Содержание к диссертации
Стр.
Список сокращений 4
Введение 6
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
Глава I. СОВРЕМЕННОЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ О ПРЕДСТАВИТЕЛЯХ
КЛАССА MOLLICUTES. 12
1.1 .Характеристика семейства Mycoplasmataceae. 12
1.2.Биологические особенности микоплазм. 15
1.3 .Патогенные свойства микоплазм. 22
Глава П. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ЗАБОЛЕВАНИЙ, ВЫЗВАННЫХ
МИКОГОІАЗМАМИ. 30
2.1. Методы лабораторной диагностики микоплазменных инфекций. 30
2.2.Современное представление об иммуноферментном анализе. 35
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Глава III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ. 43
Глава IV. КОНСТРУИРОВАНИЕ МОДЕЛЬНЫХ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ
ВЫЯВЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ МИКОПЛАЗМЕННЫХ
АНТИГЕНОВ В ИММУНОФЕРМЕНТНОМ АНАЛИЗЕ. 62
4.1.Разработка модельной тест-системы для определения антигенов
M.pneumoniae. 62
4.2.Разработка модельной тест-системы для определения антигенов
M.hominis. 65
Глава V. АПРОБАЦИЯ РАЗРАБОТАННЫХ ИММУНОФЕРМЕНТНЫХ ТЕСТ-
СИСТЕМ НА КЛИНИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ 78
Определение чувствительности и специфичности разработанной тест-системы в сравнении с другими методами, используемыми для выявления антигенов M.pneumoniae. 78
Характеристика белкового профиля в ЭПАГ мембранных и растворимых антигенов M.pneumoniae (FH). 81
Иммуноблоттинг сывороток больных с респираторной микоплазменной инфекцией. 83
Иммуноблоттинг ЦИК, выделенных из проб сыворотки крови больных с респираторной инфекцией. 85
Определение чувствительности и специфичности разработанной тест-системы в сравнении с другими методами, используемыми для выявления антигенов M.hominis. 88
Характеристика белкового профиля в ЭПАГ мембранных белков и целых клеток M.hominis. 92 5.7.Иммуноблоттинг проб сыворотки крови больных урогенитальной
инфекцией. 93
5.8. Иммуноблоттинг ЦИК, выделенных из проб сыворотки крови больных
урогенитальными инфекциями. 96
ОБСУЖДЕНИЕ 99
ВЫВОДЫ 109
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
-4-СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АГ-антиген.
AT - антитела.
БСА - бычий сывороточный альбумин.
ГЛА - глутаровый альдегид.
ДЕАЕ - целлюлоза - диэтиламиноэтил-целлюлоза.
ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота.
ДСН - электрофорез - электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия.
ИФА - иммуноферментный анализ.
КББ - карбонат-бикарбонатный буферный раствор.
КГ - коньюгат
НГУ- негонококковый уретрит.
ОФД - ортофенилендиамин.
ОП - оптическая плотность.
ПЭГ - полиэтиленгликоль.
ПЦР - полимеразная цепная реакция.
РИФ - реакция иммунофлуоресценции.
РАГА - реакция агрегат-гемагглютинации.
РРО - раствор для разведения образцов.
РПГА - реакции пассивной гемагглютинации.
РИГА - реакция непрямой гемагглютинации.
РСК - реакция связывания комплемента.
-5-РИ - индикаторный раствор. РИР - реакция ингибиции роста. РИМ - реакция ингибиции метаболизма. РФ - ревматоидный фактор. РІЖ - рибонуклеиновая кислота. ИФА - иммуноферментный анализ. ТМБ - тетраметилбензидин. УГТ - урогенитальный тракт. ФР - физиологический раствор. ФСБ - фосфатно-солевой буферный раствор. ЦИК- циркулирующие иммунные комплексы. ЦФБ - цитратно-фосфатный буферный раствор. ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота. АТР - аденозинтрифосфат.
LAMPs - липид-ассоциированные мембранные белки. M.pneumoniae - Mycoplasma pneumoniae. M.hominis - Mycoplasma hominis. M.genitalium - Mycoplasma genitalium. NAD - никотинамидадениндинуклеотид. U. urealyticum - Ureaplasma Urealyticum.
Введение к работе
Актуальность работы:
В последнее время внимание многих исследователей направлено на изучение микоплазм, часто являющихся причиной развития патологических процессов в органах мочеполовой и респираторной системы. Основным возбудителем респираторного микоплазмоза является Mycoplasma pneumoniae. Среди всех респираторных инфекций доля респираторного микоплазмоза, вызванного M.pneumoniae, составляет 10-20%, пневмонии микоплазменной природы регистрируются в 10-16,3% случаев от общего числа пневмоний в различных возрастных группах (11,22,101). Ureaplasma urealyticuM, Mycoplasma hominis и Mycoplasma genitalium заселяют урогенитальный тракт и вызывают воспалительные, чаще всего хронические заболевания мочеполового тракта человека и могут служить причиной повторных спонтанных абортов, мужского и женского бесплодия (123,126). Распространенность M.hominis среди населения по данным разных авторов варьирует от 10 до 50%. Внутриутробные заболевания среди новорожденных, обусловленные M.hominis, составляют 34,4% среди всех внутриутробных инфекций (39; 23).
Микоплазмы являются мембранными паразитами, при этом тесное взаимодействие с мембраной клетки хозяина способствует обмену антигенными комплексами, что позволяет им "ускользать" от иммунологического надзора со стороны иммунной системы хозяина, а повторное инфицирование, или затяжное, хроническое течение болезни может способствовать возникновению аутоиммунного синдрома (101).
Факторы патогенности возбудителя генетически детерминированы. Их принято подразделять на 4 группы: (1) определяющие взаимодействие возбудителя с эпителием соответствующих экологических ниш и колонизацию зоны первичного инфицирования; (2) обеспечивающие устойчивость микробов к факторам защиты макроорганизма и способность к размножению in vivo; (3) индуцирующие синтез цитокинов и медиаторов воспаления, ассоциированных с
иммунопатологией; (4) токсины, и токсические продукты, вызывающие патологические изменения в органах и тканях макроорганизма (Бондаренко В.М., 1999). Патогенное действие микоплазм может проявляться как токсическими биомолекулами (токсины, ферменты, метаболиты), так и факторами патогенности, обеспечивающими адгезию, колонизацию и персистенцию возбудителя в организме хозяина. Микоплазменные инфекции не имеют патогномонических особенностей, что чрезвычайно затрудняет клиническую диагностику заболеваний и это обстоятельство выделяет раздел лабораторной диагностики в один из наиболее важных.
В настоящее время диагностика микоплазменных инфекций основывается на микробиологических, иммунологических, иммунохимических и генетических методах. Если раньше основной упор делали на микробиологические тесты, то внедрение новых лабораторных технологий, таких как иммуноферментный анализ (ИФА), реакция прямой и непрямой иммунофлуоресценции (РИФ), полимеразная цепная реакция (ПЦР) создали принципиально новую возможность для диагностики, инфекций, обусловленных микоплазмами (23, 52, 100). Сейчас перед специалистами стоят задачи по повышению надежности и репрезентативности методов диагностики, что во многом зависит от уровня информативности лабораторных методов исследования и расширения диагностических возможностей. Решение этих проблем позволит применить комплексный подход к лабораторной диагностике, контролю лечения, прогнозированию течения инфекций и внедрению масштабного тестирования отдельных групп населения на ряд инфекций микоплазменной природы.
Большой популярностью в лабораторной практике пользуется иммуноферментный анализ, в основе которого лежит образование комплекса "антиген-антитело" на твердой фазе полистироловых планшет и дальнейшая регистрация ферментной метки (13, 20). Основными преимуществами метода являются: высокая чувствительность и специфичность, возможность
одновременного исследования большого количества проб, объективная оценка результатов, простота постановки. ИФА является универсальным методом и позволяет выявлять в сыворотке крови и в других биосубстратах специфические антитела различных классов и субклассов (чаще всего определяют антитела классов IgM и IgG). В последние годы появились тест-системы, предназначенные для определения антигенов различных видов микроорганизмов. По чувствительности ИФА уступает лишь ПЦР, широкое использование которой ограничивает необходимость иметь специальное оборудование.
На сегодняшний день в России нет зарегистрированных диагностикумов на основе ИФА для выявления микоплазменных антигенов в клиническом материале. Для дифференциальной диагностики инфекций респираторного тракта фирма "SERION" (Германия) предлагает иммуноферментную тест-систему "ELISA antigen Quadrogen", построенную по принципу сэндвича, для выявления антигенов M.pneumoniae, вирусов гриппа А и В и респираторного синтициального вируса в клиническом материале. В 1991 г. Hirschberg L. et. al. применили в своих исследованиях систему "Semimonoclonal Double-Sandwich Test" (Швеция) для выявления антигенов М. pneumoniae с использованием моноклональных антител. Публикации о диагностике инфекций, обусловленных M.hominis, методом ИФА отсутствуют как в зарубежных, так и в отечественных литературных источниках.
Представленные данные свидетельствуют о необходимости разработки отечественных тест-систем на основе иммуноферментного анализа для выявления антигенов микоплазм у больных с респираторными и урогенитальными инфекциями с целью верификации этиологического диагноза.
Цель исследования: разработка иммуноферментных тест-систем для выявления антигенов микоплазм в клиническом материале от больных с респираторными и урогенитальными заболеваниями человека.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1) Получить высокоактивные иммунные сыворотки к
цитоплазматическим мембранам клеток М. pneumoniae и М. hominis.
2) Разработать иммуноферментные тест-системы для выявления
антигенов М. pneumoniae и М. hominis в ИФА и дать оценку их специфичности
и чувствительности.
Апробировать тест-системы на клиническом материале, полученном от больных с респираторными и урогенитальными микоплазменными инфекциями.
Определить условия выявления в ИФА антигенов М. pneumoniae и М. hominis в составе циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в пробах сыворотки крови.
Дать электрофоретическую характеристику антигенов М. pneumoniae и М. hominis с помощью «Вестерн-блот» анализа.
6) Провести иммуноблоттинг в пробах сыворотки крови для
подтверждения специфичности обнаружения в ИФА антигенов М. pneumoniae
и М. hominis в свободном состоянии и в составе ЦИК.
Научная новизна:
Получены высокоактивные гипериммунные сыворотки к М. pneumoniae и М. hominis путем иммунизации кроликов фракциями цитоплазматических мембран клеток микоплазм. Антитела, выделенные из иммунных сывороток, были использованы для создания диагностических тест-систем на основе ИФА для определения антигенов М. pneumoniae и М. hominis в свободном состоянии и в составе ЦИК в сыворотках крови больных с заболеваниями респираторного и урогенитального тракта.
Специфичность, чувствительность и диагностическая значимость разработанных вариантов ИФА была показана на примере анализа проб сыворотки крови больных с респираторными и урогенитальными
микоплазменными инфекциями и подтверждена результатами дополнительных исследований этих образцов на присутствие антигенов М. pneumoniae и М. hominis и антител к ним в ИФА, РАГА и иммуноблоттинге.
Научно-практическая значимость работы.
Разработаны варианты ИФА для обнаружения антигенов М. pneumoniae и М. hominis в клиническом материале, полученном от больных с респираторной и урогенитальной патологией, и показана их диагностическая значимость. Предложен метод выявления микоплазменных антигенов в составе циркулирующих иммунных комплексов, который дает возможность увеличить специфичность и чувствительность разработанных тест-систем и проследить длительность персистенции микоплазм в организме больного. С целью повышения эффективности диагностики микоплазменных инфекций рекомендуется применять ИФА в комплексе с РАГА, РИФ или ПЦР в практике клинических и экспериментальных лабораторий, занимающихся диагностикой микоплазменных инфекций.
Внедрение результатов работы.
Составлены Методические рекомендации «Изготовление и контроль тест-системы диагностической для определения антигенов Mycoplasma pneumoniae в иммуноферментном анализе» и «Изготовление и контроль тест-системы диагностической для определения антигенов Mycoplasma hominis в иммуноферментном анализе», предназначенные для микробиологов, иммунологов и других специалистов, занимающихся разработкой и производством диагностических препаратов. Методические рекомендации одобрены на Совете по внедрению научных достижений в практику в ГУ Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф.Гамалеи РАМН (протокол № 8 от 19 марта 2009 г.).
Положения, выносимые на защиту: - на основе ИФА разработаны высокочувствительные методы обнаружения антигенов M.pneumoniae и M.hominis в клиническом материале, полученном от
больных с респираторной и урогенитальной патологией. Исследование сывороток крови на присутствие микоплазменных антигенов в РАГА, иммуноблоте и антител к ним в ИФА подтвердило специфичность данных тест-систем.
способ определения антигенов M.pneumoniae и M.hominis в составе ЦИК увеличивает чувствительность ИФА, а совместная диагностика, как свободных, так и связанных в ЦИК антигенов позволяет установить длительность персистенции антигенов в макроорганизме.
протестированные в иммуноблоте антигены M.pneumoniae и M.hominis, обнаруженные в ИФА, имеют широкий протеиновый спектр (от 30 до 170 кДа и от 25 до 120 кДа соответственно) и содержат как специфические, так и патогенетически значимые антигены.
Апробация работы.
Апробация состоялась на совместной научной конференции отдела медицинской микробиологии и лаборатории микоплазм и L-форм бактерий ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН 18 февраля 2009 года.
Материалы диссертации были обсуждены и доложены на:
- X Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в Санкт-
Петербурге», 2006 год, Санкт-Петербург.
- Российской - научно-практической конференции «Инфекции,
вызываемые условно-патогенными микроорганизмами», 2007 год, Москва.
- Конференции «Современные технологии в диагностике инфекций,
вызываемых условно-патогенными микроорганизмами», 2009 год, Краснодар.
![Конструирование и внедрение в практику генодиагностической тест-системы для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы [Электронный ресурс]](/i/i/4289/212277.png "Конструирование и внедрение в практику генодиагностической тест-системы для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы [Электронный ресурс] Тучков Игорь Витальевич")
