Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Мутации бактерии по факторам питания
1.1. Спонтанные и индуцированные мутации 10
1.2. Методы получения и определения частоты появления мутантов 18
1.3. Характер питания возбудителя чумы 19
1.4. Мутации возбудителя чумы по факторам питания 32
Собственные исследования
Глава 2. Материал и методы
2.1. Сведения о штаммах 38
2.2. Сведения о питательных средах 57
2.3. Методика получения мутантов с пониженными потребностями в факторах роста и определение частоты их появления 60
2.4. Методы изучения свойств мутантов 61
2.5. Метод статистической обработки материала 65
ГЛАВА 3. Мутанты чумного микроба с пониженными потребностями в факторах роста в зависимости от состава минимальных сред и места выделения исходных штаммов
3.1. Частота появления мутантов чумного микроба из природных очагов сусликового типа 67
3.2. Частота появления мутантов чумного микроба из природных очагов сурочьего типа 72
3.3. Частота появления мутантов чумного микроба из природных очагов песчаночьего типа 77
3.4. Частота появления мутантов чумного микроба из полевочьего и пищухового типов очагов 80
3.5. Частота появления мутантов из штаммов чумного микроба, выделенных в природных очагах чумы некоторых зарубежных стран. 82
3.6. Обнаружение диких штаммов возбудителя чумы с пониженными потребностями в факто рах роста 84
ГЛАВА 4. Свойства мутантов чумного микроба с пониженными потребностями в факторах роста
4.1. Культурально-морфологические и биохимические свойства 86
4.2. Стабильность мутантов чумного микроба с пониженными потребностями в факторах роста при многократном пассировании их через организм белых мышей 93
4.3. Подавление метионином роста мутантов чумного микроба, зависимых от цистеина и сульфита натрия 93
4.4. Отношение мутантов чумного микроба с пониженными потребностями в факторах роста к антибиотикам 95
4.5. Характеристика вирулентности мутантов чумного микроба с пониженными потребностями в факторах роста 100
Заключение из
Выводы 126
Литература 127
- Характер питания возбудителя чумы
- Методика получения мутантов с пониженными потребностями в факторах роста и определение частоты их появления
- Частота появления мутантов чумного микроба из природных очагов песчаночьего типа
- Стабильность мутантов чумного микроба с пониженными потребностями в факторах роста при многократном пассировании их через организм белых мышей
Введение к работе
Штаммы возбудителя чумы из разных природных очагов отличаются по некоторым свойствам (Берлин, Борзенков, 1938; Devignat, 1951; Туманский, 1958; Леви с со-авт., 1961; Мартиневский, 1963а). Одним из возможных дифференциальных признаков являются особенности потребностей в факторах роста. Установлено, что этот признак сравнительно стабилен. Показана перспективность его использования для районирования природных очагов чумы (Мартиневский, 1973; Найден, 1983), изучения генетики и таксономии возбудителя (Мартиневский, 1963а, 1973; Степанов, 1968а; Тимофеева с соавт., 1971; Классовский, Степанов, 1975; Пейсахис, Степанов, 1978; Сучков, 1980).
В природных очагах чумы, наряду с типичными, встречаются и отклоняющиеся по тем или иным свойствам формы, в том числе, и по особенностям питания. Установлено, что из культур, зависящих от нескольких аминокислот или витаминов, можно получить мутанты, способные расти на минимальной среде с уменьшенным их количеством или вовсе без них (Мартиневский, 1963а, 1968; Степанов, 1968а). Такие мутанты ранее называли мейотрофными (Englesberg, Inguabam, 1957), гипотрофными (Мартиневский, 1965а, 1968а), прототрофными (Сучков, Канатова, 1967; Степанов, 1968а; Апарин, 1980; Сучков, 1980). Учитывая, что ни один из перечисленных терминов не получил общего признания, мы предпочитаем именовать такие формы мутантами с пониженными потребностями в факторах роста. Появление подобных мутантов (обратные мутанты в широком смысле, то есть истинные реверсии или депрессия оупрессорных мутаций) сводится к тому, что штам - 6 мы, выращенные на среде, не содержащей необходимого для них фактора роста, вырастают в виде отдельных колоний (Ауэрбах, 1978).
Мутанты с пониженными потребностями в факторах роста уже были получены из штаммов Среднеазиатского пустынного (Марти-невский, 1965а), Закавказского высокогорного (Степанов с со-авт., 1972), Тувинского (Лясоцкий с соавт., 1980), Горно-Алтайского (Апарин, 1980), Забайкальского очагов, Монголии (Логачев, 1980; Равдоникас с соавт,, 1980), Прибалхашского автономного очага (Мартиневский с соавт., 1972). Однако в большинстве работ не была определена частота возникновения таких мутантов, число исследуемых штаммов было, как правило, ограниченным, далеко не всегда изучалось влияние мутации к прототрофности на другие свойства возбудителя. Более того, для ряда природных очагов такие исследования вообще не проводились.
Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы являлось получение и изучение свойств мутантов возбудителя чумы с пониженными потребностями в факторах роста из различных природных очагов. Поставленная цель достигалась решением конкретных задач:
- разработать доступную и эффективную методику выделения мутантов с пониженными потребностями в факторах роста из штаммов различного географического происхождения;
- изучить частоту и особенности появления таких мутантов у штаммов из разных природных очагов чумы;
- выяснить возможную связь мутации к пониженным потребностям в факторах роста с культурально-морфологическими, биохимическими свойствами, вирулентностью и другими признаками возбудителя чумы;
- определить чувствительность мутантов к антибиотикам;
- показать перспективность использования результатов экспериментов по изучению возможности реверсии по питательным потребностям для дополнительной характеристики природных очагов чумы.
Научная новизна. Впервые определены частота и особенности появления спонтанных мутантов чумного микроба с пониженными потребностями в факторах роста у штаммов из ряда природных очагов нашей страны и некоторых зарубежных стран. Предложены оптимальные и эффективные среды для выявления таких мутантов из штаммов чумного микроба разных очагов. Изучено отношение мутантов к некоторым антибиотикам, показана перспективность использования подобных мутантов в типизации природных очагов чумы. Установлено отсутствие связи мутации к пониженным потребностям в факторах роста с вирулентностью чумного микроба.
Практическая ценность. Предложена дифференциальная метка, связанная с мутацией к прототрофности, для штаммов из некоторых очагов. Разработана рациональная методика выявления мутантов с пониженными потребностями в факторах роста в популяциях бактерий чумы из разных природных очагов (рекомендованы синтетические питательные среды, наиболее эффективные для выделения мутантов, определены посевные дозы бактерий из разных очагов, установлены сроки инкубации). Предложено использование полимиксина и эритромицина в целях улучшения бактериологического исследования грызунов и их блох на чуму в очагах, где циркулируют штаммы, высоко резистентные к этим антибиотикам. Составлены и утверждены методические рекомендации (протокол № 14 от 15.11,82 заседания Ученого Совета Среднеазиатского научно-исследовательского противочумного института), получены удостоверения на рационализаторские предложения (J№ 86 и 87 от 30.12.81).
Апробация работы. Основные результаты исследований доложены на научных конференциях Среднеазиатского научно-исследовательского противочумного института, Ш-ем Объединенном съезде гигиенистов, эпидемиологов, микробиологов и инфекционистов Казахстана (Алма-Ата, 1980), Всесоюзном совещании "Итоги и перспективы изучения очагов полевочьего типа и Гис-сарского природного очага чумы" (Душанбе, 1981), П-ой Межреспубликанской научно-практической конференции противочумных учреждений Средней Азии и Казахстана по профилактике чумы (Алма-Ата, 1981), научной конференции молодых ученых и специалистов, организованной Казахским научно-исследовательским ветеринарным институтом Восточного отделения ВАСХНИІ совместно с Казахским научно-исследовательским институтом эпидемиологии, микробиологии и инфекционных болезней Министерства здравоохранения Казахской ССР (Алма-Ата, 1981).
Обсуждение диссертации проведено на научной конференции Среднеазиатского научно-исследовательского противочумного института и на заседании секции Ученого Совета Института микробиологии и вирусологии АН Казахской ССР, объединяющей лаборатории физиологии роста микроорганизмов, генетики и селекции микроорганизмов, антибиотиков (Алма-Ата, 1982).
Публикации. По теме диссертации опубликовано семь статей.
Структура и объем работы, диссертация состоит из введе - 9 ния, обзора литературы, трех глав собственных исследований, заключения и выводов, списка используемой литературы, который содержит 224 наименования, из них 148 - отечественных авторов» Диссертация написана на 151 странице машинописи, иллюстрирована 10 рисунками и 16 таблицами.
Характер питания возбудителя чумы
Общие сведения о питательных потребностях возбудителя чумы Проблеме питания чумного микроба посвящены многочисленные исследования (Rao, 1939, 1940; Berkman, 1942; Doudoroff, 1943; Herbert, 1949; Englesbergf 1952; Rockenmacher et al., 1952; Hills, Spurr, 1952; Silverman et al., 1954; Burrows, Bacon, 1954bj Губарев с соавт., 1955, 1956; Домарадский, Иванов, 1955, 1957; Brownlow, Wessman, I960; Мартиневский, 19636, 1964а). Однако многие данные крайне противоречивы.
Например, Rao (1939, 1940) установил, что в жидких синтетических средах культивирование вирулентного штамма возможно в присутствии аланина, лейцина, гликокола, пролина, фенилалани-на, лизина, аргинина и цистина. Исключение из состава среды аланина, лейцина или аргинина не оказывало влияния на рост. Пролин, фенилаланин, цистин он относил к числу незаменимых аминокислот. Гликокол, по его данным, является дополнительным фактором роста По данным же Doudoroff (1943), фенилаланин в концентрации 0,0002$ поддерживает рост, хотя микроб можно "приучить" обходиться без него. Потребности неадаптированных штаммов в фенил-аланине не удовлетворяются тирозином, триптофаном, фенидукеус-ной кислотой. С другой стороны, цистеин заменим сульфитом, тиосульфатом, гомоцистеином, но не метионином.
Было показано, что для роста чумного микроба аминокислоты являются незаменимыми источниками органического азота (Herbert, 1949; Jackson, Burrows, 1956; Домарадский, 1956; Мартиневский, 1963а, 1966; и др.).
При изучении питания 20 вирулентных и авирулентных штаммов И.В.Домарадский (1956, 1957), И.В.Домарадский и В.А.Иванов (1957) установили, что возбудитель чумы для своего роста требует цистеин, метионин, фенилаланин, серии и треонин, а пролин и триптофан являются добавочными факторами его роста.
Многие авторы указывали, что для роста чумного микроба необходимы серусодержащие аминокислоты (Rao, 1939, 1940; Dou-doroff, 1943; Hills and Spurr, 1952; Домарадский, 1956, 1957). Так, Englesberg (1952) показала, что авирулентный штамм чумного микроба A-II22 на синтетической среде, содержащей в своем составе помимо солей DL-фенилаланин, DL-валин, Db-изолейцин, может расти лишь при добавлении к ней метионина и. тиосульфата натрия, В присутствии последнего только DL-гомопистеин или L-цистатионин могли в незначительной степени заменять метионин, в то время как сульфат, сульфид, сульфит и L-цистеин были неактивны. В присутствии тиосульфата, метионин поддерживал рост микроба при добавлении к среде сульфита, сульфида и L-пистеина, но не сульфата или гомоцистеина. Кроме того, из штамма A-II22 был получен ряд субкультур чумного микроба, использовавших в качестве единственного источника серы сульфит, сульфид или пис-теин. Однако они не росли, если единственным источником серн в среде являлся гомоцистеин, цистатионин или даже метионин. Данные, полученные Englesberg, свидетельствуют о способности чумного микроба при определенных условиях к синтезу серусодержащих аминокислот из некоторых неорганических серусодержащих соединений.
Показано также, что в определенных условиях чумной микроб ассимилирует и сульфаты. В опытах с метионинзависимым ауксо-трофным штаммом Ш метка s 5 -сульфата обнаруживалась в цистеи-не. Более восстановленные формы неорганической серы практически подавляли включение HagS o . Аналогичный эффект обусловливает цистеинсульфиновая кислота. Соответствующую цепь реакций можно представить таким образом: сульфат сульфит тиосульфат —: сульфид цистеин. В синтезе пистеина, по-видимо му, также участвует и цистеинсульфиновая кислота (Король с со - 22 -авт., 1973).
И.В.Домарадский (1956), В.Д.Егорова и И.В.Домарадский (1958) показали, что наряду с аминокислотами, легко окисляемыми микробом, имеются и такие аминокислоты, которые ими не окисляются и не дезаминируются. В частности, к их числу относится М6ТИ0НИН. В то же время, по данным И.В.Домарадского и В.Д.Егоровой (1958), цистеин в процессе роста чумного микроба на искусственных питательных средах превращается в метионин. Превращение цистеина в метионин носит необратимый характер (Домарад-ский, 1957).
Полученные данные о распаде цистеина под влиянием чумного микроба указывают на то, что процесс катализируется ферментом, сходным с типичной цистеиндесульфгидразой бактерий. Возможно, у штаммов чумного микроба, естественных ауксотрофов по серусодер-жащим аминокислотам, также нарушены различные стадии биосинтеза цистеина и метионина. Именно такое представление кажется наиболее убедительным для объяснения причины разнообразия питательных потребностей природных штаммов и разноречивости сведений о возможности превращения цистеина в метионин (Ряпис, Король и др., 1971).
Методика получения мутантов с пониженными потребностями в факторах роста и определение частоты их появления
Предложенные ранее методики выделения мутантов с пониженными потребностями в факторах роста (Мартиневский, 1963; Степанов с соавт», 1972; Лясоцкий с соавт., 1980; Апарин, 1980; Логачев, 1980) не описывали количественный состав сред, посевные дозы, сроки инкубации. Нами для выделения мутантов с пониженными пот - 61 ребностями в факторах роста были предложены две среды: среда "А" с сульфитом натрия и среда "А" с солянокислым цистеином (4,0 мг на 100 мл среды). В процессе работы оказалось, что достаточно пользоваться одной средой, в 100 мл которой содержатся 300 мг глюкозы, 50 мг сульфита натрия и 2,0 мг солянокислого цистеина. Посев культур, не имеющих зависимости от дополнительных факторов роста (Среднеазиатский пустынный, Тяньшанский, Закавказский равнинно-предгорный очаги, Вьетнам, Китай, Мадагаскар, Монголия), на такую среду мы проводили в дозе 10 микробных клеток. Штаммы, требующие для своего роста дополнительно лейцин или триптофан (из упомянутых выше очагов), в дозе 10 микробных клеток с добавлением метионина, фенилаланина и треонина по 3,0 мг на 100 мл среды. Пролинзависимые штаммы из Центрального Кавказа засевали на среду указанного состава. Предложенный нами способ выделения мутантов чумного микроба с пониженными потребностями в факторах роста значительно облегчил труд их выделения, привел к экономии минимальных сред, аминокислот и других реактивов (Мартиневский, Аракелян, 1981).
Определение частоты появления мутантов с пониженными потребностями в факторах роста проводили методом посева двухсуточной культуры каждого штамма на указанные среды Ш 1-7 (таблица 3) в дозе ICF- М.К. Частота появления мутантов условно выражена выходом колоний мутантов. Посевы инкубировали в течение 14 суток с ежедневным их просмотром.
Изучение характера ферментации. Ферментацию изучали на жидких средах Гисса, содержащих 1% углеводов и индикатор бромти-моловый синий, уреазную активность, способность восстанавливать нитраты в нитриты, отношение к чумному и псевдотуберкулвзному фагам - согласно "Наставлению по изучению свежевыделенных штаммов возбудителя чумы" (Кяассовский с соавт., 1972).
Метод определения чувствительности к антибиотикам. Чувствительность к антибиотикам определяли методом отпечатков по Le-derberg and Lederberg (1952) и выборочно - методом серийных разведений в жидкой питательной среде (рекомендованным Комитетом экспертов ВОЗ и утвержденным Комитетом антибиотиков Министерства здравоохранения СССР), При первом методе использовали агар на переваре Хоттингера, при втором - бульон Хоттингера. Посевы инкубировали при 28 и ежедневно, на протяжении пяти суток, визуально проводили учет роста штаммов. За минимальную подавляющую концентрацию (МІЖ) принимали такую концентрацию препарата, которая подавляла рост испытуемого штамма на протяжении двух суток.
Определение детерминантов вирулентности. Детерминанты вирулентности по Burrows (1962) исходных штаммов и их мутантов выборочно изучали согласно указанному выше "Наставлению". Правда, в некоторых случаях мы выбирали наиболее приемлемые для изучения большого количества штаммов и их мутантов методики. Мы определяли следующие детерминанты вирулентности: кальцийзависи-мость, наличие фракции I (fra+), продукцию пестицина I (pst+), пигментацию на среде Джексона-Бэрроуза. Символы этих детерминантов приведены согласно рекомендациям Demerec et al. (1966) и Brubaker (1972).
Определение кальцийзависимости. Higuchi and Smith (1961) сконструировали так называемую "магниево-оксалатную" среду, на которой при 37 способны расти только авирулентные клетки чумного микроба. В наших опытах среда состояла из агара Хоттингера, на 100 мл которого добавляли 9,2 мл 0,25 молярного раствора окса-лата натрия, 4,6 мл 0,5 молярного раствора хлористого магния и вместо 5,0 мл дефибринированной крови барана - 5,0 мл гемолизиро - 63 -ванной крови» Агаровые пластинки, засеянные в дозе 5 х 1Сп микробных клеток, инкубировали при 37 в течение 40-42 часов, затем подсчитывали число выросших, независимых от кальция колоний. Дня определения числа зависимых от ионов кальция колоний посевы помещали в термостат при 28 на 30-48 часов.
По данным литературы свойство кальцийзависнмости может коррелировать с синтезом VW антигенов (Brubaker, Surgalla, 1964), Л.И.Терентьевой (1967) было показано, что вирулентные клетки кальцийнезависимы при инкубации ниже 32 Поэтому в наших опытах температуру термостата проверяли термографом.
Наличие фракции I (f а+) определяли при помощи реакции пассивной гемагглютинации (Meyer, 1950; Леви, Момот, 1961; Сучков, Канатов, 1965), Постановку данной реакции проводили согласно "Инструкции по применению серологических методов диагностики при эпизоотологическом обследовании природных очагов чумы" (Марин с соавт., 1974) с использованием чумного эритроцитарного ан-тителъного диагностикума, изготовляемого Среднеазиатским научно-исследовательским противочумным институтом.
Для установления пестициногенности на питательные агаровые пластинки "точками" засевали 4-6 штаммов. Инкубация при 28 длилась трое суток. Затем на протяжении двадцати минут культуры убивали парами хлороформа и после "проветривания" в стерильных условиях производили посев индикаторной культуры путем наложения на поверхность агара стерильного кружка фильтровальной бумаги, пропитанного взвесью бактерий индикаторного штамма (№ 999 "АМВ" из Закавказского высокогорного очага, E.coli 9 ). После двухсуточного выращивания при 28 производили учет результатов. При положительном - вокруг активных колоний наблюдали зону подавления, а в некоторых случаях - полное отсутствие роста.
Частота появления мутантов чумного микроба из природных очагов песчаночьего типа
Результаты изучения мутации штаммов чумного микроба из очагов песчаночьего типа представлены в таблице 7,
Отсутствие мутантов на среде с цистеином отмечали у штаммов Устюртского и Мангышлакского автономных очагов. Это можно объяснить лейцинзависимостью исходных культур. Следует отметить также, что на Устюрте обнаружены единичные дикие штаммы, рост которых дополнительно зависит от аргинина (Степанов с соавт,, 1974а; Мартиневский с соавт,, 1980а). Такие данные свидетельствуют о наличии, хотя и редкой, изменчивости возбудителя чумы на Устюрте по характеру питания.
Аналогичные по характеру питания штаммы из Муюнкумов, Ура-ло-Эмбенского междуречья, Предустюрта, Приаральских Каракумов, Кызылкумов, Прибалхашья и Закавказского равнинно-предгорного очага образуют мутанты на среде с цистеином. Поэтому мы рекомендуем использовать такую среду для получения мутантов у штаммов из этих очагов. Частота появления мутантов с пониженными потребностями в факторах роста на средах без цистеина, с цистеином, цистеином и мвтионином могут быть приняты во внимание при изучении генетических особенностей штаммов, выделяемых в песчаночьем и не которых других типах очагов чумы,
Закавказский высокогорный (полевочий тип очага). При изучении двадцати штаммов (таблица 2) нами, как и другими исследователями, установлена высокая чувствительность их к пастицину I, продуцируемому штаммами из различных природных очагов, отсутствие у них пестицин-фибринолизинкоагулазной системы (Мартиневский, 1963а, 1964а, 19656) и своеобразие питательных потребностей. Показано также, что рост этих штаммов при 28 зависит от аргинина, тирозина, фенилаланина, цистеина и тиамина (Классовский, Мартиневский, Степанов, 1972; Сучков с соавт,, 1980), Установлены и другие особенности штаммов, циркулирующих в этом очаге: ферментация рамнози, отсутствие ферментации арабинозы, положительная реакция дени-трификации, высокая вирулентность для белых мышей, низкая - для морских свинок, малоазийских и малых сусликов, неспособность вызывать бактериемию у двух последних видов грызунов. Наличие таких свойств у штаммов из Закавказского высокогорного очага побудило некоторых авторов даже отнести их к особым таксономическим категориям микроорганизмов: Pasteurella pestis semiplenus (Михайлова, 1964); сурчиная разновидность (Туманский с соавт.,1964); Pastearella microticida, Yersinia pestocidae parvocaucasica (Мартиневский, 1964a, 1965B), Yersinia pestoides caucasica semiplenus Mich. (Тимофеева, 1972). Однако Всесоюзное совещание "Итоги и перспективы изучения очагов чумы полевочьего типа и Гис-сарского очага чумы" (Душанбе, 1981) рекомендовало циркулирующие здесь штаммы считать штаммами чумного микроба Yersinia pestis с характерными для данного очага свойствами.
Из культур чумного микроба Закавказского нагорья без воз - 81 действия мутагенов выделены мутанты, обладающие пониженной потребностью в факторах роста вплоть до зависимости от одного только тиамина (Степанов с соавт., 1972). Путем последовательных пассажей мутантов мы также получили формы с довольно низкой питательной потребностью: thi "ars phe ; thi""arg j thi "cys" ; thi".
Горно-Алтайский (пищуховый тип очага)» За двадцать лет со времени открытия пищухового типа очага в Горном Алтае выполнен значительный объем экспериментальных исследований, направленных на изучение его довольно сложной этиологической, биоценотической и пространственной структуры (Тарасова, 1975). Характерно, что штаммы чумного микроба, выделенные в Горном Алтае, отличаются от всех других представителей рода Yersinia потребностью в факторах роста.
Для выделения мутантов с пониженными питательными потребностями в опыт было взято пять горноалтайских штаммов с типичными для этого очага свойствами. Штаммы засевали на среды, отличающиеся по составу от сред, приведенных в таблице 3, а, именно: J I - среда "А" с глюкозой и сульфитом натрия; Л 2 - В I + аргинин; ЛЗ - J62.+ лейцин; Ш 4 - № 3 + фенилаланин; № 5-Л4 + цистеин; № 6 - 5 + треонин. Уже через сутки инкубации при 28 наблюдали хорошо выраженный рост культур на среде Л 6. На среде без треонина (.№ 5) отмечали только слабый рост. На 4-6 сутки на среде $ 4 появлялись отдельные колонии, повторный пересев которых дал культуры, растущие без цистеина. В более поздние сроки инкубации (7-9 сутки) наблюдали рост единичных колоний на среде № 3. Оказалось, что лучшим способом отбора мутантов, зависимых только от аргинина и лейцина, является посев на среду $ 3 колоний, ранее выросших на среде В 4. Селекционировать мутанты, независимые от аргинина и лейцина не удалось. На средах, содержащих лишь аргинин или лейцин, при дди - 82 тельном (до пятнадцати суток) выращивании также не было роста.
Частота появления мутантов с, пониженными потребностями в факторах роста была различной. На среде № 5 независимые от треонина (axg leu" phe" cys") колонии появлялись с частотой 6,5 і і 0,2 х 10 , на среде J 4 (мутанты ars" leu" pbO - 4,5 - 0,1 х 10 . Пересев arg leu" phe"" колоний на среды Ш 1-3 дал возможность получить a g leu" клетки только на среде № 3 с частотой 4,0 ± 0,1 х КГ7.
Стабильность мутантов чумного микроба с пониженными потребностями в факторах роста при многократном пассировании их через организм белых мышей
При изучении питательных потребностей у выделенных мутантов мы наблюдали феномен подавления роста метионином некоторых зависимых от цистеина ( cys") и сульфита натрия ( cys+) мутантов возбудителя чумы. Так, эти мутанты не росли при добавлении в среду "А" с цистеином 0,05 мг/мл метионина (таблица 10).
Видимо, в этом случае происходит модуляция активности ферментов биосинтеза циотеина и метионина, подобно тому, что наблюдалось в случае биосинтеза лейцина, изолейцина и валина (Burns et al., 1966),
Как видно из таблицы 10, cys+ и cys" мутанты по отношению к метионину можно разделить на четыре группы: I) cys мутанты, рост которых подавляется, 2) cys"" мутанты, рост которых не подавляется, 3) cys+ мутанты, рост которых подавляется и 4) cys+ мутанты, рост которых не подавляется метионином.
Для изучения отношения мутантов чумного микроба с пониженными потребностями в факторах роста к антибиотикам, нами были исследованы 61 штамм возбудителя чумы из различных очагов и 44 мутанта: из Урало-Эмбенского - 2 (2) - в скобках указывается число изученных мутантов, полученных из этих штаммов, - Зауральского - I (I), Тувинского - 2 (2), Забайкальского - 3 (2), Тяныпан-ского - 5 (4), Гиссарского - 5 (I), Предустюртского - 2 (2), Устюртского - I (2), Мангышлакского - 2 (2), Каракумского - 6 (3), Муюнкумского - 5 (3), Прибалхашского - 8 (2), Закавказского равнинно-предгорного - 3 (3), из зарубежных стран (Бразилия, Вьетнам, Заир, Китай, Мадагаскар, Турция) - 12 (12).
Мы изучали чувствительность к антибиотикам широкого спектра действия (тетрациклин, хлортетрациклин), группы стрептомицина (стрептомицин, пасомицин), неомицинового комплекса (неомицин, мономицин), антибиотикам, действующим на грамположительные бактерии (пенициллин, эритромицин) и полимиксину М.
В расплавленный агар Хоттингера (43) добавляли исследуемые антибиотики. Их конечная концентрация (кроме полимиксина и эритромицина) равнялась 10, 5, 2,5, 1,25, 0,6, 0,3 мкг/мл или вд/ мл. Концентрация полимиксина М и эритромицина (мкг/мл) составляла 100 - 200 - 400 - 800.
Посевы инкубировали при 28 и ежедневно на протяжении пяти суток визуально проводили учет роста штаммов. За минимальную подавляющую концентрацию (МПК) принимали такую концентрацию препарата, которая ингибировала рост испытуемого штамма на протяжении двух суток.
Чувствительность исходных культур и их мутантов к антибиотикам одинакова и соответствует чувствительности, ранее описанной И.Л.Мартиневским и А.Г.Стоговой (1969). Все они также высокочувствительны к стрептомицину, пасомицину, неомицину, мономицину, пенициллину, хлортетрациклину, тетрациклину, МПК которых составляет 1,25-2,5 мкг/мл.
Несколько иным, по нашим данным, является отношение штаммов и их мутантов к эритромицину и особенно к полимиксину М. МПК первого антибиотика составляла 25-100 мкг/мл, а второго зависела от происхождения штаммов и их мутантов.
Как правило, штаммы и их мутанты резистентны к полимиксину М и МПК составляет 200-500 мкг/мл. Однако штаммы чумного микроба из Гиссарского очага, выделенные от арчовых полевок в 1970-72 годы, некоторых зарубежных стран (Турция, Заир), изолированные от лвдей, не вырастали на средах с полимиксином М в концентрации 10-25 мкг/мл. Интересным являлось выделение единичных полимиксин-чувствительных ( plms) штаммов среди полимиксинрезистентных ( р1шг), циркулирующих в природных очагах чумы. Так, МПК штамма, выделенного в 1974 году от сайгака в урочище Жабелы Мангышлакско-го очага, составляла 10 мкг/мл. Подобные единичные штаммы обнаружены в Муюнкумском и Кызылкумском автономных очагах.
Следует отметить, что чувствительность мутантов к полимик-сину М соответствует чувствительности исходных штаммов.
Обнаруженные нами в Кызылкумах дикие штаммы возбудителя чумы с пониженными потребностями в факторах роста, как и типичные для этого очага штаммы, проявляли высокую резистентность к поли-миксину и эритромицину. При проверке 1680 штаммов чумного микроба, выделенных в 1978-81 годах в Кызылкумах, на чувствительность к полимиксину М и эритромицину установлено, что их ІЖЖ выше 100 и 50 мкг/мл соответственно. Нами (Мартиневский, Аракелян, 1981) предложено использовать эти препараты для улучшения бактериологической диагностики возбудителя чумы. Дело в том, что в противочумной практике при обследовании грызунов и их эктопаразитов на чуму обычно используется плотная среда Хоттингера с добавлением генцианвиолета в конечной концентрации 1:4-8 х I05 для подавления роста посторонних микроорганизмов. Однако, несмотря на это, посевы зачастую остаются загрязненными. Это, естественно, не только затрудняет выделение возбудителя чумы, но иногда и вообще (в случав антагонизма) не дает возможности получить его. В подобных случаях производят неоднократные пересевы, заражают биопробных животных, что увеличивает время выдачи ответа.
Предложенный нами способ был апробирован весной 1981 года-при обследовании полевого материала в Южных Кызылкумах во время течения там интенсивной и разлитой эпизоотии. На базе лаборатории Бухарского ПЧО исследовано 650 грызунов (в основном больших песчанок) и 26 тысяч эктопаразитов. Посевы проводили обычным методом на агар Хоттингера с полимиксином М (25 мкг/мл) и эритромицином (5 мкг/мл), а также на агар Хоттингера с генцианвиолетом. Посевы инкубировали при 28, Применение первой среды позволило выделить от грызунов 22 и от эктопаразитов - 194, а при контрольных посевах - 16 и 174 культур чумного микроба соответственно. При наличии обильного роста посторонней микрофлоры на среде Хоттингера с генцианвиолетом пересевали выросшую культуру на агар Хоттингера с полимиксином М и эритромицином. Уже через сутки был отмечен типичный рост колоний только возбудителя чумы. Таким образом, из загрязненных посевов органов грызунов нами выделено 5 и от эктопаразитов - 12 культур. Следует особо подчеркнуть, что этот метод оказался эффективным в исследовании павших грызунов и при наличии сопутствующей стафилококковой и стрептококковой микрофлоры. Однако из посевов, заросших протеем, получить чистые культуры чумного микроба данным способом не удалось.
