Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Поверхностные антигены грамотрицательных бактерий (обзор литературы) 11
1.1. Общая характеристика поверхностных компонентов грамотрицательных бактерий 11
1.2. Поверхностные антигены возбудителя чумы 31
ГЛАВА 2. Материалы и методы 44
2.1. Использованные в работе материалы 44
2.1.1. Штаммы 44
2.1.2. Питательные среды 44
2.1.3. Химические реактивы 44
2.1.4. Диагностические препараты 45
2.1.5. Сыворотки крови 46
2.2. Используемые в работе методы 47
2.2.1. Микробиологические методы 47
2.2.2. Генетические методы 49
2.2.3. Биохимические методы 51
2.2.4. Иммунохимические методы 55
2.2.5. Статистические методы 58
ГЛАВА 3. Идентификация, выделение и физико-химическая характеристика фактора аутоааглютинации возбудителя чумы 59
3.1. Идентификация фактора аутоагглютинации возбудителя чумы 59
3.1.1. Получение и анализ мутантов Y. pestis, различающихся по АА 59
3.1.2. Сравнительный анализ препаратов ЛПС, выделенных из клеток, различающихся по признаку АА 62
3.1.3. Поиск фактора, обусловливающего АА клеток Y. pestis EV76 63
3.2. Выделение ФА из клеток возбудителя чумы 65
3.2.1. Получение и характеристика штамма-продуцента ФА Y. pestis EV76 б/п 65
3.2.2. Разработка метода выделения ФА возбудителя чумы 67
3.3. Анализ физико-химических свойств ФА 75
ГЛАВА 4. Иммунохимическая характеристика фактора аутоагглютинации возбудителя чумы 80
4.1. Получение препаратов для выявления ФА и анти-ФА антител 80
4.2. Сравнительная характеристика ФА и Cafl 81
4.3. Оценка специфичности ФА для Y. pestis 84
4.4. Поиск антител к ФА в сыворотках крови млекопитающих 88
4.4.1. Анализ нормальных сывороток крови различных видов животных 89
4.4.2. Поиск анти-ФА антител в иммунных сыворотках 92
4.4.3. Антитела к ФА в сыворотках крови людей 94
4.5. Оценка возможности использования ФА и анти-ФА антител для повышения специфичности серологических исследований 95
Заключение 100
Выводы 108
Список литературы 109
- Общая характеристика поверхностных компонентов грамотрицательных бактерий
- Получение и анализ мутантов Y. pestis, различающихся по АА
- Разработка метода выделения ФА возбудителя чумы
- Оценка специфичности ФА для Y. pestis
Введение к работе
Актуальность проблемы. Большинство бактерий окружает клеточная стенка, играющая важную роль в их жизнедеятельности. Она предохраняет микробы от механических повреждений и факторов внешней среды, противодействует внутреннему осмотическому давлению, обеспечивает способность бактерий поглощать питательные вещества, взаимодействовать друг с другом. У патогенных бактерий многие поверхностные компоненты являются факторами вирулентности, обусловливающими взаимодействие с клетками хозяина и защиту от бактерицидного действия систем врожденного иммунитета. Некоторые из этих компонентов имеют видоспецифическую структуру, и их идентификация имеет большое значение для создания диагностических препаратов.
У чумного микроба (Yersinia pestis) видоспецифичным антигеном, на выявлении которого основана серодиагностика чумы, является капсульный антиген Cafl. Для создания иммуноглобулиновых и антигенных диагностикумов используется препарат (фракция 1, F1), метод выделения которого был предложен еще в 1952 году (Baker Е.Е., Sommer Н., Foster L.E. et al., 1952). В настоящее время известно, что основным компонентом F1 является специфичный для возбудителя чумы белок Cafl, который кодируется плазмидой рМТ, экспрессируется при 37С и образует капсулу на поверхности бактерий. Однако в препарате F1 могут присутствовать и перекрестно реагирующие антигены (ПРА), поэтому диагностикумы на основе F1 не обладают строгой специфичностью (Косее Л.В., 1992; Andrews G.P., Heath D.G., Anderson G.W. Jr. et al., 1996; Федорова B.A., Девдариани З.Л., 2002). В разные годы были предложены диагностические препараты на основе различных антигенных фракций, выделенных из клеток Y. pestis: мембранных белков (Щербаков А.А., Анисимов П.И., Кондрашин Ю.И., Солодовникова Т.Н., 1984), фракции II (Рыбкин B.C., Кулаков М.Я., Волков Е.А., Свистунов В.М., 1982), фракции V (Божко Н.В., Лебедева С.А., Бичуль O.K. и др., 2005). Диагностические препараты были получены и на основе очищенных антигенов Y. pestis: ЛПС (Вейнблат В.И., Дальвадянц СМ.,
6 Меньшов П.И., 1983), белка S-слоя (Дятлов И.А., Волох О.А., 2004), «мышиного» токсина (Соколов П.Н., Свиридов Г.Г., Степанов В.М. и др., 1992), активатора плазминогена (Вейнблат В.И., 1989). Диагностикумы на основе ЛПС, белка S-слоя, фракции II, фракции V взаимодействовали также с возбудителем псевдотуберкулеза. Препараты на основе «мышиного» токсина и активатора плазминогена были специфичны, однако они не пригодны для выявления вирулентных штаммов Y. pestis, лишенных этих антигенов (Hinnebusch J., Cherepanov P., Du Y. et al., 2000; Lathem W.W., Price P.A., Miller V.L., Goldman W.E., 2007). До настоящего времени единственным сертифицированным методом серодиагностики чумы остается детекция Cafl и антител к нему (Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней, 2009). В то же время выявление Cafl неэффективно для обнаружения Y. pestis в объектах внешней среды и в переносчиках чумы -блохах. Более того, в конце эпизоотии и в некоторых природных очагах чумы выделяются штаммы, не синтезирующие Cafl, но вызывающие заболевание чумой у лабораторных животных и людей (Анисимов А.П., 2002). Создание диагностических препаратов, способных детектировать и такие атипичные штаммы, является актуальной задачей, решению которой будет способствовать поиск и оценка специфичности новых стабильно экспрессируемых поверхностных антигенов Y pestis.
О присутствии на поверхности Y. pestis неидентифицированных компонентов можно судить по способности разных штаммов к аутоагглютинации (АА) - самопроизвольной агрегации клеток в жидкой среде. Известно, что АА бактерий обычно связана с присутствием на их поверхности гидрофобных или способных к агрегации белков, которые участвуют в адгезии микробов к поверхностям и образовании биопленок (Van Houdt R., Michiels C.W., 2005). У патогенных видов эти белки играют существенную роль в вирулентности, поскольку обусловливают прикрепление бактерий к клеткам хозяина и защищают микробы от фагоцитоза и комплемента (Collyn F., Lety М.-А., Nair S. et al., 2002; Barnhart M.M., Chapman M.R., 2006; Fexby S., Bjarnsholt Т., Jensen O.P. et al, 2007).
Признак АА характерен как для Y. pestis, так и для энтеропатогенных видов иерсиний: Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica (Laird W.J., Cavanaugh D.C., 1980). У двух последних видов АА проявляется только при 37С и обусловлена белком YadA (Skurnik М., Bolin I., Heikkinen H. et al., 1984). Фактор аутоагглютинации (ФА) клеток Y. pestis, которые не экспрессируют YadA (Rosqvist R., Skurnik ML, Wolf-Watz. H., 1988), до нашего исследования оставался неизвестным. Различия в АА трех видов иерсиний позволяют предположить, что АА Y. pestis, которая участвует в проявлении вирулентности возбудителем чумы (Брюханова Г.Д., Акиев А.К., Бейер А.П., 1995), может быть обусловлена компонентом, отсутствующим у энтеропатогенных видов. В связи с этим идентификация и характеристика ФА представляет интерес как в плане изучения молекулярных механизмов патогенности Y. pestis, так и для выявления антигена, который может быть полезен при создании новых препаратов для диагностики и профилактики чумы.
Цель исследования: идентификация, выделение, характеристика и оценка диагностической значимости ФА Y. pestis.
Задачи исследования:
Получить мутанты Y. pestis EV76, не проявляющие АА, и идентифицировать компонент, ответственный за проявление этого свойства.
Создать штамм Y. pestis - продуцент ФА и разработать метод выделения ФА.
Охарактеризовать препарат ФА по физико-химическим и иммунохимическим свойствам.
Получить диагностические препараты для выявления ФА и антител к нему.
Провести анализ распространенности ФА-подобных антигенов у различных бактерий и анти-ФА антител в сыворотках крови млекопитающих.
Оценить возможность использования ФА Y. pestis и антител к нему для диагностических целей.
Научная новизна исследования. Впервые идентифицирован фактор, обусловливающий АА клеток возбудителя чумы, и разработан метод его выделения. Впервые получена характеристика нового антигена чумного микроба по физико-химическим и иммунохимическим свойствам.
Установлено, что ФА является перекрестно реагирующим антигеном возбудителя чумы, антитела к которому присутствуют в нормальных и иммунных сыворотках крови млекопитающих, а также в иммуноглобулиновых диагностических препаратах для серодиагностики различных инфекционных заболеваний. Впервые показано, что наличие ФА-подобных антигенов в анализируемых образцах и антител к ним в диагностических сыворотках может обусловливать ложноположительные серологические реакции.
Теоретическая значимость. Выявлен и охарактеризован новый поверхностный антиген Y. pestis, обусловливающий способность клеток к АА, которая у патогенных бактерий связана с проявлением вирулентности. Дальнейшее изучение ФА будет способствовать выявлению его физиологической роли и механизмов его возможного участия в проявлении вирулентных свойств возбудителя чумы.
Значительное количество ФА на поверхности клеток Y. pestis и выработка антител к нему при иммунизации животных живыми и убитыми бактериями свидетельствуют о том, что исследование протективных свойств ФА может способствовать выявлению нового кандидата для включения в химическую противочумную вакцину.
Обнаруженное в работе изменение количества и качества анти-ФА антител у животных и людей при различных патологических состояниях представляет интерес для дальнейших исследований возможности использования этих антител в качестве неспецифического маркера инфекционного процесса.
Практическая значимость. Получен штамм-продуцент ФА (Y pestis EV76 б/п), который не содержит автономных или интегрированных с хромосомой плазмидных репликонов. Штамм депонирован в
Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» под названием Y. pestis КМ 1279 (положительное решение от 14.12.2007, протокол № 22). Этот штамм может быть использован не только для выделения ФА, но и для выделения других белков, кодируемых хромосомными генами.
Разработан простой метод выделения и очистки ФА с поверхности клеток Y. pestis EV76 б/п с целью получения препаративных количеств ФА. Полученный препарат может быть применен для оценки роли ФА в реализации патогенных и протективных свойств возбудителя чумы, а также для адсорбции неспецифических анти-ФА антител из иммунных сывороток.
В работе предложены способы повышения специфичности серологических реакций при диагностике инфекционных заболеваний. Одобрены Ученым Советом и утверждены директором ФГУЗ «Ростовский- на-Дону научно-исследовательский противочумный институт»
Роспотребнадзора (РостНИПЧИ) методические рекомендации «Способ устранения неспецифических серологических реакций с помощью перекрестно реагирующего антигена возбудителя чумы» (протокол № 4 от 27.06.2002). Предложенный метод может быть полезен при конструировании новых препаратов для серодиагностики различных инфекционных заболеваний.
Основные положения, выносимые на защиту:
Возбудитель чумы имеет на своей поверхности ранее неизвестный антиген - фактор аутоагглютинации (ФА), представляющий собой комплекс 17,5 кДа белка с низкомолекулярным компонентом.
ФА Y. pestis является перекрестно реагирующим антигеном: ФА-подобные антигены обнаружены у Yersinia pseudotuberculosis, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa и Proteus vulgaris.
Антитела к ФА присутствуют в сыворотках крови млекопитающих: у здоровых людей и животных - в форме неполных антител, а у больных людей с клинической картиной инфекционного заболевания, а также у, животных, иммунизированных различными антигенами, выявляются и полные антитела.
4. ФА-подобные антигены в анализируемых образцах могут быть инактивированы с помощью нормальной кроличьей сыворотки. Анти-ФА антитела могут быть удалены из иммунных сывороток с помощью препарата ФА или клеток штамма-продуцента Y. pestis EV76 б/п.
Апробация работы. Материалы диссертации были неоднократно доложены на конференциях и заседаниях Ученого Совета в РостНИПЧИ, представлены на 7 Международном конгрессе по проблемам иерсиний в Нимегене (Нидерланды, 1998), на 9 Международном конгрессе по проблемам иерсиний в Лексингтоне (США, 2006), на научной конференции в Институте гигиены и медицинской микробиологии им. Макса фон Петтенкофера в Мюнхене (Германия, 2007), на VII межвузовской биохимической конференции с международным участием «Обмен веществ при адаптации и повреждении» (Ростов-на-Дону, 2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано в соавторстве 10 работ, из них 3 - в периодических изданиях из Перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание искомой ученой степени, 2 -в зарубежной печати.
План диссертационной работы утвержден Ученым советом РостНИПЧИ 28.08.2008 (протокол № 10). Исследования выполнены в рамках плановых тем: «Фактор аутоагглютинации как возможная причина неспецифических реакций при серодиагностике чумы» (№ гос. регистрации 0120.00 00371) и «Характеристика нового сидерофора возбудителя чумы» (№ гос. регистрации 0120.0 410668).
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора (1 глава), изложения материалов и методов (1 глава), результатов собственных исследований (2 главы), заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 141 странице машинописного текста, иллюстрирована 11 таблицами и 15 рисунками. Библиографический указатель содержит 94 отечественных и 182 зарубежных источников.
Общая характеристика поверхностных компонентов грамотрицательных бактерий
ЛПС является важнейшим компонентом внешней мембраны грамотрицательных бактерий (Книрель Ю.А., Кочетков Н.К., 1993; Zhang Н., Peterson J.W., Niesel D.W., Klimpel G.R., 1997; Авдеева М.Г., Шубич М.Г., 2003). В молекуле ЛПС можно выделить три структурные части: липид А, ковалентно связанный с ним коровый олигосахарид и полисахарид - О-антиген. Такое строение придает ЛПС амфифильный характер из-за гидрофобности липида А и гидрофильности О-антигена. Гидрофобная часть ЛПС связана с мембраной, а гидрофильные полисахаридные цепи выступают над поверхностью мембраны. О-антиген, который состоит из повторяющихся олигосахаридных единиц, значительно различается по структуре у разных бактерий и определяет их сероспецифичность (Книрель Ю.А., Кочетков Н.К., 1994; Katzenellenbogen Е., Kocharova N.A., Korzeniowska-Kowal A. et al., 2008). Латеральное взаимодействие между О-цепями стабилизирует наружную мембрану, а также способствует устойчивости бактерий, в частности, к органическим кислотам (Barua S., Yamashino Т., Hasegawa Т. et al., 2002). О-цепи обычно определяют свойства поверхности у бактерий, которые не продуцируют капсул, принимая участие в защите патогенных бактерий от действия факторов врожденного иммунитета хозяина. Некоторые бактерии (например, Y. pestis) вовсе не синтезируют О-полисахаридных цепей и имеют R-форму ЛПС. Глубокие Re-мутанты, синтезирующие очень короткий коровый олигосахарид, не могут включать в наружную мембрану многие белки, на место которых приходят фосфолипиды (Nikaido Н., Vaara М., 1985). Такие бактерии очень чувствительными к липофильным агентам.
Бактерии, имеющие сложный жизненный цикл, синтезируют в разных условиях различающийся по структуре ЛПС. Так, при внутриклеточной локализации бактерий низкая концентрация кальция и магния приводит к активации синтеза ферментов, ответственных за присоединение аминоарабинозных или фосфоэтаноламиновых остатков к фосфатным группам липида А (Сох A.D., Wright J.C., Li J. et al., 2003; Raetz C.R., Reynolds СМ., Trent M.S., Bishop R.E.., 2007). Такая модификация уменьшает заряд и взаимное отталкивание молекул, а также снижает способность ЛПС связывать катионные антибактериальные агенты (например, полимиксин, дефензины).
ЛПС является важным фактором патогенности бактерий (Raetz C.R.H., Whitfield С, 2002). Основным патогенетическим свойством ЛПС является его эндотоксическая активность, связанная со способностью индуцировать лавинообразную экспрессию провоспалительных цитокинов после взаимодействия липида А с иммунокомпетентными клетками, содержащими рецептор TLR4. ЛПС может играть важную роль в развитии аутоиммунных заболеваний (Сварваль А.В., Ценева Г.Я., Шендерович О.А., 2006).
Общий энтеробактериальный антиген. Помимо ЛПС, на поверхности энтеробактерий присутствует и другой гликолипид - общий энтеробактериальный антиген (ЕСА, антиген Кунина). Углеводный компонент этого антигена является линейным полисахаридом, который состоит из повторяющихся трисахаридных единиц (Lugowski С, Romanowska Е., Кеппе L., Lindberg В., 1983). Полисахаридные цепи ковалентно связаны с фосфатными группами фосфолипидов в наружной мембране (Rick P.D., Hubbard G.L., Kitaoka М. et al., 1998). Установлено, что ЕСА является фактором вирулентности S. enterica с/в Typhimurium, повышая резистентность бактерий к действию солей желчных кислот (Ramos-Morales F., Prieto A.I., Beuzon C.R. et al., 2003).
В периплазме бактерий присутствует водорастворимая форма ЕСА, представляющая собой циклический полимер из четырех трисахаридных единиц ЕСА (Kajimura J., Rahman A., Rick P. D., 2005), однако роль этой формы антигена в настоящее время неизвестна. Периплазматическая локализация и циклическая форма сближает эту форму ЕСА с осморегулируемыми гликанами других грамотрицательных бактерий (Bohin J.-P., 2000), однако у ЕСА подобной регуляции не обнаружено (Kajimura J., Rahman A., Hsu J. et al., 2006). В сыворотках крови здоровых людей присутствуют антитела к ЕСА, количество которых снижено в детском и пожилом возрасте (Malkamaki М., 1981).
Белковый компонент наружной мембраны представлен интегральными белками, включенными в липидный бислой (Nikaido Н., 2003). К ним относятся липопротеины, порины, а также различные белки - транспортеры и рецепторы. Липопротеины. Липопротеины представляют собой белки, которые ковалентно связаны по остатку цистеина с г\Г-ацил-8-диацилглицирином (Madan Babu М., Sankaran К., 2002). Наиболее изученными поверхностными липопротеинами являются муреиновый липопротеин (липопротеин Брауна, Lpp), пептидогликан-ассоциированный протеин (Pal), липокалины. Одни из них (например, Lpp и Pal) экспрессируются конститутивно в значительных количествах и принимают участие в поддержании структурной целостности внешней мембраны и ее связи с пептидогликановым слоем, другие (липокалины) - вовлечены в транспорт липидов и биогенез мембран.
Lpp (м. м. 6,3 кДа) является одним из наиболее обильных липопротеинов наружной мембраны грамотрицательных бактерий и соединяет наружную мембрану с пептидогликановым слоем. Антитела к Lpp образуются при инфицировании животных энтеробактериями (Zhang Н., Niesel D.W., Peterson J.W., Klimpel G.R., 1998), а очищенный Lpp действует синергично с ЛПС в процессе развития септического шока, индуцируя фактор некроза опухоли-альфа (ФНОа) и интерлейкин-6 (IL-6) (Zhang Н., Peterson J.W., Niesel D.W., Klimpel G.R., 1997) путем взаимодействия с рецептором TLR-2 на иммунокомпетентных клетках животных (Aliprantis А.О., Yang R.B., Mark M.R. et al., 1999). Мутанты S. enterica с/в Typhimurium с делетированными двумя генами lpp А и ІррВ, кодирующими Lpp, проявляли меньшую подвижность, инвазивность, цитокин-индуцирующую активность и были авирулентны для мышей (Fadl А.А., Sha J., Klimpel G.R. et al., 2005).
Получение и анализ мутантов Y. pestis, различающихся по АА
Иммунохимическую активность бактерий и выделенных из них препаратов определяли с помощью различных методов согласно общепринятым методикам (Самойлова Л.В., Донская Т.Н., Вейнблат В.И. и др., 1998) и рекомендациям фирм-изготовителей диагностических препаратов.
Реакция диффузионной преципитации (РДП) использовалась для выявления антител к ФА в чумной гипериммунной сыворотке, полученной после иммунизации лошадей вакцинным штаммом Y. pestis EV76 НИИЭГ. РДП проводили методом Оухтерлони (Ouchterlony О., 1949) в 1,5 % агарозном геле на фосфатном буфере, рН 7,2.
Агглютинационные тесты. В работе были использованы следующие агглютинационные тесты: 1. Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) или агломерации объемной (РАО) использовались для выявления Cafl, ФА Y. pestis и ФА-подобных антигенов, а также антител к этим антигенам и антител к специфическим антигенам в иммунных сыворотках. Исследуемые образцы титровали в полистироловых планшетах для серологических реакций методом двукратных разведений в ЗФР с 0,05 % твин-80 (для эритроцитарных диагностикумов) или в 1 % НКС на забуференном физрастворе (для диагностикумов на синтетических микросферах). После этого в каждую лунку планшета добавляли соответствующий иммуноглобулиновый или антигенный диагностикум. Через 2-3 часа инкубации при 22С учитывали результаты реакции. Положительная реакция проявлялась в виде «зонтиков» эритроцитов, равномерно выстилающих лунки планшетов. Отрицательная реакция проявлялась в виде «пуговок» на дне лунок. Специфичность реакции подтверждали, используя вместо диагностикума контрольные таннизированные эритроциты барана. 2. Реакция торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА) применялась для контроля специфичности РПГА. Для торможения реакции антигенов использовали нормальные, иммунные и гипериммунные сыворотки, которые добавляли в количестве 16 сывороточных единиц в каждую лунку для серологических реакций. Для торможения РПГА сывороток использовали препарат ФА, который добавляли в каждую лунку в количестве 16 антигенных единиц. Планшеты инкубировали 30-60 мин при 37С, после чего в лунки добавляли соответствующий диагностикум. 3. Реакция нейтрализации антител (РНАт) применялась для определения антигенов и гаптенов Cafl и ФА. Для выявления Cafl использовали лошадиную гипериммунную сыворотку (ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора). После разбавления до двух сывороточных единиц в этой сыворотке остаются только антитела к иммунодоминантному антигену Cafl. Антитела выявляли с помощью чумного эритроцитарного антигенного диагностикума (Казахский НЦ карантинных и зоонозных инфекций). Для выявления ФА использовали полученную автором анти-ФА кроличью сыворотку (см. разд. 2.1.5), разбавленную до двух сывороточных единиц. Анти-ФА антитела выявляли с помощью авторского антигенного ФА-диагностикума (см. разд. 4.1). При поставновке РНАт антигены титровали методом двукратных разведений в планшетах для серологических реакций, и в каждую лунку добавляли две сывороточные единицы сыворотки. После инкубации планшетов при 37С в течение часа в каждую лунку добавляли соответствующие антигенные диагностикумы. Положительная реакция проявлялась в виде «пуговки», образованной на дне лунок эритроцитами, а отрицательная реакция — в виде «зонтиков». 4. Реакция нейтрализации антигена (РНАг) использовалась для выявления неполных антител к ФА. Для этого к раститрованным сывороткам добавляли две антигенные единицы препарата ФА, инкубировали при 37С в течение часа, и в каждую лунку добавляли авторский эритроцитарный иммуноглобулиновый диагностикум на основе анти-ФА антител (см. разд. 4.1). При положительной реакции эритроциты осаждались на дно лунок в виде «пуговки», а при отрицательной реакции — в виде «зонтиков». Иммуноферментный анализ (ИФА) проводили в двух вариациях метода: дот-блот и иммуноблот, в которых использовали нитроцеллюлозные фильтры (Amersham, США; Shleicher and Schuell, Германия) с диаметром пор 0,45 мкм. Для дот-ИФА препараты в концентрации 2,5 мг/мл наносили на фильтры в объеме 2 мкл. Иммуноблоттинг проводили по методу Towbin и Gordon (Towbin Н., Gordon J., 1984), для чего электрофоретически разделенные препараты переносили из ПААГ на нитроцеллюлозные фильтры с помощью электропереноса при 55 мА в течение 1,5-2 часов. После иммобилизации антигенов свободные сайты на нитроцеллюлозных фильтрах нейтрализовали 0,5 % бычьим сывороточным альбумином (Koch-Light). В качестве разводящей жидкости для всех отмывочных процедур использовали ЗФР (рН 7,0) с добавлением 0,01 % Твин-80 (Ferak). Антигены выявляли с помощью различных антител, для чего фильтры инкубировали 1 час при 37С в иммунных сыворотках. ЛПС выявляли с помощью МКА к ЛПС Y. pestis (клон LG 6, рабочее разведение 1:1000, предоставлены зав. лабораторией гибридом РостНИПЧИ Л.П. Алексеевой), которые визуализировали с помощью меченного пероксидазой хрена стафилококкового белка А. Для выявления ФА использовали авторские кроличьи анти-ФА сыворотки (1:50) и меченные пероксидазой хрена вторичные антитела к иммуноглобулинам кролика классов G, М и A (Sigma). Меченые вторичные антитела или белок А визуализировали с помощью 3,3"-диаминобензидина (Serva).
Поиск ФА-подобного антигена у микроорганизмов проводили с помощью РПГА с антительным анти-ФА диагностикумом. Бактерии выращивали при 26 и 37С в жидкой среде LB без аэрации в течение 24 - 48 часов. Плотность культуры доводили средой до 109 м. кл./мл, и взвеси титровали методом двукратных разведений. Результат учитывали через 2-3 часа инкубации при 22С после добавления диагностикума. Специфичность РПГА контролировали в РТПГА с анти-ФА сывороткой.
Поиск анти-ФА антител в сыворотках крови млекопитающих и диагностических препаратах. Сыворотки крови разбавляли в 10 раз ЗФР, инактивировали при 56С 30 мин и титровали методом двукратных разведений. Полные анти-ФА антитела в сыворотках определяли с помощью РПГА с антигенным ФА-диагностикумом. Специфичность реакции контролировали в РТПГА, используя 16 антигенных единиц препарата ФА. Неполные антитела к ФА выявляли в РНАг с помощью препарата ФА Y. pestis, разбавленного до двух антигенных единиц, и антительного анти-ФА диагностикума.
Анти-ФА антитела в иммуноглобулиновых диагностических препаратах (в чумном антифракционном, псевдотуберкулезном, туляремийном и легионеллезном диагностикумах на полиакролеиновых микросферах) выявляли с помощью РАО. В реакции использовали двукратно раститрованный раствор препарата ФА (титр 1:64 с чумным эритроцитарным иммуноглобулиновым диагностикумом), к которому добавляли исследуемые диагностические препараты. Положительная реакция диагностикумов с препаратом ФА свидетельствовала о наличии на поверхности микросфер анти-ФА антител.
Разработка метода выделения ФА возбудителя чумы
Для исследования иммунохимической активности и специфичности ФА нами были получены три диагностических препарата: антигенный ФА-диагностикум, кроличьи сыворотки к препарату ФА и полученный на их основе антительный анти-ФА диагностикум.
Антигенный диагностикум конструировали в соответствии с рекомендациями, приведенными в работах (Леви М.И., Басова Н.Н., Сучков Ю.Г. и др., 1962; Каральник Б.В., 1976). Для его приготовления 10 мл 50 % взвеси таннизированных формалинизированных эритроцитов барана смешивали с 10 мл раствора, содержащего 10 мг препарата ФА Y. pestis, выдерживали при помешивании 8 часов при комнатной температуре и 20 час при 4С. После этого эритроциты пятикратно отмывали ЗФР (рН 7,0), разбавляли физраствором до 0,6 %-ной концентрации и использовали для постановки РПГА микрометодом с чумной гипериммунной лошадиной сывороткой. Положительная реакция сыворотки с диагностикумом (в титрах не менее 1:320 - 1:640), но не с контрольными эритроцитами, свидетельствовала о сенсибилизации эритроцитов препаратом ФА. Для подтверждения специфичности взаимодействия использовали РТПГА с препаратом ФА.
Для получения анти-ФА сыворотки (см. разд. 2.1.5) были отобраны четыре кролика с нулевыми титрами анти-ФА антител, определяемых в РПГА с антигенным ФА-диагностикумом. При исследовании динамики образования анти-ФА антител у кроликов из ушной вены отбирали пробы через 7, 14, 21 и 28 дней после иммунизации. Несмотря на различие в титрах, анти-ФА антитела в крови кроликов появлялись уже через 7 дней (1:80 -1:160), и титр их постепенно увеличивался (максимальный титр - 1:3200) до 28 дней (время наблюдения). Полученные кроличьи сыворотки реагировали как с антигенным ФА-диагностикумом, так и с чумным эритроцитарным антигенным диагностикумом на основе препарата F1, что говорило о присутствии на эритроцитах последнего, кроме Cafl, и ФА-антигена. Как известно, в препарате F1, полученном методом Е.Е. Baker et al. (1952) содержатся, помимо Cafl, примеси других белков (Косее Л.В., 1992; Andrews G.P., Heath D.G., Anderson G.W. Jr. et al., 1996; Федорова В.А., Девдариани З.Л., 2002). Можно предположить, что одним из этих белков является ФА.
Конструирование антительного анти-ФА диагностикума для обнаружения ФА-антигена проводили в соответствии с рекомендациями Б.В. Каральник (1976). Для этого использовали таннизированные бараньи эритроциты, которые сенсибилизировали антителами полученных нами иммунных кроличьих сывороток к препарату ФА. Взвесь 50 % контрольных бараньих эритроцитов инкубировали 2 часа при 45С с цельной иммунной сывороткой в соотношении 1:1, затем добавляли 0,5 % формалина и инкубировали еще 30 минут при 45С. После инкубации эритроциты отмывали пятикратно ЗФР. Полученный диагностикум проверяли в РПГА с препаратами ФА из Y. pestis EV76 б/п, а также с культурами возбудителя чумы и контролировали в РТПГА с анти-ФА кроличьей сывороткой.
Получение диагностических препаратов для определения ФА и анти-ФА антител дало возможность охарактеризовать иммунохимические свойства ФА и оценить его диагностическую значимость.
Иммунохимическая характеристика ФА была проведена в сравнении с диагностическим антигеном Cafl возбудителя чумы. Сравнительный анализ ФА и Cafl показал, что они имеют ряд общих свойств: оба антигена локализованы на поверхности клеток Y. pestis, имеют белковую природу, способны к самоагрегации и сходны по м. м. субъединицы (около 17 кДа). В отличие от Cafl, синтез которого определяется высокомолекулярной плазмидой Y. pestis и индуцируется при 37С, ФА экспрессируется независимо от присутствия плазмид и температуры выращивания бактерий. Гель-электрофорез препаратов в ПААГ в денатурирующих условиях также выявил их различие. Так, белковые агрегаты, образуемые ФА, были устойчивы к действию 2-меркаптоэтанола и ДСН, поэтому ФА выявлялся в виде множественных полос, a Cafl - в виде одной полосы с подвижностью на уровне белка с м. м. 17 кДа (рис. 11).
Исследование препаратов ФА и Cafl с помощью различных иммунохимических методов, показало, что антитела к обоим антигенам, имеющим разную иммунохимическую специфичность, содержатся в чумной гипериммунной лошадиной сыворотке. Так, в РДП с этой сывороткой препараты давали по одной линии преципитации, что указывало на присутствие в них по одному антигену (рис. 12а). При этом препараты не имели перекреста между собой. Об иммунохимической неидентичности двух антигенов свидетельствовали и результаты истощения сыворотки препаратом ФА - в этом случае в ней сохранялись анти-Cafl, но не анти-ФА антитела (рис. 126). Оба антигена выявлялись в РДП с разной чувствительностью: Cafl давал четкую линию преципитации при нагрузке 5 мкг на лунку, тогда как для ФА эта доза составляла 200 мкг.
Оба препарата реагировали в РПГА с чумным иммуноглобулиновым диагностикумом, при этом реакция с ФА тормозилась анти-ФА кроличьей сывороткой, а реакция с Cafl тормозилась анти-Cafl сывороткой. Также как и в РДП, в РПГА оба антигена выявлялись с разной чувствительностью: для Cafl минимально выявляемая доза антигена составляла 1 нг, а для ФА - 100 нг. Полученные данные свидетельствовали о том, что в чумной гипериммунной лошадиной сыворотке анти-Cafl антитела значительно преобладают над анти-ФА антителами. В этой связи ФА не выявлялся в РНАт, в которой используется разбавленная до 2 агглютинирующих единиц чумная гипериммунная сыворотка и чумной антигенный диагностикум на основе F1.
Сравнение препаратов ФА и Cafl в иммуноблоте с анти-ФА сывороткой показало, что препарат ФА выявлялся в виде множественных полос (рис. 136), как и на окрашенных Кумасси R-250 электрофореграммах (рис. 13а). Антитела к Cafl в анти-ФА сыворотке не выявлялись. В нормальной кроличьей сыворотке (НКС) антитела к обоим антигенам методом иммуноблота не визуализировались (рис. 13в).
Оценка специфичности ФА для Y. pestis
Поскольку в различных иммунных сыворотках были обнаружены анти-ФА антитела, мы решили проверить, сохраняются ли эти антитела в диагностических препаратах, полученных на основе таких сывороток. Проверка способности ФА реагировать с антительными диагностикумами для выявления различных инфекционных заболеваний, показала, что они также содержат анти-ФА антитела. Так, в РАО чумной антифракционный, псевдотуберкулезный, туляремийный, легионеллезный антительные диагностикумы выявляли ФА с чувствительностью (минимально выявляемая доза ФА составляла 200-300 нг), лишь незначительно уступающей эритроцитарному чумному иммуноглобулиновому диагностикуму (минимально выявляемая доза 100 нг). Способность ФА взаимодействовать с различными антительными диагностическими препаратами может явиться причиной ложноположительных серологических реакций при диагностике инфекционных заболеваний.
В литературе описаны случаи ложноположительных реакций при выявлении Y. pestis (Топорков В.П., Марин С.Н., Денисенко И.И., 1980; Сучков Ю.Г., Филимонова Ю.А., Аболина Т.А., Кальной СМ., 1983). Одной из причин этого явления может быть наличие у бактерий ПРА и присутствие антител к ним в диагностических сыворотках. Для повышения специфичности иммунохимических исследований были предложены различные методы, в том числе, использование МКА. Однако применение моноклональных диагностических препаратов также не гарантирует абсолютную специфичность реакций (Иванова И.А., Монаенков А.О., Пешкова В.Г., Медведева Н.А., 2004; Khushiramani R., Tuteja U., Shukla J., Batra H.V., 2004; Otte L., Knaute Т., Schneider-Mergener J., Kramer A., 2006). Выявленное нами присутствие в различных иммунных сыворотках полных и неполных антител к ФА может представлять определенную проблему при иммунохимических исследованиях. Диагностикумы на основе таких сывороток будут выявлять, помимо специфического антигена, еще и перекрестно реагирующий ФА-подобный антиген и в РПГА или РАО, в которых и полные и неполные антитела иммобилизуются на носителе, и в ИФА, в котором оба типа антител могут быть помечены ферментом.
Поскольку ФА-подобные антигены были обнаружены у представителей нормофлоры млекопитающих (К. pneumoniae, P. vulgaris), существует высокая вероятность их присутствия в пробах от больных при серологическом выявлении возбудителей инфекционных заболеваний. Как было показано ранее (см. разд. 4.3), кипячение и обработка бактериальных образцов формалином приводили к устранению иммунохимической активности ФА-подобных антигенов К. pneumoniae, P. aeruginosa, P. vulgaris — бактерий, часто встречающихся в смывах из объектов окружающей среды и в пробах от больных. Такая обработка регламентирована для серодиагностики возбудителей опасных инфекций: Y. pestis, F. tularensis, V. cholerae (Самойлова Л.В., Донская Т.Н., Вейнблат В.И., 1998). При этом происходит не только дезинфекция образцов, но и, как показали наши исследования, инактивация ФА-подобных антигенов посторонней микрофлоры. То, что предварительная инкубация в 4 % формалине в течение часа образцов сложного бактериального состава повышает достоверность результатов серологического исследования при детекции Y. pestis было выявлено В.Н. Ходаковской с соавт. (2002). Однако при серодиагностике возбудителей многих других инфекционных заболеваний такая обработка не предусмотрена. В этом случае при использовании иммуноглобулиновых тест-систем, содержащих примеси неспецифических анти-ФА антител, возможны ложноположительные результаты.
Для устранения реакций, обусловленных ФА-подобными антигенами, мы использовали блокирование эпитопов ФА антителами кроличьей анти-ФА сыворотки. В работу были взяты культуры бактерий, экспрессирующих ФА-подобный антиген (Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, К. pneumoniae, P. aeruginosa, P. vulgaris). Взвеси этих бактерий положительно реагировали с гетерологичными иммуноглобулиновыми диагностикумами в РПГА (чумным) и в РАО (чумным антифракционным, псевдотуберкулезным, туляремийным, легионеллезным). Для устранения этого взаимодействия суспензии бактерий (5 х 109 м. кл./мл) инкубировали в течение 1 часа при 37С в 1 % кроличьей анти-ФА сыворотке Анализ суспензий после инкубации с сывороткой показал, что они перестали реагировать с гетерологичными иммуноглобулиновыми диагностикумами.
Поскольку нормальные сыворотки крови млекопитающих содержат неполные антитела к ФА (см. разд. 4.4.1), их добавление к образцам, содержащим ФА-подобный антиген, также могло способствовать устранению реакций с гетерологичными диагностикумами. Проверка способности НКС в качестве разводящей жидкости устранять положительную реакцию очищенного антигена ФА Y. pestis (титр в ЗФР с Твин-80 - 1:64) с чумным иммуноглобулиновым диагностикумом, а также с ФА-диагностикумом, показала, что 1 % НКС только способствовала снижению титра до 1:16. Более эффективным способом устранения реакций, обусловленных ФА-антигеном, оказалась раститровка проб в 10 % НКС с предварительной инкубацией планшетов при 37С в течение часа перед добавлением диагностикума или инкубация анализируемых проб в течение 1 часа при 37С в 10 % НКС с последующей постановкой реакции.
В течение многих лет 1 % НКС используется в качестве разводящей жидкости при постановке РПГА и РАО. Было показано, что НКС может быть использована для повышения специфичности серологических реакций при детекции возбудителя чумы в пробах сложного бактериального состава (Ходаковская В.Н., Мишанькин Б.Н., 2002), однако, исследования причин этого явления не проводилось. Результаты наших исследований позволяют судить о возможных механизмах этого феномена: присутствие в НКС неполных анти-ФА антител может блокировать антигенные детерминанты неспецифических ФА-подобных антигенов в анализируемых пробах.
