Введение к работе
. Актуальность проблемы.
Липополисахариды (ЛПС) - компоненты внешней мембраны грамотрица-тельных бактерий, обуславливающие в значительной степени физико-химические и биологические свойства бактериальных клеток ЛПС обеспечивает целостность и стабильность мембраны, селективную проницаемость и межклеточные взаимодействия [Ludentz et al, 1982] Кроме того, ЛПС - один из основных факторов патогенносте грамотрицательных бактерий [Raetz, Whitfield, 2002]
Молекулы ЛПС, как правило, состоят из липида, называемого липидом А, который ковалентно связан с гетерополисахаридными цепями, включающими две субструктуры - коровые олигосахариды (непосредственно связаны с липидом А) и О-специфические цепи, которые представляют собой повторяющиеся олигосаха-ридные единицы Такой тип структуры придает ЛПС амфифильный характер из-за гидрофобности липида А и гидрофильности гетерополисахаридных цепей [Zahrmgere/a/,1994]
Липид А — часть молекулы ЛПС, ответственная за его эндотоксическую активность, то есть способность вызывать эндотоксический шок, возникающий в результате лавинообразной экспрессии провоспалительных цитокинов, основным из которых является TNF-q; [Beutler, Cerami, 1988, Dinarello, 1991] К настоящему времени получены данные, свидетельствующие о зависимости эндотоксической активности ЛПС от количества, длины, степени насыщенности жирнокислотных остатков, а также наличия фосфатных групп в липидной части молекулы ЛПС Показано, что максимальной эндотоксической активностью обладает ЛПС с дифосфо-рилированным липидом А, состоящим из двух /М,6-связанных остатков D-глюкозамина, ацилированный шестью жирными кислотами [Rietschel et al, 1987, Takada et al, 1992] Любые отклонения от этой структуры приводят к уменьшению токсичности молекулы [Rietschel et al, 1994] Кроме того, показано, что есть определенная зависимость между токсичностью и пространственной конформацией молекул ЛПС, которая определяется Тс-температурой фазового перехода от ламелляр-
ной (бислойной) фазы в гексагональную фазу Наиболее биологически активный липид А имеет коническую или цилиндрическую форму [Seydel et al, 1993]
В отличие от большинства других патогенных бактерий семейства Entervbactenaceae, Yersiniapestis - возбудитель чумы, продуцирует ЛПС, лишенный О-полисахаридных цепей [Brubaker, 1972, Darveau et al, 1983, Prior et al, 2001] ЛПС штаммов Y pestis, выращенных при температуре 28 С, более токсичен для мышей, чем ЛПС штаммов Y pestis, выращенных при температуре 37 С [Тынянова и др, 2003], что связано с отличиями в структуре молекул ЛПС [Kawahara et al, 2002]
Наличие ЛПС (эндотоксина) в составе живых и убитых вакцин на основе грамотрицательных бактерий, в том числе и чумных, используемых в настоящее время, определяет их высокую реактогенность Это является их основным недостатком [Дмитровский, 1994, Медуницын, 1997, Galanos, Freudenberg, 1993, Raetz, 1990, Raetz, Whitfield, 2002, van Amersfoort et al, 2003, van der Poll, van Deventer, 1999, Дентовская и др, 2006] Альтернативные им "химические" вакцины позволяют за счет введения в их состав только иммунодоминантных антигенов значительно снизить реактогенность препарата в целом, эффективны для ревакцинации, могут быть использованы на фоне экстренной профилактики антибиотиками и исключают возможность возникновения инфекционного процесса у лиц с нарушениями иммунного статуса Однако, вакцины, сконструированные на основе одного-двух индивидуальных иммунодоминантных антигенов, не являются идеальными, т к не могут обеспечить зашиты от всех вирулентных вариантов возбудителя инфекции Отсутствие у патогена антигенов, использованных в составе вакцины, или присутствие их серологически отличающихся вариантов позволяют измененным формам микроорганизмов уклоняться от иммунитета, индуцированного подобной вакцинацией [Arusimov et al, 2004]
В то же время показано, что вакцина живая чумная на основе штамма EV линии НИИЭГ обеспечивала защиту животных как от штаммов "дикого" типа (индекс иммунитета (ИИ) для белых мышей » 3,3 х 104, для морских свинок « 1,4 х Ю5), так и от их бескапсульных вариантов (ИИ для белых мышей » 2,6 х 10 , для морских
свинок и 1,2 х 10 ) [Анисимов, 1999] Есть данные, что вакцина живая чумная эффективна и в отношении "полевочьих" штаммов возбудителя чумы [Абгарян, 1966], в которых V антиген представлен вариантом, характерным для У enterocohhca О 3 серовара [Anisimov et al-, 2007, Worsham, Hunter, 1998] Оба серовара V антигена обладали выраженной протективной активностью в отношении штаммов с гомологичным вариантом V антигена, но не обеспечивали защиты животных при заражении штаммами Ypestis с V антигеном другого серовара [Gnffin et al, 1998; Roggenkamp et al, 1997] Это подтверждает то, что наличие в живых вакцинах, сконструированных на основе аттенуированных штаммов, не только одного-двух иммунодоминантных, но и целого спектра сложных (комплекс белка с ЛПС и т п), конформационно-лабильных и минорных антигенов обеспечивает индукцию "гетерогенного" иммунного ответа, способного защитить макроорганизм от патогенных бактерий даже с частично измененной антигенной специфичностью Для конструирования современных живых чумных вакцин со сниженной реактогенностью необходима генно-инженерная модификация ЛПС Y pestis, обеспечивающая образование молекул со сниженной эндотоксической активностью
Генетические аспекты синтеза ЛПС наиболее полно изучены на модели Es
cherichia coli и Salmonella entenca bv Typhimunum Определены кластеры генов,
кодирующие биосинтез липида А, кора и О-антигена [Coleman, Raetz, 1988, Austm
et al, 1990, Clementz, 1992] Одним из этапов синтеза липида А является процесс
вторичного ацилирования, в котором участвует целый ряд ацилтрансфераз LpxL
(HtrB), LpxP и LpxM (MsbB) [Clementz et al, 1997, Murray et al, 2001] В частности,
показано, что мутация по і єну IpxM в клетках сальмонелл приводила к снижению
степени ацилирования липида А и, соответственно, к снижению вирулентности
(токсичности) на три-четыре порядка [Raetz, Whitfield, 2002] Доступносгь же анно
тированных геномов нескольких штаммов Y pestis
(http //www encbrc org/portal/enc/versimapestis^id^default&subid^yersiniapestis) дает
возможность провести направленный поиск аналогичных генов и их последующий
сайт-направленный мутагенез в клетках возбудителя чумы Исследование струк
турно-функциональной организации ЛПС возбудителя чумы с привлечением ком-
плекса методов бактериологии, аналитической химии, биофизики и иммунологии позволит получить новые сведения о биосинтезе этой молекулы, ее роли в патогенезе и иммуногенезе чумы Это создаст основу для разработки методологии полугнил штаммов чумного микроба с генно-инженерно модифицированным ЛПС, необходимую для конструирования нового поколения вакцинных штаммов со сниженной реактогенностью
Цель исследования: Получение новых данных о структурно-функциональной организации и генно-инженерная модификация липополисахарида Y pestis, направленная на снижение его эндотоксической активности
Задачи исследования:
-
Определить структуру ЛПС из штаммов различных внутривидовых групп Y pestis, выращенных при различных температурах
-
Изучить зависимость эндотоксической активности ЛПС от его структуры
-
Разработать на основе методов генной инженерии и с учетом полученных данных о структурно-функциональной организации ЛПС Y pestis методологию получения штаммов чумного микроба, синтезирующих ЛПС со сниженной эндотоксической активностью
-
Оценить биологические свойства мутантов Y pestis со сниженной эндотоксической активностью ЛПС, включая вирулентность и иммуногенную активность
Научная новизна. В ходе выполнения данной работы получены новые данные о структуре корового олигосахарида штамма биовара onentalis (ssp pestis), а также структуре ЛПС штаммов возбудителя чумы ssp pestis, принадлежащих к биоварам antiqua и medievalis, и подвида caucasica (bv antiqua) Установлено, что структура ЛПС зависит от подвидовой принадлежности и температурных условий культивирования бактерий
Выявлена зависимость биологических свойств Y pestis от структуры ЛПС Установлено, что более высокая степень ацилирования липида А вызывает повы-
шение TNF-or-индуцирующей активности - основного медиатора септического шока в патогенезе инфекций, вызванных грамотрицательными микроорганизмами
Установлено, что мутация по гену IpxM, кодирующему ацилтрансферазу, отвечающую за включение в липид A Y pestis шестого жирнокислотного остатка -лауриновой кислоты, не влияет на вирулентность штаммов чумного микроба "дикого" типа, но снижает вирулентность аттенуированных штаммов Y pestis
Показано, что отсутствие в клетках IpxM мутанта вакцинного штамма EV гексаацильных молекул ЛПС сопровождается сочетанным снижением остаточной вирулентности и повышением протективной активности на модели мышей
Практическая значимость работы. Разработана простая и надежная методика направленного конструирования вакцинных штаммов грамотрицательных бактерий со сниженной реактогенностью Сконструированный штамм Y pestis EVAlpxM, дефектный по синтезу гексаацильных молекул ЛПС, может служить основой для разработки новой вакцины живой чумной В коллекции микроорганизмов ФГУН ГНЦ ПМБ депонированы 4 авторских штамма Y pestis, мутантных по гену IpxM
Внедрение результатов работы Результаты проведенных исследований послужили основой для составления ниже перечисленных документов
Методические рекомендации «Получение очищенных препаратов ЛОС Y pestis» Оболенск, 2004 (учрежденческий уровень внедрения)
Методические рекомендации «Сайг-направленный мутагенез генома чумного микроба» Оболенск, 2004 (учрежденческий уровень внедрения)
Материалы диссертации используются в лекциях для магистрантов факультета биологической и экологической безопасности Пущинского государственного университеаа
Разработанные методические приемы, сконструированные плазмиды и штаммы, а также препараты ЛПС в настоящее время применяются в микробиологических, генетических, молекулярно-биологаческих, иммунологических и других исследованиях ряда лабораторий ФГУН ГНЦ ПМБ (Оболенск, Московская обл), АООТ "Институт инженерной иммунологии" РАО "Биопрепарат" (Любучаны, Мо-
сковская обл), РосНИПЧИ "Микроб" (Саратов), ГИСК им Л А Тарасевича (Москва), Института биоорганической химии им М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН (Москва), Саратовского Государственного университета им НГ Чернышевского (Саратов)
Положения, выносимые на защиту:
1 Выявлены особенности, определяющие современные представления о
структуре ЛПС Y pestis основного подвида биоваров antiqua, medievalis, onentahs, а
также подвидов caucasica и altaica Установлено, что в бактериальной клетке одно
временно образуется несколько структурных вариантов молекул ЛПС, которые от
личаются по степени ацилирования и степени замещения аминоарабинозой фос
фатных остатков в липиде А, по концевым углеводным остаткам в олигосахариде
кора Температура культивирования определяет преобладание определенных
структурных вариантов ЛПС
-
Мутация по гену IpxM, приводящая к избирательному «выключению» синтеза гексаацильных форм ЛПС, вызывает снижение вирулентности аттенуирован-ных штаммов Y. pestis в отношении белых мышей, не вызывая аналогичных изменений при использовании мутантных штаммов Y pestis "дикого" типа
-
Сочетанное снижение остаточной вирулентности и повышение протектив-ной активности вызывается отсутствием в клетках IpxM мутанта вакцинного штамма EV гексаацильных молекул ЛПС Величина LD5o мутанта EVAlpxM при подкожном (и/к) заражении мышей, по сравнению с исходным штаммом, снизились в 4,6 раз, а протективная активность в отношении вирулентного штамма 231 выросла на 2 порядка
Апробация материалов диссертации. Апробация диссертации проведена на межлабораторном научном семинаре сотрудников ФГУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии 24 июля 2007г Результаты работы представлены на 20 научных конференциях, в том числе 7 International Symposium on Yersinia (Nijmegen, the Netherlands, 1998 г), 8th International Symposium on Yersinia (Turku, Finland, 2002 г), Второй научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Даль-
него Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2002 г), 2-ом Московском международном Конгрессе "Биотехнология состояние и перспективы развития" (10-14 ноября 2003 г, Москва), Международной конференции "Предотвращение распространения биологического оружия The cooperative biological research Annual review" (Санкт-Петербург, 12-15 июля 2004 г), 9th International Symposium on Yersinia (Lexington, Kentucky, USA, October 10-14,2006)
Публикации. По теме диссертации опубликовано 30 работ Объем диссертации. Диссертация изложена на 118 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов введение, обзор литературы, описания материалов и методов исследований, изложения результатов исследований, выводов и списка литературы, включающего 36 источников отечественных и 172 - зарубежных авторов Работа иллюстрирована 29 рисунками и 11 таблицами
