Введение к работе
Актуальность проблемы.
Использование бактериальных препаратов на основе симбиотрофных бактерий, способных к фиксации атмосферного азота, является наиболее экономичным и экологически чистым способом повышения плодородия почвы [Черников, Чекерес, 2000; Новикова, 2004; Тихонович, Круглое, 2006]. Инокуляция растений симбиотрофными азотфиксирующими бактериями (клубеньковыми pp. Azorhizobium, Rhizobium, Mesorhizobium, Sinorhizobium, Bradyrhizobiwn или ассоциативными pp. Azospirillum, Agrobacterium, Arthrobacter, Klebsiella) приводит к повышению продуктивности растений при снижении нормы расхода минеральных азотных удобрений [Мишустин, Шшьникова, 1973; Lin, 1983; Хотянович, 1991; Воробьева, 2000; Завалин с соавт., 2003; Кожемяков с соавт., 2004; Емцев, Мишустин, 2005; Тихонович с соавт. 2005]. Симбиозы также обладают огромными преимуществами для развития растительно-микробных ассоциаций в изменяющихся условиях окружающей среды, чему способствуют высокий природный адаптационный потенциал партнеров и их эволюционно закрепленное взаимовыгодное сосуществование [Douglas, 1994; Seckbach, Dordrecht, 2002; Muratova et al, 2003; Проворов, 2001, 2009; Тихонович, Проворов, 2003, 2007]. Однако при циклической смене хозяина симбиотрофные бактерии попадают в почву и должны существовать в ней в иных, отличных от симбиотических, условиях, что требует реализации ранее не проявляемых свойств. Вместе с тем проблеме выживания симбиотрофных микроорганизмов в природных экосистемах, особенно в неблагоприятных условиях, уделяется мало внимания.
Создание современных бактериальных препаратов сопряжено с селекцией как высокопродуктивных, так и стрессоустойчивых штаммов, быстро адаптирующихся при попадании в почву, возобновляющих активный метаболизм и сохраняющих способность к колонизации растения [Завалин, 2000; Проворов, Тихонович, 2003]. Поэтому изучение механизмов адаптации симбиотрофных бактерий не только актуально, но является и своевременной агробиотехнологической задачей. Особенно важным представляется исследование таких типов стратегии адаптации, как образование покоящихся форм (ПФ), которые позволяют популяции переживать неблагоприятные для роста условия [Бухарин с соавт., 2005; Мулюкин с соавт., 2002; Эль-Регистан с соавт., 2006], реализуя внутрипопуляционную фенотипическую вариабельность, от которой зависит эффективность развития бактерий в их жизненном цикле и результативность симбиозов [Dragutin et al., 2003; Woude et al., 2004]. Особое значение имеет изучение роли в этих процессах низкомолекулярных микробных и растительных ауторегуляторов.
Цель работы: изучить закономерности формирования и развития адаптивных реакций симбиотрофных бактерий.
Задачи исследования:
1. Установить условия образования покоящихся клеток симбиотрофных бактерий Sinorhizobium meliloti, шт. Р221, и Azospirillum brasilense, шт. Sp7 и Sp245, как формы адаптационного ответа на неблагоприятные для роста условия. Исследовать морфологическое и физиологическое разнообразие покоящихся форм этих бактерий, образующихся при имитации природных стрессовых условий. 2. Выявить различия в стратегии выживания симбиотрофных бактерий с разным типом взаимодействия с растительным партнером на примере двух штаммов A. brasilense: неэндофитного (ассоциативного) Sp7 и эндофитного Sp245. 3. Изучить внутривидовую вариабельность S. meliloti и A. brasilense, реализующуюся при прорастании покоящихся форм. Охарактеризовать культуральные, морфологические, физиолого-биохимические и биотехнологические признаки выделенных диссоциантов, а также тип их подвижности. 4. Оценить роль низкомолекулярных ауторегуляторов растительного и микробного происхождения в контроле адаптивных реакций ризобиальных бактерий.
Научная новизна.
1. Впервые получены доказательства способности симбиотрофных ризобиальных бактерий S. meliloti, шт. Р221, и A. brasilense, шт. Sp245, образовывать в цикле развития их культур клетки, обладающие признаками покоящихся форм. Выявлены условия, моделирующие стрессовые природные ситуации и способствующие массовому образованию покоящихся форм. 2. Обнаружено разнообразие покоящихся форм S. meliloti и A. brasilense, различающихся ультраструктурной организацией, пролиферативным потенциалом и терморезистентностью, что демонстрирует гибкость стратегии выживания этих бактерий. 3. Установлена зависимость формирования ПФ А. brasilense определенного морфотипа от характера взаимодействия с растительным партнером (неэндофитного или эндофитного). 4. Изучена фенотипическая диссоциация S. meliloti и A. brasilense, составляющая адаптивный потенциал популяции. Выделены и охарактеризованы варианты бактерий по культуральным, морфологическим, физиолого-биохимическим и биотехнологическим признакам, а также типу подвижности. 5. Обнаружены различия в плазмидном профиле диссоциантов S. meliloti. 6. Впервые показана возможность регуляции адаптивных реакций симбиотрофных бактерий ауторегуляторами растительного происхождения - агглютинином зародышей пшеницы (АЗП) и микробного происхождения - алкилоксибензолами (АОБ).
Практическая значимость работы. 1. Полученные результаты могут быть использованы для разработки эффективных бактериальных препаратов на основе цистоподобных покоящихся клеток (ЦПК) азотфиксирующих бактерий, длительно сохраняющих жизнеспособность. 2. Предложены способы: а) быстрого получения диссоциантов симбиотрофных бактерий путем рассева ПФ на плотные или полужидкие среды; б) селекции диссоциантов с заданными свойствами, путем применения избирательных ростовых условий. 3. Создана коллекция диссоциантов S. meliloti и A. brasilense, различающихся ростовыми, физиолого-биохимическими признаками, а также типом подвижности, которые могут быть использованы при получении бактериальных препаратов для сельского хозяйства. 4. Разработаны способы контроля адаптационных возможностей симбиотрофных бактерий, основанные на применении низкомолекулярных ауторегуляторов микробного и растительного происхождения. Способы предусматривают: а) стимуляцию роста; б) сохранение жизнеспособности клеток при длительном хранении; в) направленное изменение типа коллективной подвижности бактерий для повышения результативности колонизации растений.
Апробация работы. Результаты работы были обсуждены на: VI Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Беларусь, Минск 2008); II Международной научно-практической конференции «Проблемы биологии, экологии, географии, образования: история и современность» (Пушкин, 2008); Международной научной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной выдающимся педагогам Петровской академии (Москва, 2008); IV межрегиональной конференции молодых ученых (Саратов, 2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, из них 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Исследования осуществлялись совместно с ИНМИ имени С.Н. Виноградского РАН, ГосНИИГенетики, Центром «Биоинженерия» РАН, ИБФМ имени Г.К. Скрябина РАН, Пущино.
Автор выражает искреннюю признательность научному консультанту, доктору биологических наук Г.И. Эль-Регистан, кандидату биологических наук Н.Г. Лойко, сотрудникам лаборатории классификации и хранения уникальных микроорганизмов Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН.
Структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 155 страницах и включают 29 рисунков и 20 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов и списка литературы, содержащего 200 работ отечественных и зарубежных авторов.
