Содержание к диссертации
Введение
Глава I Эпидемиологические и клинические аспекты коклюшной инфекции 12
1.1. Особенности эпидемического процесса коклюшной инфекции на рубеже веков в России и зарубежом 12
1.2. Особенности клинической картины коклюша 17
Глава II. Микробиологическая и молекулярно-генетическая характеристика возбудителя коклюша 21
2.1. Культурально - морфологические свойства Bordetella pertussis 21
2.2. Антигенная структура Bordetella pertussis 22
2.2.1. Особенности структуры поверхностных агглютиногенов 23
2.2.2. Основные факторы патогенности B.pertussis 28
2.2.3. Патогенные свойства штаммов B.pertussis 32
2.4. Генетическая структура B.pertussis 34
2.5. Молекулярно-генетическая характеристика циркулирующих штаммов B.pertussis 38
Собственные исследования 51
Глава III. Материалы и методы 51
3.1. Штаммы микроорганизмов 51
3.2. Методы исследования. 52
3.2.1. Микробиологические методы. 52
3.2.2. Определение вирулентности штаммов В. pertussis 52
3.2.3. Молекулярно-генетические методы. 53
3.2.4. Статистическая обработка результатов, анализ данных и программное обеспечение 58
Результаты исследования 60
Глава IV. Структура генов (ptxA, ptxB, ptxC, ptxD и ptxE), кодирующих S2, S3, S4 и S5 субъединицы В-комплекса коклюшного токсина и гена ргп штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем в настоящее время 60
4.1. Структура гена ptxA, кодирующего S1 субъединицу А-комплекса коклюшного токсина 61
4.2. Структура reuaptxB, кодирующего S2 субъединицу В-комплекса коклюшного токсина 63
4.3. Структура гена ptxC, кодирующего S3 субъединицу В-комплекса коклюшного токсина 66
4.4. Структура генов ptxD и ptxE, кодирующих S4 и S5 субъединицы В-комплекса коклюшного токсина 68
4.5. Структура промоторной области коклюшного токсина iptxP 69
4.6. Структура гена ргп, кодирующего пертактин 73
Глава V. Распространение штаммов В. pertussis, выделенных от больных коклюшем в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции с различными аллельными вариантами генов (ptxA, ptxB, ptxC, ptxD и ptxE), кодирующих A- (SI субъединица) и В- (S2, S3, S4 и S5 субъединицы) комплексы коклюшного токсина и его промоторную область, и гта ргп, кодирующего пертактин 77
5.1. Распространение штаммов Bpertussis с различными аллельными вариантами гена ptxA, кодирующего S1 субъединицу А-комплекса коклюшного токсина 77
5.2. Распространение штаммов B.pertussis с различными аллельными вариантами гена ptxB, кодирующего S2 субъединицу В-комплекса коклюшного токсина 79
5.3. Распространение штаммов Bpertussis, с различными аллельными вариантами гена ptxC, кодирующего S3 субъединицу В-комплекса коклюшного токсина 81
5.4. Распространение штаммов B.pertussis с различными аллельными вариантами промоторной области коклюшного токсина (ptxP) 82
5.5. Распространение штаммов B.pertussis с различными аллельными вариантами генаргп, кодирующего пертактин 83
Глава VI. Сравнительный анализ структуры генов (ptxA, ptxB, ptxC, ptxP и prn) штаммов B.pertussis, используемых для производства коклюшного компонента АКДС-вакцины, и современных штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем в России 87
Заключение 91
Выводы 102
Практические рекомендации 103
Список литературы 104
- Особенности клинической картины коклюша
- Структура промоторной области коклюшного токсина iptxP
- Распространение штаммов B.pertussis с различными аллельными вариантами генаргп, кодирующего пертактин
- Сравнительный анализ структуры генов (ptxA, ptxB, ptxC, ptxP и prn) штаммов B.pertussis, используемых для производства коклюшного компонента АКДС-вакцины, и современных штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем в России
Введение к работе
Актуальность проблемы
Коклюш является воздушно-капельной инфекцией, управляемой средствами специфической вакцинопрофилактики. Однако, несмотря на 50-летную массовую иммунизацию детского населения, коклюш до сих пор остается важной причиной младенческой смерти во всем мире и продолжает быть проблемой здравоохранения даже в странах с высоким уровнем охвата профилактическими прививками. Так, во многих странах Европы и Америки с 1990-х годов отмечается рост заболеваемости коклюшем, несмотря на высокий уровень охвата профилактическими прививками, который считается наиболее распространенным среди вакци-ноуправляемых инфекций. Одной из особенностей коклюшной инфекции в последние годы является рост числа случаев заболевания среди подростков и взрослых (Taranger J., 2001; Cherry J.D., 2005; Celentano L.P., 2005; Diavatopoulos D.A., 2005; Edwаrds K.M., 2005; Ward J.I., 2006; Forsyth K.D., 2007).
Коклюш в России в конце IXX и начале XX века также занимал первое место среди четырех капельных инфекций (коклюш, кори, скарлатины, дифтерии). Снижение заболеваемости отмечалось лишь в 1950-ые годы прошлого столетия и решающую роль в проблеме борьбы с коклюшем сыграла специфическая массовая иммунизация детского населения АКДС-вакциной, которая в нашей стране впервые была введена в широкую практику в 1958-1960 гг. Специфическая вакцинопрофилактика коклюша на протяжении последних 50 лет привела к резкому снижению заболеваемости, летальности и уменьшению тяжести течения болезни. Однако, несмотря на очевидные успехи проводимой массовой иммунизации детского населения и высокий уровень охвата профилактическими прививками, до настоящего времени сохраняются подъемы и спады заболеваемости, как за счет непривитых, так и привитых лиц увеличилась заболеваемость детей школьного возраста. Регистрируется высокая заболеваемость детей раннего возраста с тяжелым течением заболевания, а также единичные случаи летальных исходов (Лыткина И.Н., 2004; Селезнева Т.С., 2004; Озерецковский Н.А., 2004; Чистякова Г.Г., 2005). Кроме того, учитывая низкую эффективность лабораторной диагностики коклюша, можно полагать, что имеется недовыявление случаев коклюша и существует скрытое течение эпидемического процесса коклюшной инфекции. Все это свидетельствует о продолжающейся циркуляции возбудителя коклюша и, следовательно, существовании риска возникновения заболеваний.
Одной из причин продолжающейся циркуляции возбудителя коклюша является изменение его биологических свойств, как фенотипических, так и генотипических. Молекулярно-генетический мониторинг возбудителя коклюша, проводимый в различных странах на 4 континентах, а также в нашей стране показал, что штаммы B.pertussis подвержены генетической вариабельности, затрагивающей, в первую очередь, гены, кодирующие основные факторы патогенности (Мазурова И.К., 2003; Семенов Б.Ф., 2003; Борисова О.Ю., 2010; Guiso N., 2001; van Loo I.H.M., 2002; Preziozi M.P., 2002; Gzyl A., 2004; Elomaa A., 2005, 2007; Mooi F.R., 2010).
Возбудитель коклюша - Bordetella pertussis (B.pertussis) имеет множество факторов па-тогенности, однако, основным является коклюшный токсин, который играет ведущую роль в развитии инфекционного процесса (Tamura M., 1982; Hsia J.A., 1984). Коклюшный токсин (КТ) имеет А-В структуру и состоит из А-комплекса (S1 субъединица), обеспечивающего основные изменения в патогенезе коклюшной инфекции, и В-комплекса, состоящего из 5-ти субъединиц S2-S5, который отвечает за связывание токсина с рецепторами мишени и способствует проникновению А-комплекса в клетки хозяина. У возбудителя коклюша продукция всех факторов патогенности находится под контролем двухкомпонентной BvgAS системы регуляции, включающей промоторную область коклюшного токсина, кодируемая регулятор-ным геном ptxP, экспрессия которого влияет на уровень продукции коклюшного токсина (Mooi F.R., 2010; Mooi F.R., 2009).Кроме того, в развитии инфекции существенное значения имеют и другие факторы патогенности, в первую очередь пертактин, отвечающий за адгезию возбудителя на поверхности слизистой оболочки ротоглотки (Tuomanen E., 1985; Shahin R.D., 1990; Hijnen M., 2004; Hijnen M., 2007). Изменения в генах, ответственных за проявление па-тогенности возбудителя, его адгезию может привести к появлению штаммов с измененными свойствами и оказать влияние на течение эпидемического и инфекционного процессов, поэтому наблюдение за возбудителем коклюша, за его фенотипическими и молекулярно-генетическими свойствами является актуальным.
Цель исследования - выявление особенностей генотипической изменчивости штаммов B.pertussis, вызывающих заболевание коклюшем на современном этапе эпидемического процесса коклюшной инфекции (2000 – 2010 гг.).
Задачи исследования:
1. Выявить особенности структуры генов ptxА, ptxB, ptxC, ptxD и ptxE, кодирующих S1 субъединицу А-комплекса и S2, S3, S4 и S5 субъединицы В-комплекса коклюшного токсина
(КТ), и гена prn, кодирующего пертактин, штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем в 2000 – 2010 гг.
-
Изучить особенности структуры регуляторного гена ptxP, кодирующего промотор-ную область коклюшного токсина, у современных штаммов B.рertussis и сопоставить со степенью их вирулентности.
-
Оценить динамику распространения штаммов B.pertussis с измененной структурой генов, кодирующих А-, В- комплексы и промоторную область коклюшного токсина и пертак-тин, на разных этапах эпидемического процесса коклюшной инфекции.
-
Изучить структуру генов (ptxА, ptxB, ptxC, ptxР и prn) штаммов B.pertussis, используемых для производства коклюшного компонента АКДС-вакцины, и провести сравнительный анализ со структурой этих генов у штаммов B.pertussis, циркулирующих в России в последние 10 лет.
-
Пополнить музей штаммами современного периода (2005 - 2010 гг.) развития эпидемического процесса коклюшной инфекции.
Научная новизна
Получены новые данные об особенностях структуры семи генов (ptxА, ptxВ, ptxС, ptxD, ptxE, ptxР и prn), кодирующих субъединицы А-В-комплексов и промоторную область коклюшного токсина, а также пертактин штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции и в настоящее время. Выявленные существенные и множественные мутации в структуре этих генов приводят к изменениям формирования белковых молекул антигенных детерминант (коклюшного токсина и пертактина), а также возможны функциональные изменения уровня продукции коклюшного токсина при мутациях в регуляторном гене.
Впервые показана генетическая структура современной популяции возбудителя коклюша, доминирующее положение в которой занимают штаммы B.pertussis с новыми «невакцинными» аллелями основных генов патогенности (коклюшного токсина и пертактина), а также выявлены новые мутации, приводящие к еще более существенным изменениям структуры и функции основных антигенных детерминант B.pertussis.
Полученные данные свидетельствуют, что формирование популяции штаммов B.pertussis в динамике развития эпидемического процесса коклюшной инфекции идет по пути вытеснения штаммов, содержащих «вакцинные» аллели, характерные для производственных вакцинных штаммов B.pertussis, штаммами с новыми «невакцинными» аллелями генов, кодирующими А-В-комплексы и промоторную область коклюшного токсина и пертактин, что
указывает на необходимость продолжения исследований по подбору современных штаммов B.pertussis при производстве новых перспективных вакцинных препаратов.
Практическая значимость
Полученные данные о динамике распространение штаммов B.pertussis с различными аллельными вариантами генов, кодирующих основные факторы патогенности, позволили проследить формирование популяции возбудителя коклюша в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции и создать основы молекулярно-генетического мониторинга возбудителя коклюша в системе эпидемиологического надзора за коклюшной инфекцией.
Пополнена уникальная коллекция штаммов B.pertussis, выделенными от больных коклюшем в различных регионах России, дающая возможность проводить многоплановые исследования возбудителя коклюша с целью слежения за популяцией циркулирующих штаммов и прогнозирования распространения штаммов с различной генетической структурой основных детерминант патогенности возбудителя.
Выявленные особенности структуры генов, кодирующих А-В-комплексы, промотор-ную область коклюшного токсина и пертактин, послужили основой для определения «мишеней» (нуклеотидных последовательностей), при разработке ускоренного метода лабораторной диагностики коклюша и ускоренных методов молекулярно-генетического мониторинга его возбудителя.
Внедрение результатов работы в практику
Полученные данные о генотипических особенностях структуры штаммов B.pertussis
послужили основой патента на изобретение РФ № 2007147797 от 20.02.2009 г.; «Способ и набор для ускоренной диагностики коклюша».
Результаты проведенных исследований нашли применение в лекционном цикле и практических занятиях на курсах повышения квалификации для врачей–бактериологов «Актуальные вопросы современной медицинской микробиологии», проводимых на базе ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора (2004 г.; 2005 г.; 2006 г.; 2009; 2010 гг.); семинаров тематического усовершенствования «Биологические свойства возбудителя коклюша и лабораторная диагностика» для врачей-бактериологов филиалов ФБУЗ ЦГиЭ г. Москвы (2008 г., 2009 г., 2010 г., 2012 г.) и обучающем курсе при подготовке ординаторов ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.
Современные молекулярно-генетические методики изучения генотипических особенностей структуры штаммов B.pertussis используются в Референс центре по мониторингу за
возбудителями дифтерии и коклюша ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотреб-надзора при проведении микробиологического и молекулярно-генетического мониторинга популяции штаммов возбудителя коклюша, циркулирующих на территории России.
Основные положения, выносимые на защиту:
Произошли существенные мутационные изменения в структуре генов, кодирующих
субъединицы А- и В- комплексов КТ и пертактин у штаммов B.pertussis, приводящие к изменениям на аминокислотном уровне иммуногенных областей КТ и пертактина. Впервые у штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем в России, выявлены изменения структуры регуляторного гена ptxР, кодирующего промоторную область КТ. Новый «невакцинный» ptxР3 аллель гена несет мутации, влияющие на уровень продукции КТ.
Установлен состав популяции штаммов B.pertussis, вызывающих заболевание коклюшем на современном этапе эпидемического процесса коклюшной инфекции, - доминируют штаммы с новыми «невакцинными» ptxA1 и ptxС2 аллелями генов, кодирующих S1 и S3 субъединицы КТ, prn2 и prn3 аллелями гена, кодирующим пертактин, обнаружены единичные штаммы с измененной структурой гена ptxВ, кодирующего S2 субъединицу, и с новым «невакцинным» prn9 аллелем гена пертактина.
Показано несоответствие структуры генетических детерминант, кодирующих субъединицы А-В- комплексов и промоторную область КТ и пертактин, штаммов B.pertussis, вызывающих заболевание коклюшем на современном этапе эпидпроцесса коклюшной инфекции, и производственных вакцинных штаммов B.pertussis, входящих в состав АКДС-вакцины.
Апробация работы
Диссертация апробирована на заседании секции Ученого совета «Эпидемиология,
микробиология, клиника инфекционных заболеваний» ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, протокол №7 от 8 декабря 2011 г.
Результаты диссертационной работы представлены на конференциях молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире» (пос. Оболенск, Московская обл., 2009, 2010 гг.); Международном форуме по нанотехнологиям (г.Москва, 2009 г.); VIII Конгрессе детских инфекционистов (г.Москва, 2010 г.); II Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болез-
ням (г.Москва, 2010 г.), IV Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (г.Москва, 2012 г.).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 22 научные работы, в том числе 9 статей - в рецензируемых изданиях, 12 работ - в материалах конференций и 1 патент на изобретение.
Объем и структура диссертации
Диссертационная работа изложена на 135 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, 3 главы собственных исследований, заключение и выводы. Работа иллюстрирована 7 таблицами и 27 рисунками. Список литературы включает 259 источников, в том числе 53 - отечественных и 206 - зарубежных авторов.
Особенности клинической картины коклюша
Коклюш - заболевание, сопровождающееся кашлем не менее двух недель, при наличии как минимум одного из следующих симптомов: спазматический кашель, лающий кашель на вдохе, посткашлевая рвота без другой видимой причины. Инфицирование происходит в результате прямого контакта с больным коклюшем, и больной является наиболее заразным в раннем катаральном периоде, когда симптомы относительно легкие и неспецифические. При коклюше практически не наблюдается явление пассивного иммунитета новорожденных, поэтому ребенок восприимчив к возбудителю с первых дней жизни. Учитывая морфофункциональную незрелость дыхательных путей, наиболее тяжелые случаи коклюша и высокие уровни смертности регистрируются среди детей первых 6 месяцев жизни [35, 36, 37, 38].
Нами проанализированы данные литературы по изменению тяжести клинического течения коклюша за длительный период: с 1967 г. по 2005 г. [2, 11, 13, 18, 22, 32, 35, 38, 36, 37, 39, 44, 45, 46, 47].
Так, в допрививочный период на фоне высокой заболеваемости преобладали тяжелые формы болезни. К концу 1960-х годов тяжесть течения коклюша заметно снизилась. Легкие и стертые формы стали регистрировать в 60,6% случаев, среднетяжелые формы составили 37,0% и тяжелые формы лишь 2,4% (рис. 5.). Важным достижением в эти годы явилось снижение летальности и частоты угрожаемых для жизни тяжёлых форм болезни у детей первых месяцев жизни - с 70,0% в конце 1960-х гг. до 25,8% в 1977 -1981 гг. [18,34].
Однако в начале 1980-х годов на фоне уменьшения охвата прививками регистрировался рост тяжести течения заболевания - отмечалось нарастание среднетяжелых форм с 58,3% (1977 - 1981 гг.) до 69,2% (1989 - 1992 гг.) (рис. 5); удельный вес тяжелых форм составил 15,5% - 20,0%, сократилось число легких форм заболевания до 10,8% в конце 1980-х годов. По данным отечественных исследователей, число среднетяжелых форм коклюша у детей в возрасте старше года увеличилось в 2,6 раза и в 3 раза реже регистрировались маломанифестные формы болезни. Удельный вес типичных форм коклюша у детей данной возрастной группы вырос с 65,4% до 83,6%. Наряду с этим, среди госпитализированных детей в возрасте до 1 года регистрировалось увеличение среднетяжелых форм и снижение легких форм болезни. В то же время, не возросла тяжесть коклюша среди детей в группе риска по развитию тяжелых форм - у детей 1-3 месяцев жизни. Следует отметить, что рост манифестных форм коклюша происходил на фоне снижения иммунологической защищенности детского населения, что и привело к росту интенсивности эпидпроцесса коклюша за счет вовлечения значительного контингента непривитых детей [22, 32, 44, 45, 46].
Несмотря на улучшение эпидемиологической обстановки и роста удельного веса в популяции привитых детей в последние 10 - 15 лет сохраняются тяжелые формы заболевания [13, 37, 38, 47]. Удельный вес среднетяжелых и тяжелых форм составил 69,2% - 68,0% и 20,0% - 19,0%, соответственно, в то же время наблюдается уменьшение числа легких форм коклюша до 12,0% (в 2002 г.). Важной особенностью течения клиники коклюша в этом периоде является рост тяжести заболевания во всех возрастных группах. Если в предыдущие годы тяжелые и среднетяжелые формы регистрировались только в группе детей до 1 года, то в 1997 - 2002 гг. такие формы отмечались и в других возрастных группах детского населения, но с преобладанием тяжелых форм в группе детей до 1 года. Среди госпитализированных детей с 1997 года по настоящее время число тяжелых форм колеблется в пределах 19,8% - 14,3%. По-прежнему коклюш является тяжелым заболеванием для детей до 1 года жизни (периода новорожденности и первых 3-х месяцев жизни). Сравнительный анализ тяжести течения болезни за период с 1993 г. по 2007 г. выявил в данной группе нарастание числа тяжелых форм к концу 1990-х гг. с 35,2% до 46,5%. В 2000-е годы частота угрожаемых для жизни тяжелых форм коклюша составляет 42,8% -46,3%.
Таким образом, специфическая вакцинопрофилактика коклюша на протяжении последних 50 лет привела к резкому снижению заболеваемости, летальности и уменьшению тяжести течения болезни. Однако, несмотря на очевидные успехи проводимой массовой иммунизации детского населения (показатели своевременной вакцинации и ревакцинации практически повсеместно превышают 95,0%), до настоящего времени отмечается относительная стабилизация заболеваемости и сохраняются основные эпидемиологические особенности коклюшной инфекции: регистрируются периодические подъемы заболеваемости, как за счет непривитых, так и привитых лиц, случаи летальности у детей младенческого возраста; высокая заболеваемость детей раннего возраста; увеличилась заболеваемость детей школьного возраста; а также сохраняются тяжелые формы болезни. Все это свидетельствует о продолжающейся циркуляции возбудителя и, следовательно, существует риск возникновения заболеваний, особенно у неиммунных лиц, а также лиц со сниженным иммунитетом.
Структура промоторной области коклюшного токсина iptxP
Возможность штаммов патогенных микроорганизмов продуцировать различный уровень вирулентности рассматривается как адаптационный фактор, способствующий приспособлению микроорганизмов к персистированию в макроорганизме. Особенно это важно в отношении возбудителей инфекций, управляемых специфическими средствами вакцинопрофилактики, где возбудители должны преодолевать противодействие иммунной системы [71, 94, 125, 193, 226].
Экспрессия всех факторов патогенности возбудителя коклюша регулируется двухкомпонентной регуляторной системой - BvgAS [94, 193, 226]. Одной из таких регуляторных детерминант является промоторная область КТ (ptxP), экспрессия которой контролируется Bvg-активатором. Точность присоединения димера BvgA на специфический сайт промотора КТ и прочность образуемой связи влияют на экспрессию оперона ptx и на уровень продукции КТ [193, 194]. В последние годы было установлено, что причиной продукции различного уровня коклюшного токсина у штаммов B.pertussis является наличие мутационных изменений в промоторной области. Поэтому, учитывая такие данные, нами изучена структура промоторной области КТ (ptxP) у современных циркулирующих штаммов возбудителя коклюша.
Среди штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем при секвенировании промотора ptxP, обнаружено 3 варианта последовательности нуклеотидов (рис. 20).
Вариант 1 - ptxPl аллель
TCNAGGCGGTCGTCGAGGCCTTTGCCGCCAAGGCGCCACGCCGGTCATCGCCACGCCGGATCAGACCCGCGGCTTCA TCGCAGACGAGATCCAGCGCTGGGCCGGCGTCGTGCGCGAAACCGGCGCCAAGCTGAAGTAGCAGCGCAGCCCTCCA ACGCGCCATCCCCGTCCGGCCGGCACCATCCCGCATACGTGTTGGCAACCGCCAACGCG@ATGCGTGCAGATTCGTC GTACAAAACCCTCGATTCTTCCGTACATCCCGCTACTGCAATCCAACACGGCATGAACGCTCCTTCGGCGCAAAGTC GCGCGATGGTACCGGTCACCGTCCGGACCGTGCTGACCCCCCTGCCATGGTGTGATCCGTAAAATAGGCACCATCAA AACGCAGAGGGGAAGACGGGATGCGTTGCACTCGGGCAATTCGCCAAACCGCAAGAACAGGCTGGCTGACGTGGCTG GCGATTCTTGCCGTCACGGCGCCCGTGACTTCGCCGGCATGGGCCGACGATCCTCCGCCNCCCNGTATACC
Вариант 2 -ptxP2 аллель
GGCGGTCGTCGAGGCCTTTGCCGCCCAAGGCGCCACGCCGGTCATCGCCACGCCGGATCAGACCCGCGGCTTCATCG CAGACGAGATCCAGCGCTGGGCCGGCGTCGTGCGCGAAACCGGCGCCAAGCTGAAGTAGCAGCGCAGCCCTCCAACG CGCCATCCCCGTCCGGCCGGCACCATCCCGCATACGTGTTGGCAACCGCCAACGCG[T]ATGCGTGCAGATTCGTCGTA CAAAACCCTCGATTCTTCCGTACATCCCGCTACTGCAATCCAACACGGCATGAACGCTCCTTCGGCGCAAAGTCGCG CGATGGTACCGGTCACCGTCCGGACCGTGCTGACCCCCCTGCCATGGTGTGATCCGTAAAATAGGCACCATCAAAAC GCAGAGGGGAAGACGGGATGCGTTGCACTCGGGCAATTCGCCAAACCGCAAGAACAGGCTGGCTGACGTGGCTGGCG ATTCTTGCCGTCACGGCGCCCGTGACTTCGCCGGCATGGGCCGACGATCCTCGCCCCCCCGGTATACAAA
Вариант 3 -ptxP3 аллель
GCGGTCGTCGAGGCCTTTGCCGCCCAAGGCGCCACGCCGGTCATCGCCACGCCGGARCAGACCCGCGGCTTCATCGC AGACGAGATCCAGCGCTGGGCCGGCGTCGTGCGCGAAACCGGCGCCAAGCTGAAGTAGCAGCGCAGCCCTCCAACGC GCCATCCCCGTCCGGCCGGCACCATCCCGCATACGTGTTGGCAACCGCCAACGCGCATGCGTGCAGATTCGTCGTAC AAAACCCTCGATTCTTCCGTACATCCCGCTACTGCAATCCAACACGGCATGAACGCTCCTTCGGCGCAAAGTCGCGC GATAGTACCGGTCACCGTCCGGACCGTGCTGACCCCCCTGCCATGGTGTGATCCGTAAAATAGGCACCATCAAAACG CAGAGGGGAAGACGGGATGCGTTGCACTCGGGCAATTCGCCAAACCGCAAGAACAGGCTGGCTGACGTGGCTGGCGA TTCTTGCCGTCACGGCGCCCGTGACTTCGCCGGCATGGGCCGACGATCCTCCGCCACNCCGTATA
Последовательности нуклеотидов различались между собой в двух положениях. Для варианта 1 и 3 в положении (-167) характерным был нуклеотид С, в то время как для второго варианта - нуклеотид Т. Во втором положении (-65) для варианта 1 и 2 последовательностей нуклеотидов промотора ptxP характерным был нуклеотид G, а для третьего варианта нуклеотид А. Полученные при секвенировании последовательности нуклеотидов полностью соответствовали последовательностям, опубликованным в международной базе данных генотипов (GenBank), и соответствовали трем аллелям промотора ptxP: вариант 1 последовательности нуклеотидов соответствовал ptxPl аллелю (Ml3223), вариант 2 - ptxP2 аллелю (AJ420987) и вариант 3 - рґхРЗ аллелю (AJ420987) гена. Первый аллель промотора - ptxPl, согласно EMBL/GenBank, является «вакцинным» аллелем, т.к. все штаммы, используемые в различных странах мира для производства цельноклеточных вакцин, несут этот аллель. Замена нуклеотида С на Т в положении (-167) и вторая замена нуклеотида G на А в положении (-65) являются контрастным. Замена в (-65) положении расположена в области, отвечающей за связывание с BvgA димером в области регуляции транскрипции, обеспечивая повышенную прочность связи и, как показано исследователями [94, 194, 226], приводящая к увеличению продукции коклюшного токсина.
Молекулярно-генетическая структура промоторной области ptxP изучена у 75 штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем в настоящее время. Оказалось, что 3 (4,0%) штамма B.pertussis имели вариант 1 последовательности нуклеотидов, т.е. ptxPl аллель промотора, 2 (2,7%) штамма - второй вариант последовательности, т.е. ptxP2 аллель и 70 (93,3%) штаммов - вариант 3 последовательности нуклеотидов, т.е. ptxPS аллель промотора. Следовательно, большинство современных штаммов возбудителя коклюша, выделенных от больных коклюшем в нашей стране, несут новую структуру промоторной области - «невакцинный» ptxP3 аллель. При сопоставлении генетической структуры промоторной области с аллельными вариантами других генов - ptxA и ptxC оказалось, что в большинстве случаев (97,7%) штаммы с новыми «невакцинными» ptxAl и ptxC2 аллелями генов, кодирующих субъединицы А- и В-комплексов КТ, несут и новый «невакцинный» ptxP3 аллель промоторной области КТ.
Совместно с сотрудниками лаборатории диагностики дифтерийной инфекции ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора д.м.н., профессором И.К. Мазуровой, д.м.н. О.Ю. Борисовой и сотрудниками института вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН - к.м.н. Н.С. Захаровой, к.м.н. Е.М.Зайцевым, к.б.н. Н.У. Мерцаловой и А.С. Шинкаревым проведено изучение вирулентных свойств 15 штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем в последние годы. Исследование проводились in vivo на мышах путем их интрацеребрального заражения и последующего расчета LD5o [31, 52]. У всех штаммов была изучена структура гена ptxA, кодирующего А-комплекс КТ, и все штаммы несли новый «невакцинный» ptxAl аллель этого гена. У данных штаммов нами продолжены исследования по оценке принадлежности их к аллельному варианту промоторной области КТ. Оказалось, что все штаммы с высокой и один штамм со средней степенью вирулентности, LD5o которых была 18,3 млн.м.кл., несли новый «невакцинный» ptxP3 аллель пормотора. В то время как среди двух современных слабовирулентных штаммов, LD5o которых значительно превышала критерий оценки слабовирулентности штаммов ( 25,0 млн.м.кл.), один штамм характеризовался новым «невакцинным» ptxP3 аллелем, а другой штамм - старым «вакцинным» ptxPl аллелем промотора. Следовательно, изучение структуры промоторной области ptxP штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем в настоящее время в России, показало, что данная генетическая детерминанта подвержена генетической вариабельности и большинство современных штаммов несут новый «невакцинный» ptxP3 аллель промотора и обладают высокой степенью вирулентности.
Распространение штаммов B.pertussis с различными аллельными вариантами генаргп, кодирующего пертактин
Показано, что для всех штаммов B.pertussis допрививочного периода (1948-1959 гг.) характерным было наличие «вакцинного» ргп 1 аллеля гена. В последующие годы отмечалось постепенное сокращение доли таких штаммов и увеличение штаммов с новой генетической структурой (рис. 26).
Среди штаммов B.pertussis, выделенных в 1970-е годы, 96,9% штаммов имели «вакцинный» prnl аллель и 3,1% штаммов - «невакцинный» ртЗ аллель гена, который отличается от «вакцинного» аллеля наличием «немолчащих» мутаций, приводящих к замене на аминокислотном уровне. В 1980-е годы доля штаммов с «невакцинным» ргпЗ аллелем увеличилась до 31,1%. Кроме того, штаммы также характеризовались и новой структурой гена ptxA - ptxAl аллелем, что отличало эти штаммы от большинства штаммов B.pertussis, циркулировавших в эти годы.
Вместе с тем, уже к концу 1980-х годов в популяции появились также штаммы с другим «невакцинным» ргп2 аллелем гена, который отличается от «невакцинного» ргпЗ аллеля наличием «немолчащих» мутаций, приводящих к замене на аминокислотном уровне, и несет дополнительную вставку в 15 п.н., т.е. более длиную структуру Ргп белка. Среди штаммов B.pertussis, выделенных в 1990 - 1999 гг., 44,5% штаммов имели «вакцинный» prnl аллель, 22,2% штаммов - «невакцинный» рт2 аллель и 33,3% штаммов «невакцинный» ргпЗ аллель, т.е. значительно увеличилась доля циркулирующих штаммов B.pertussis с «невакцинным» рт2 аллелем гена.
Изучение структуры ргп гена у штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем в начале этого века, показало, что большинство 139 (97,9%) штаммов B.pertussis, выделенных в начале нового столетия (2000-2005 гг.), характеризовались «невакцинными» ргп2 и ргпЗ аллелями гена пертактина. В 2006 - 2010 гг. у циркулирующих штаммов B.pertussis наблюдается большая гетерогенность «невакцинных» аллелей: 89,5% штаммов характеризуются «невакцинным» ргп2 аллелем, 5,3% штаммов -«невакцинным» ргпЗ аллелем, и впервые выявлено 1,3% штаммов с другим новым ргп9 аллелем гена, который ранее не регистрировали, и характеризуется еще более значимыми мутационными изменениями. Данный ргп9 аллель также, согласно международной базе генотипов, является «невакцинным» аллелем этого гена и имеет последовательность нуклеотидов подобную ргп2 аллелю, но несет дополнительную повторяющуюся последовательность в 30 п.н., т.е. дополнительный фрагмент гена, увеличивающий структуру Ргп белка.
Резюме. Проведенное исследование дает возможность полагать, что происходит перестройка структуры циркулирующей популяции штаммов B.pertussis, которая идет по пути появления генетической вариабельности в структуре детерминант, кодирующих субъединицы А - В (S2 и S3 субъединицы) - комплексов и промоторную область КТ, являющегося основным фактором патогенности возбудителя коклюша. Изменения в структуре гена, кодирующего субъединицу А-комплекс появились в конце 1960-х годов, в структуре гена, кодирующего S3 субъединицу В- комплекса коклюшного токсина - в 1980 - 1990-е гг., а в структуре промоторной области в 1990-е годы, и к настоящему времени штаммы с новой структурой этих генов распространились и стали доминировать в циркулирующей популяции.
По структуре ргп гена также обнаружена тенденция к продолжению перестройки популяции: продолжается доминирование штаммов с «невакцинным» рт2 аллелем, циркулируют штаммы с «невакцинным» ргпЗ аллелем и появились единичные штаммы с новым «невакцинным» ргп9 аллелем гена, имеющим еще более значимые мутационные изменения по сравнению со штаммами B.pertussis допрививочного периода. Изменения в структуре гена ptxB, кодирующего S2 субъединицу В-комплекса КТ, происходят значительно медленнее, чем в генах ptxA, ptxC, ptxP и ргп. Штаммы с новой (ptxB2 аллель) структурой гена ptxB зарегистрированы только в 2007 г..
Сравнительный анализ структуры генов (ptxA, ptxB, ptxC, ptxP и prn) штаммов B.pertussis, используемых для производства коклюшного компонента АКДС-вакцины, и современных штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем в России
В России вакцинопрофилактика коклюша осуществляется согласно Национальному календарю прививок АКДС-вакциной, содержащей дифтерийный и столбнячный анатоксины и убитые клетки трех штаммов B.pertussis различных серотипов, что отличает ее по составу от DTP-вакцин, используемых зарубежом. При производстве используют три штамма B.pertussis- № 475 серотипа 1.2.3, выделенный в 1966 г., № 305 - 1.2.0 и № 267 - 1.0.3, выделенные в 1956 г. от больных коклюшем. В этом разделе представлены данные по изучению структуры генов, кодирующих А-В-комплексы, промоторную область коклюшного токсина и пертактин у штаммов B.pertussis, вызывающих заболевания коклюшем на современном этапе, и отечественных производственных вакцинных штаммов B.pertussis (табл. 6).
Из таблицы видно, что все три вакцинных штамма имели -ptxA2lptxA4 аллели, которые являются, согласно международной базе данных генотипов, старыми «вакцинными» аллелями гена ptxA, кодирующего S1 субъединицу А- комплекса КТ. В то время как структура гена ptxA штаммов B.pertussis, вызывающих заболевание коклюшем в последние 10 лет, характеризуется в 97,7% случаях новым «невакцинным» ptxAl аллелем гена и, тем самым, отличается от структуры этого гена вакцинных штаммов. При изучении структуры генов ptxB и ptxC, кодирующих субъединицы В-комплекса КТ, у вакцинных и современных штаммов B.pertussis обнаружено, что все три вакцинных штамма B.pertussis несут «вакцинные» ptxBl и ptxCl аллели генов, кодирующих S2 и S3 субъединицы В-комплекса КТ; современная циркулирующая популяция в 87,4% случаев представлена штаммами с новым «невакцинным» ptxC2 аллелем и только в 12,6% случаях старым «вакцинным» ptxCl аллелем этого гена.
По структуре гена ptxB все три вакцинных штамма имеют «вакцинный» ptxBl аллель, в то время как среди современных штаммов обнаружено 2 штамма, несущих новый «невакцинный» ptxB2 аллель гена. По структуре промоторной области КТ (ptxP) показано, что из трех вакцинных штаммов, два штамма, выделенные в 1950-х годах, несут старый «вакцинный» ptxPl аллель промотора; один штамм B.pertussis № 475, который введен в состав АКДС-вакцины в 1966 г., т.е. практически через 10 лет проведения массовой иммунизации, несет уже «невакцинный» ptxP2 аллель. Этот аллель отличается от «вакцинного» ptxPl аллеля наличием одной «немолчащей» мутации в положении (-167) промоторной области. Однако данная мутация расположена за пределами области, содержащей сайты, отвечающие за связывание с BvgA димером, влияющим на продукцию КТ. Современная популяция в 93,3% случаях характеризуется штаммами с новым «невакцинным» ptxP3 аллелем, который отличается от «вакцинного» аллеля наличием контрастной мутации в (-65) положении и расположена в одном из 6 основных сайтов связывания с BvgA димером, что приводит к усилению прочности связи и, как следствие, увеличению продукции коклюшного токсина. При изучении особенностей структуры гена ргп, кодирующего главный адгезии возбудителя - белок пертактин, показано, что все три вакцинных штамма B.pertussis несут «вакцинный» prnl аллель гена, в то время как современная популяция в 94,0% случаев представлена штаммами с новым «невакцинным» ргп2 аллелем, в 2,7% случаях ргпЗ аллелем, в 0,4% случаях ргп9 аллелем и в 3,9% случаях старым «вакцинным» prnl аллелем этого гена.
Аналогичные исследования по сравнительному изучению структуры вакцинных и циркулирующих штаммов проводят во многих странах мира, и в работах выявлены различия в аллельных вариантах генов, кодирующих основные факторы патогенности. Для сравнения на примере двух стран — Финляндии и Нидерландов - нами проанализирован состав DTP-вакцин и отличия генетической структуры вакцинных и циркулирующих штаммов [109, 144, 188, 189, 192, 194, 239, 245, 246, 247] (табл. 7.).
Из таблицы 7 видно, что в этих странах для производства цельноклеточных DTP-вакцин используют штаммы B.pertussis двух серотипов, выделенных еще в 1950-е годы прошлого столетия и несущих старые «вакцинные» ptxA2/ptxA4; ptxCl; ptxPl аллели генов, кодирующих S1 субъединицу А-комплекса и S3 субъединицу В-комплекса КТ и его промоторную область.
В то время как в циркулирующих в настоящее время популяциях штаммов В.pertussis,так же как и в нашей стране, доминируют штаммы с новыми «невакцинными» ptxAl, ptxC2 и ptxP3 аллелями этих генов. По структуре гена ptxB, кодирующего S2 субъединицу В-комплекса коклюшного токсина, все штаммы возбудителя коклюша, как вакцинные, так и современные штаммы, гомогенны и несутptxBl аллель гена.
Резюме. Сравнительный анализ генетической структуры вакцинных и современных штаммов показал несоответствие структуры генетических детерминант, кодирующих А- и В-комплексы КТ, его промоторную область и пертактин штаммов B.pertussis, вызывающих заболевания коклюшем в настоящее время, и штаммов B.pertussis, используемых для производства коклюшного компонента АКДС - вакцины. Различия в структуре указывают на необходимость совершенствования современных вакцинных препаратов в профилактике коклюша путем их конструирования на штаммах, имеющих генетическую структуру, соответствующую современной популяции возбудителя.
