; Schmitz, Bothe, 1996; Boison et al, 1998]. С одной стороны, последовательности диафоразных субъединиц гидрогеназы имеют консервативные участки, весьма сходные с участками двух субъединиц дыхательного комплекса I. С другой стороны, в геноме Synechocystis sp. РСС 6803 выявлены гены, кодирующие только И из 14 полипептидов НАДН-дегидрогеназы (в том виде, в котором она существует в клетках Е. соїї). Согласно этой модели, диафоразная часть обратимой гидрогеназы восполняет «недостающие» элементы и обеспечивает взаимодействие гидрогеназы с дыхательной цепью.
Организмы и условия их культивирования
Обратимая гидрогеназа цианобактерий является сложно организованным ферментом. По последним данным, она имеет тетрамерную или пентамерную структуру и включает собственно гидрогеназную (HoxYH) и диафоразную (Hox(E)FU) части [Tamagnini et al, 2002а; Schmitz et al, 2002]. Это железо-никель-содержащий фермент: присутствие [2Fe-2S]- и [4Fe-4S]-KnacrepoB в его составе у A. variabilis АТСС 29413 продемонстрировано с помощью электронного парамагнитного резонанса; спектроскопическими методами в составе очищенной гидрогеназы идентифицированы флавинмононуклеотид и никель [Serebryakova et al, 1996]. Анализ аминокислотных последовательностей, соответствующих Лох-генам, подтверждает наличие участков, отвечающих за встраивание в активный центр никеля и за координацию железо-серных кластеров [Tamagnini et al, 2002а].
Каталитические и биохимические свойства фермента пока недостаточно изучены. Имеющиеся данные касаются частично очищенных препаратов из Anabaena sp. РСС 7120 [Houchins, Burris, 1981b], Spirulina maxima [Llama et al, 1979], S. platensis [Tian-quin, Pei-zhen, 1987], M. laminosus, O. limnetica [Houchins, 1984], Microcystis aeruginosa NIES 44 [Asada et al, 1987], Anabaena sp. PCC 7120 [Ewart, Smith, 1989], С thermalis ATCC 29380 [Almon, Boger, 1988], Л. variabilis ATCC 29413 [Серебрякова и др., 1995; Серебрякова, Го-готов, 1995; Serebryakova et al, 1996], A. nidulans и Synechocystis sp. PCC 6803 [Schmitz et al, 2002].
Сложность выделения цианобактериальной обратимой гидрогеназы обусловлена низкой активностью фермента в грубом экстракте, нестабильностью в изолированном состоянии и загрязнённостью препарата фикобилипротеинами, сопровождающими гидроге-назу на всех стадиях очистки [Schmitz et al, 2002]. Обратимая гидрогеназа A. variabilis АТСС 29413 была очищена в 150 раз, с выходом по активности 20 %. Специфическая активность препарата фермента, измеренная по выделению Иг с МВ+, составила 10 мкмоль Нг / мин / мг белка [Serebryakova et al, 1996]. Значительно более активные препараты гидрогеназы были получены в результате анаэробной очистки фермента из Synechocystis sp. PCC 6803 и A. nidulans. Обратимая гидрогеназа Л. nidulans была очищена в 1290 раз, с выходом по активности 2,6 % и со специфической активностью 15 мкмоль Нг / мин / мг белка; фермент Synechocystis sp. РСС 6803 был очищен в 647 раз, с выходом по активности 10 % и со специфической активностью до 67 мкмоль Нг / мин / мг белка [Schmitz et al, 2002].
При мягком разрушении клеток обратимая гидрогеназа переходит в растворимую фракцию, из чего следует, что это слабо связанный с мембранами или растворимый фермент [Hallenbeck, Benemann, 1978; Houchins, Burris, 1981b; Houchins, 1984; Asada et al, 1987; Almon, Boger, 1988]. Скорее всего, он локализован в цитоплазме, а не в периплазме, поскольку не освобождается при обработке ЭДТА в слабощелочных условиях [Houchins, 1984]. Методом иммуногольдлокализации было показано, что гидрогеназа A nidulans ассоциирована с цитоплазматической мембраной [Kentemich et al, 1989; Kentemich et al, 1991]. У A. variabilis и Synechocystis sp. PCC 6803 наблюдается ассоциация гидрогеназы с мембраной тилакоидов [Serebryakova et al, 1994; Appel et al, 2000]. Для окончательного ч ответа на вопрос о субклеточной организации фермента нужны дополнительные исследования.
Имеющиеся в литературе данные относительно молекулярной массы нативного фермента достаточно противоречивы. Это может быть обусловлено сложной структурой гидрогеназы и возможностью её разрушения (в большей или меньшей степени) при биохимических манипуляциях. Наиболее достоверными, по-видимому, можно считать результаты, полученные недавно для гидрогеназ A. nidulans и Synechocystis sp. РСС 6803. Денатурирующий электрофорез в ПААГ, в сочетании с определением N-концевых последовательностей белков, показал, что в состав гидрогеназ A. nidulans и Synechocystis sp. РСС 6803 входят пять субъединиц, соответствующих продуктам известных hox-генов (табл. 4).
Молекулярный вес гидрогеназы Synechocystis sp. РСС 6803, определённый методом гельфильтрации, составил порядка 375 кДа, откуда следует, что данный фермент, по-видимому, является димером нативного пятисубъединичного белка (около 180 кДа) [Schmitz et al, 2002].
Обратимая гидрогеназа катализирует восстановление Н+ и окисление Нг с низкопотенциальными искусственными донорами и акцепторами электронов, соответственно. Максимальные скорости реакций наблюдаются с метил- и бензилвиологеном (БВ) [Llama et al, 1979; Houchins, 1984; Asada et al, 1987]. Кажущаяся Km для MB+, по разным данным, составляет от 0,053 до 0,51 мМ [Houchins, 1984; Hallenbeck, Benemann, 1978; Llama et al, 1979; Asada et al, 1987; Schmitz et al, 2002; Serebryakova et al, 1996], для БВ+ - 0,33 мМ [Llama et al, 1979]. Скорость окисления Нг активированной гидрогеназой A. variabilis АТСС 29413 была приблизительно одинаковой для реакций с МВ2+ и БВ2+ (9,0-10,4 мкмоль Нг / мин / мг белка), Кт для этих акцепторов составила, соответственно, 250±6 и 226± 10 мкМ [Serebryakova et al, 1996].
Естественные переносчики электронов, с которыми взаимодействует обратимая гидрогеназа цианобактерий, долгое время оставались неизвестными. Отмечалось лишь, что активированный фермент A. variabilis АТСС 29413 восстанавливает собственный ферре-доксин растительного типа в атмосфере водорода [Serebryakova et al, 1996]. Молекулярно-генетические исследования, показавшие наличие в составе гидрогеназы диафоразной части, дали основание для идеи о том, что естественными медиаторами, взаимодействующими с обратимой гидрогеназой, являются пиридиннуклеотиды. Первые свидетельства в пользу этой гипотезы содержались в работах, показавших, что в грубом бесклеточном экстракте A. nidulans осуществляются НАД(Ф)Н-зависимое образование Нг и поглощение водорода в присутствии НАД(Ф)+ [Schmitz et al, 1995; Schmitz, Bothe, 1996]. Затем было отмечено, что гидрогеназа Synechocystis sp. РСС 6803 взаимодействует с пиридиннуклео-тидами, будучи частично очищенной [Schmitz et al, 2002]. Кроме того, взаимодействие с НАД+ в атмосфере водорода продемонстрировали для гидрогеназы A. variabilis АТСС 29413, хотя скорость процесса была невысока [Serebryakova et al, 1996].
Оптимум рН реакции выделения Н2 с МВ+ составил 7,5-8,0 для S. maxima [Llama et al, 1979], 6,8-7,0 для M. aeruginosa [Asada et al, 1987], 6,0 для Anabaena sp. PCC 7120 [Houchins, Burris, 1981b], 6,9 для A. variabilis ATCC 29413 [Serebryakova et al, 1996], 6,3 для Synechocystis sp. PCC 6803 [Schmitz et al, 2002]. Максимальная скорость окисления Нг гидрогеназой A. variabilis АТСС 29413 наблюдалась при рН 8,0-8,5 [Serebryakova et al, 1996]. Такой разброс значений рН-оптимума, по-видимому, объясняется степенью чистоты изолированного фермента и различиями в методике проведения реакции (например, касающимися природы восстановителя для MB, природы и молярности буфера).
Обратимая гидрогеназа относительно термостабильна. Фермент Anabaena sp. РСС 7120 выдерживает нагревание до 70С [Houchins, Burris, 1981b]. Значительная инактивация очищенной гидрогеназы Synechocystis sp. РСС 6803 наблюдалась только при 75С, тогда как температурный оптимум осуществляемой ею реакции выделения Нг с МВ+ составил 60С [Schmitz et al, 2002]. Интересно, что энергия активации аналогичной реакции, катализируемой гидрогеназой A. variabilis АТСС 29413, для фермента в бесклеточном экстракте была значительно выше, чем для частично очищенного препарата (65,8 и 40,0 кДж/моль, соответственно) [Serebryakova et al, 1996].
Влияние обеспеченности культуры азотом
Сигналы, которые были получены при блот-гибридизации по Саузерну между геномной ДНК, гидролизованной с помощью рестрикционной эндонуклеазы EcoRI, и описанными выше продуктами ПНР, соответствовали фрагментам ДНК размером около 1 т.п.н (рис. 36, с. 108). Эти фрагменты были клонированы и секвенированы. Проанализировав их нуклеотидную последовательность, мы установили, что фрагмент 758hox02 содержит ген hoxY полностью и участок гена hoxH, а фрагмент 758hox01 представляет собой часть hoxH, расположенную ниже.
Чтобы клонировать недостающую область hoxH, геномную ДНК С. thermalis, гидро-лизованную комбинацией эндонуклеаз EcoRV и Clal, подвергли гибридизации, использовав в качестве зонда фрагмент 758hox01. Полоса гибридизации соответствовала фрагменту ДНК размером порядка 1,5 т.п.н. Данный фрагмент (758hox03) также был клонирован и секвенирован. Анализ полученной последовательности показал, что она содержит искомый участок ИохН, а также область, обнаруживающую гомологию с геном высокоспецифичной протеазы (hoxW), участвующей в созревании гидрогеназ, который найден у Synechococcus sp. РСС 7002 и у A. flavidum (60 и 59 % сходства по аминокислотной последовательности, соответственно).
Затем в геноме С. thermalis были идентифицированы гены, кодирующие диафораз-ную часть гидрогеназы. С этой целью геномная ДНК, гидролизованная EcoRV, была гиб-ридизована с зондом 758hox02. Размер гибридизующегося фрагмента составил около 3 т.п.н. Клонирование и секвенирование данного фрагмента (758hox04) показало, что он содержит часть гена hoxF, гены hoxU и hoxY полностью и часть гена hoxH, то есть перекрывается с клонированными фрагментами 758hox01 и 758hox02. Последовательности перекрывающихся областей оказались идентичными.
Анализ частичной библиотеки показал, что Лох-гены С. thermalis очень близки аналогичным генам других цианобактерии по нуклеотидной и аминокислотной последовательностям (особенно генам гетероцистных форм; табл. 15, с. 88), имеют такие же размеры, направление и взаимное расположение (рис. 37; для сравнения см. рис. 4, с. 42). Особенностью организации /гох-кластера у С. thermalis является практически полное отсутствие интергенных участков между структурными генами.
Таким образом, можно сделать вывод о том, что С. thermalis располагает гидрогена-зой Нох-типа. Наиболее вероятно, что именно она ответственна за наблюдаемые физиологические реакции. В то же время необходимо подчеркнуть, что, в отличие от других исследованных цианобактерии, функциональная роль данного фермента у С. thermalis, по-видимому, направлена исключительно на окисление молекулярного водорода.
У изученных до сих пор неазотфиксирующих цианобактерий ключевым ферментом метаболизма водорода является обратимая гидрогеназа - гидрогеназа Нох-типа (см. главу 3), хотя её физиологическая роль в благоприятных условиях культивирования не выглядит очевидной. Наши исследования показали, что именно такой гидрогеназои располагают два одноклеточных неазотфиксирующих штамма - G. alpicola и С. thermalis, причём уровень и характер проявления активности фермента у них существенно различается.
В геномах обеих цианобактерий идентифицированы гены, кодирующие обратимую гидрогеназу - hoxEFUYH у G. alpicola и hoxFUYH(W) у С. thermalis, тогда как присутствие генов hup, соответствующих водород-поглощающей гидрогеназе, не выявлено. Гены G. alpicola обнаруживают очень высокую степень сходства с аналогичными генами Synecho-cystis sp. РСС 6803 (до 100 % гомологии по предсказанной аминокислотной последовательности), причём в геноме G. alpicola (табл. 15, с. 88) идентифицированы не только структурные гены, но и все ORF с неизвестной функцией, найденные в Лох-кластере Synechocystis sp. РСС 6803 [Appel, Schulz, 1996]. Столь большое сходство естественно, поскольку G. alpicola (=Synechocystis sp. РСС 6308) и Synechocystis sp. 6803 относятся к одному роду цианобактерий. Гены С. thermalis (табл. 15; рис. 37, с. 109) наиболее похожи на Лох-гены гетероцистных форм (до 94 % сходства по предсказанной аминокислотной последовательности), что согласуется с результатами филогенетических исследований, показавших, что именно гетероцистные цианобактерий являются ближайшими ныне живущими родственниками рода Chroococcidiopsis [Fewer et al, 2002]. Интересно, что гены, подобные Лох-генам цианобактерий (до 84 % сходства по предсказанной аминокислотной последовательности), обнаружены также у микроорганизмов других групп - Thermotoda, Geobacter, Chloroflexus (табл. 15).
Кластер генов, кодирующих обратимую гидрогеназу С. thermalis (рис. 37), имеет особенность, отличающую его от всех прочих охарактеризованных цианобактериальных Лох-кластеров (рис. 4, с. 42) - между структурными генами отсутствуют другие ORF и вообще какие-либо интергенные области. С большой долей вероятности можно предположить, что Лох-кластер G. alpicola организован точно так же, как Лох-кластер Synechocystis sp. РСС 6803 [Appel, Schulz, 1996]. Однако об этом нельзя говорить уверенно, учитывая исключительное разнообразие цианобактериальных гидрогеназ Нох-типа по наличию и протяженности промежутков между структурными генами и по расположению генов вспомогательных [Tamagnini et al, 2002a]. Кроме того, нужно принять во внимание, что у близкородственных штаммов цианобактерий, мало отличающихся по нуклеотидной последовательности отдельных генов, расположение одинаковых генов в молекуле ДНК может очень сильно варьировать [Hess, 2002].
Анализ последовательностей Лох-генов, идентифицированных у различных цианобактерий, позволил установить, что в состав фермента входят собственно гидрогеназная часть (HoxYH) и субъединицы, обладающие диафоразной активностью (Hox(E)FU) [Schmitz et al, 1995; Appel, Schulz, 1996]. При этом до сих пор отсутствовали данные, показывающие, что изолированный фермент действительно может взаимодействовать с пири-диннуклеотидами. Нам удалось продемонстрировать и охарактеризовать реакции Wj-зависимого восстановления НАД+ и выделения Нг из НАД(Ф)Н, катализируемые частично очищенной гидрогеназой G alpicola (рис. 24, с. 97). Оказалось, что фермент разрушается при очистке (рис. 22, с. 95), теряя диафоразную активность. Гидрогеназная активность в реакциях с искусственными переносчиками электронов сохраняется, следовательно, на поверхности молекулы гидрогеназы существует независимый от диафоразной части центр связывания доноров/акцепторов электронов. Не исключено, что обратимые гидрогеназы цианобактерий могут in vivo взаимодействовать не только с пиридиннуклеотидами.
Как и другие изученные гидрогеназы, выделенный в аэробных условиях фермент G. alpicola для проявления активности нуждается в восстановительной активации в атмосфере Нг. Нами показано, что НАДН оказывает стимулирующее действие на данный процесс (рис. 29, с. 102). Это характерно и для специфической НАД+-восстанавливающей гидрогеназы водородных бактерий [Hyman et al, 1988].
Высокая степень сходства цианобактериальных обратимых гидрогеназ на генетическом уровне контрастирует с разнообразием проявления их активности в клетках разных видов. У гетероцистных цианобактерий гидрогеназная активность, измеренная в реакции образования Иг с МВ+, обычно низка при росте в аэробных условиях, но многократно увеличивается в ходе микроаэробной адаптации [Houchins, Burris, 1981а; Houchins, 1984; Серебрякова и др., 1992]. Одноклеточная неазотфиксирующая G. alpicola, как выяснилось, проявляет достаточно высокий уровень гидрогеназной активности при аэробном росте, причём последняя не зависит от содержания Ог в газовой фазе (табл. 11, с. 74). Гидрогеназная активность С. thermalis, напротив, очень низка, но индукции обратимой гидрогеназы в анаэробных условиях также не происходит (табл. 19, с. 104).
