Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 10
I. Механизмы регуляции экспрессии генов бацилл 10
1.1. Двухкомпонентные системы трансдукции сигнала 10
1.2. Системы глобальной регуляции 21
1.3. Сигма факторы транскрипции 29
1.4. Посттрансляционная регуляция 36
1.5. Регуляция путем внутриклеточного протеолиза факторов транскрипции 37
II. Субтилизиноподобные протеипазы 40
2.1. Семейство сериновых субтилизиноподобных протеиназ, структура и свойства 40
2.2. Характеристика субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius 44
Заключение 48
Экспериментальная часть 49
Материалы и методы исследования 49
Результаты исследования 61
1. Определение нуклеотидной последовательности гена субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius ее анализ 61
1.1. Картирование фрагмента хромосомы B.intermedius и определение последовательности гена субтилизиноподобной протеиназы 61
1.2.Поиск открытой рамки считывания и идентификация стартового кодона 61
І.З.Анализ открытой рамки считывания 68
1.4. Сравнительный анализ гена субтилизиноподобной протеиназы Bacillus intermedins с помощью пакета программ BLAST 71
І.З.Анализ регуляторной области гена aprBi 74
2. Регуляция экспрессии гена субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius 80
2.1.Экспрессия гена субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius в условиях солевого стресса 80
2.2.Экспрессия гена аргВі в штаммах B.subtilis, дефектных по регуляторной системе DegS-DegU 83
2.3.Влияние механизма азотной катаболитной репрессии на экспрессию гена аргВі 85
2.4. Экспрессия гена аргВі в штаммах B.subtilis, дефектных по белкам системы транспорта аммония NrgB и NrgA 87
Обсуждение результатов 91
1. Структура и анализ нуклеотидной последовательности гена субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius 91
2. Регуляция экспрессии гена аргВі в переходный период: влияние системы DegS-DegU и взаимосвязь с азотным обменом 100
Выводы 109
Литература
- Механизмы регуляции экспрессии генов бацилл
- Системы глобальной регуляции
- Характеристика субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius
- Картирование фрагмента хромосомы B.intermedius и определение последовательности гена субтилизиноподобной протеиназы
Введение к работе
Актуальность проблемы. Эффективность метаболизма бактериальной клетки определяется балансом процессов анаболизма и катаболизма. На их активацию и репрессию влияют факторы окружающей среды. У бактерий выработались механизмы, позволяющие координировать метаболизм в зависимости от доступности и разнообразия питательных веществ. Долгое время исследования ученых были посвящены выяснению роли индивидуальных сигнальных систем. Взаимодействие различных регуляторных путей, их значимость и приоритетность все чаще становится объектом внимания исследователей. Множественная регуляция экспрессии поздних катаболитных генов отражается на организации структуры их промоторов. Анализ взаимного расположения сайтов регуляции в промоторной области гена позволяет предсказать возможные механизмы активации его транскрипции. Несмотря на революционный прорыв современных методов биоинформатики и молекулярной биологии, идентификация последовательностей для взаимодействия с регуляторами транскрипции является сложной задачей. Даже в бактериальных клетках пока не установлены функции всех факторов транскрипции, обнаруженных при секвенировании геномов. Для многих из идентифицированных регуляторных белков остается невыясненной последовательность нуклеотидов в сайтах взаимодействия с ДНК (Joseph et al., 2005). Несмотря на это, методы биоинформатики позволяют прогнозировать результаты с достаточно высокой точностью (95-98%) (Mironov et al., 1999).
Бактерии Bacillus intermedins секретируют различные протеиназы, среди которых доминирует субтилизиноподобная сериновая протеиназа (AprBi), ее доля составляет до 80% от пула внеклеточных протеиназ, выделяемых этими бактериями в среду (Шарипова с соавт., 2000). Белок выделен из культуральной жидкости на разных фазах роста и изучены его основные физико-химические и каталитические свойства (Балабан с соавт., 1994, 2004). Ген протеиназы был клонирован в лаборатории проф.
СВ.Кострова (ИМГ РАН) на плазмиде pCS9, производной вектора рСВ22 (Sorokin et al., 1990). Экспрессия гена aprBi в штамме B.subtilis AJ73, дефицитном по собственным внеклеточным протеиназам, показала два максимума протеолитической активности: в ранней и поздней стационарной фазах роста (Кириллова с соавт., 2006). Поздняя и ранняя протеиназы различаются по некоторым физико-химическим характеристикам и условиям биосинтеза. Предполагается, что это связано со сложной системой регуляции экспрессии гена этого фермента на различных фазах роста бактерий. Для выяснения механизмов регуляции экспрессии гена aprBi на разных стадиях роста, включая период перехода в стационарную фазу роста, представляло интерес определить нуклеотидную последовательность гена фермента.
Целью работы явилось определение и анализ нуклеотидной последовательности гена субтилизиноподобной протеиназы В.intermedins, и исследование влияния двухкомпонентной системы DegS-DegU и азотной катаболитной репрессии на экспрессию гена.
В работе решались следующие задачи:
Определение и анализ нуклеотидной последовательности гена субтилизиноподобной протеиназы В.intermedins, определение сайта инициации трансляции в гене aprBi.
Исследование экспрессии гена субтилизиноподобной протеиназы В.intermedins в условиях солевого стресса.
Выяснение роли двухкомпонентной системы DegS-DegU в регуляции экспрессии гена aprBi.
Определение вклада азотной катаболитной репрессии в регуляцию экспрессии гена субтилизиноподобной протеиназы В.intermedins.
Исследование влияния белков NrgA и NrgB, участвующих в азотном обмене бацилл на экспрессию гена aprBi.
Научная новизна. Установлена последовательность нуклеотидов гена сериновой субтилизиноподобной протеиназы В.intermedins. Для анализа структуры гена применен подход, основанный на оценке его последовательности современными методами биоинформатики. Определены потенциальные сайты регуляции в промоторе гена и особенности их расположения. Установлено, что трансляция в гене aprBi начинается с нестандартного GTG кодона. Впервые установлено, что синтез протеиназы B.intermedius активируется в условиях солевого стресса в отличие от субтилизина B.subtilis. Получены приоритетные данные о регуляции экспрессии гена сериновой протеиназы B.intermedius со стороны двухкомпонентной системы трансдукции сигнала DegS-DegU. Впервые показано, что экспрессия гена aprBi регулируется механизмом азотной катаболитной репрессии. Установлено, что в ранней стационарной фазе роста экспрессия гена протеиназы зависит от белка NrgB, участвующего в азотном обмене бацилл.
Практическая значимость. Данные сиквенса гена субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius занесены в базу данных Международного ГенБанка (AN AY754946) и могут быть использованы для сравнительного анализа белков этой группы. Примененные в работе методы биоинформатики позволили провести анализ структуры промотора гена, что в целом расширяет представление о строении «поздних» генов, находящихся под множественной регуляцией. Полученные в работе данные о механизмах контроля синтеза внеклеточных ферментов бацилл могут быть использованы при конструировании систем экспрессии для получения высокоэффективных промышленных штаммов-продуцентов целевых белков.
Связь работы с научными программами. Работа проводилась в соответствии с планом НИР КГУ (№ гос. регистрации 01.2.00 104982 «Биосинтез, биогенез, классификация, физиологические функции новых микробных ферментов и возможные области их практического применения»). Исследования поддержаны грантами РФФИ 05-04-48182-а, Федерального агентства по образованию А04-2.12-783, Академии Наук республики Татарстан 03-3.10-295/2004(Ф), программой ДААД и Минобрнауки РФ «Михаил Ломоносов» А/04/39635 и А/05/58617.
Апробация работы Основные положения диссертации представлены на ежегодных научных конференциях молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра КГУ "Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2003, 2004), школах-конференциях молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2004, 2005, 2006), Всероссийской научной конференции "Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии" (Казань, 2004), Всероссийской научной конференции "Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение" (Казань, 2005), V республиканской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Наука. Инновации. Бизнес» (Казань, 2005), всероссийской молодежной конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии», (Москва, 2005), Международной конференции аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2006», (Москва, 2006).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 научных работ.
Благодарности. Автор выражает глубокую признательность научному руководителю профессору М.Р.Шариповой за внимательное отношение к работе; к.б.н. с.н.с. Н.П.Балабан за постоянную помощь в проведении экспериментов; профессору С.В.Кострову (ИМГ РАН) за предоставление плазмид pCS9 и рСВ22; профессору Ю.Йомантасу (ГНИЙ Генетика и Селекция Промышленных микроорганизмов) за предоставление протеазодефицитного штамма B.subtilis', к.б.н. с.н.с. И.В.Демидюку (ИМГ РАН) за консультацию при проведении экспериментов по мутагенезу точки инициации трансляции; профессору К.Форшхаммеру (Университет Гиссена, Германия) за научную консультацию в области регуляции азотного обмена бактерий; профессору Я. Маартен Ван Дижлу (университет Гронингена, Голландия) за предоставление для работы штаммов B.subtilis, мутантных по Deg-белкам; доктору биологических наук Й.Штульке (Университет Геттингена, Германия) за предоставленные штаммы B.subtilis, дефектные по белкам NrgA и NrgB.
Механизмы регуляции экспрессии генов бацилл
В случае, когда эффектор, вызывающий ту или иную клеточную реакцию, не проникает в цитоплазму, происходит передача сигнала через мембрану на цитоплазматический посредник, который в свою очередь взаимодействует с регуляторным аппаратом клетки. Такая передача сигнала осуществляется двухкомпонентными системами трансдукции синала. Количество двухкомпонентных систем в бактериальной клетке зависит от уровня сложности генома. Если в геноме Helicobacter pylori идентифицировано только 7 потенциальных систем, то у свободноживущих высокоорганизованных микроорганизмов Escherichia coli и Bacillus subtilis их количество достигает 30-36 (Msadek, 1999). Гомологи белков двухкомпонентных систем регуляции бактерий обнаружены также в эукариотических клетках. Бактериальные двухкомпонентные регуляторные системы сигнальной трансдукции состоят из гистидин-киназы и белка-регулятора ответа. Работа сенсорно-регуляторной системы включает в себя взаимодействие рецептора с агентом, вызывающим клеточный ответ, передачу сигнала от рецептора на киназный домен сенсора, в результате чего происходит аутофосфорилирование сенсора, и перенос фосфата на регулятор ответа (рис. 1) (Головлев, 1999; Fabret et al., 1999; Barrett et al., 2002).
Большинство сенсоров - мембранные белки, их N-концевые домены расположены в периплазматическом пространстве или обращены в среду и взаимодействуют с внеклеточными сигналами (Barrett et al., 2002). После восприятия сигнала N-концевым доменом сенсора происходит изменение конформации белка. Сигнал передается на С-концевой домен, имеющий цитоплазматическую локализацию. При этом изменяются его киназная и/или фосфатазная активность в отношении соответствующего белка-регулятора. Большинство регуляторов ответа являются факторами транскрипции; фосфорилирование повышает их способность связываться с промотором и, следовательно, активирует транскрипцию соответствующих генов. События, следующие за фосфорилированием регулятора, определяют специфичность клеточного ответа и уникальны в каждой сенсорно-регуляторной системе.
У B.subtilis двухкомпонентные системы перекрываются и формируют внутриклеточную сеть сигнальной трансдукции (Msadek, 1999). Это позволяет клеткам формировать ответ на внешние воздействия путем интеграции разнообразных сигналов на более высоком клеточном уровне.
Установлено, что в стационарной фазе роста происходит активация нескольких систем трансдукции сигнала, взаимодействующих между собой и контролирующих процессы синтеза ферментов деградации (DegS-DegU), приобретения состояния генетической компетентности (ComP-ComA) и споруляции (KinA/SpoOF/SpoOA) (рис. 2) (Msadek., 1999). Интерес в данной схеме представляет белок DegU, который играет роль молекулярного переключателя между процессами достижения компетентности и синтеза внеклеточных гидролаз (Dartois et al., 1998). Несмотря на то, что результаты анализа генома B.subtilis выявили 36 потенциальных двухкомпонентных систем трансдукции сигнала, изучены лишь немногие из них (Kobayashi et al., 2001; Oguraetal., 2001).
Можно выделить такие двухкомпонентные системы, как: DegS-DegU, осуществляющую регуляцию синтеза и секреции ферментов деградации (Msadek et al., 1990); ComP-ComA, ответственную за развитие состояния компетентности (Dubnau, 1991); CheA-CheY, ответственную за хемотаксис (Ordal et al., 1993); PhoP-PhoR, осуществляющую фосфатную регуляцию (Hullet et al, 1994); CitS-CitT, вовлеченную в транспорт Mg2+/4HTpaTa, LytS-LytT, участвующую в регуляции автолиза (Fabret et al., 1999); KinA/SpoOF/SpoOA, запускающую инициацию споруляции (Trach, Hoch, 1993). Иерархия сигнальных ответов обеспечивает выбор между экспрессией генов и устанавливает доминантный путь регуляции.
Система DegS-DegU. Двухкомпонентная система транедукции сигнала DegS-DegU регулирует экспрессию генов ферментов деградации, которые активно синтезируются бациллами в ранней стационарной фазе роста (рис. 2). Сюда относятся такие секретируемые ферменты, как левансахараза, амилаза, протеиназы, глюканаза и др (Kunst et al., 1988; Msadek et al., 1990). Контроль экспрессии генов этих белков осуществляется продуктами генов degS и degU, и, в меньшей степени, дополнительными регуляторными белками DegQ и DegR (Msadek et al., 1990; Qgura et al, 1994). При этом экспрессия гена degQ также регулируется системой DegS-DegU, она снижается в присутствии глюкозы и повышается при аминокислотном, азотном, фосфатном голодании и недостатке углерода (Msadek et al., 1991).
Белок DegS является гистидин киназой и, по-видимому, локализован в цитоплазме, поскольку не имеет гидрофобного участка для включения в мембрану. В то же время, природа воспринимаемого им сигнала неизвестна (Steil et al., 2003).
Системы глобальной регуляции
В естественной среде обитания бактерии часто оказываются в условиях, сильно различающихся по содержанию питательных веществ. В связи с этим у микроорганизмов в процессе эволюции сформировались регуляторные системы, которые контролируют одновременно экспрессию многих генов и оперонов. В клетках бацилл подобный контроль экспрессии осуществляют факторы транскрипции AbrB, СсрА, CodY, TnrA, GlnR и SinR.
ДНК-связывающий белок AbrB в клетках B.subtilis является глобальным регулятором группы генов, которые активно экспрессируются при переходе от вегетативного роста к ранней стационарной фазе (Strauch, 1993).
Структурный анализ показал, что белок AbrB в клетке функционирует в виде тетрамера из четырех одинаковых субъединиц, состоящих из 94 амикислотных остатков с молекулярной массой 10,5 кДа (Strauch et al., 1989; Vaughn et al., 2000). Эксперименты in vitro, а также данные анализа с помощью ядерного магнитного резонанса, позволили выявить последовательность с высоким сродством к белку АЬгВ (WAWWTTTWCAAAAAAW) (Xu et al., 1996). Тем не менее, такой сайт редко встречается в промоторах генов AbrB-регулона. Наряду с этим, существует гипотеза, свидетельствующая о том, что белок АЬгВ может взаимодействовать с различными последовательностями нуклеотидов в промоторах генов (Strauch et al., 1989). Предполагается, что этот фактор транскрипции распознает трехмерную структуру ДНК.
Экспериментально установлено, что белком АЬгВ регулируется около 30 различных оперонов (Strauch et al., 1995а). Эта цифра считается заниженной, поскольку анализ последовательности хромосомы B.subtilis выявил около 40 потенциальных участков взаимодействия с белком АЬгВ (Strauch et al., 1989, 1993). АЬгВ белок функционирует как репрессор и как активатор транскрипции. Так, активная форма этого фактора подавляет экспрессию ранних генов споруляции spoOE, spoOH, spoVG и гена внеклеточной сериновой протеиназы aprE (Ferrari et al., 1988; Perego et al., 1991), и повышает уровень экспрессии hpr и rbs оперонов (Strauch et al., 1993). Транскрипция собственного гена abrB контролируется по принципу обратной репрессии собственным продуктом и белком SpoOA (Strauch, 1993; Strauch et al., 1993).
Фактор CodY в клетках B.subtilis регулирует экспрессию около ста генов, которые вовлечены в ответ на голодание. К ним относятся гены ферментов деградации, транспортных систем, внутриклеточных катаболитных систем, подвижности, генетической компетентности и споруляции (Bergara et al., 2003; Debarbouille et al., 1999; Fisher et al., 1996; Inaoka et al., 2002, 2003; Kim et al., 2003; Mirel et al., 2000; Molle et al., 2003b; Serror et al., 1996). CodY является негативным регулятором транскрипции генов в клетках, растущих на богатой среде. Его активность снижается при переходе к стационарной фазе роста. Сегодня известно два типа низкомолекулярных регуляторов активности фактора CodY. ГТФ, а также аминокислоты валин и изолейцин, взаимодействуя с CodY, активируют его репрессорную функцию (Shivers et al., 2004; Ratnayake-Lecamwasam et al., 2001). Таким образом, экспрессия генов, регулируемых фактором CodY, подавлена, если внутриклеточный пул ГТФ, валина и изолейцина достаточно высок. Репрессия снимается, когда содержание этих метаболитов в клетке понижается ввиду нехватки питательных веществ в среде.
Среди известных факторов транскрипции у прокариот не обнаружено гомологов CodY. Неизвестен механизм распознавания и связывания CodY с промоторами генов. Гены, регулируемые фактором CodY, имеют АТ-богатые промоторы, но консенсусная последовательность, распознаваемая CodY, пока не описана (Joseph et al., 2005). Есть данные, что как минимум один CodY-зависимый промотор (dpp) имеет существенный изгиб ДНК (Strauch et al., 1995b). По-видимому, этот регуляторный белок распознает трехмерную структуру ДНК (Shivers et al., 2004). С другой стороны, в структуре CodY обнаружен потенциальный ДНК связывающий центр, образованный двумя обратными спиралями в районе С-конца (Dodd et al., 1990). Этот участок высоко консервативен (более 80% идентичности) среди CodY факторов различных бактерий (Joseph et al., 2005). Мутация в нем блокирует взаимодействие белка с промотором dpp (Shivers et al., 2004). Имеются данные, что CodY может образовывать ди- и тримеры, и, возможно, в олигомерной форме связывается с ДНК (Joseph et al., 2005).
Белок СсрА, плейотропный регулятор транскрипции, является ключевым фактором в регуляции углеродного катаболизма в B.subtilis и других грам-положительных микроорганизмах. В присутствии глюкозы, СсрА связывается с cre-последовательностью (catabolite-responsive element), локализованной в регуляторной области генов и оперонов, контролируемых механизмом катаболитной репрессии. Каноническая последовательность сге-сайта для взаимодействия с белком СсрА имеет вид TGWAARCGYTWNCW (Martin-Verstraete et al., 1995; Zalieckas et al., 1998).
Характеристика субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius
Бактерии Bacillus intermedins секретируют в среду различные гидролазы, такие как рибонуклеаза, фосфатаза, а также различные протеиназы. Из культуральной жидкости этого микроорганизма была выделена сериновая протеиназа, активно расщепляющая казеин, азоказеин и синтетический субстрат Z-Ala-Ala-Leu-pNa, специфичный для субтилизиноподобных протеиназ (Балабан с соавт., 1993, 1994). Фермент оказался стабильным в диапазоне рН 6,3-11, с оптимумом рН 11 при гидролизе казеина и проявлял максимум активности при 50С. Ингибитор сериновых протеиназ PMSF подавлял ферментативную активность на 97%, в то время как ЭДТА и о-фенантролин не оказывали существенного влияния (Балабан с соавт., 1993). Было установлено, что протеиназа предпочтительно расщепляет белки по гидрофобным аминокислотам, присутствие ионов Са стабилизирует молекулу фермента и повышает его активность (Ицкович с соавт., 1997).
Исследования биосинтеза фермента показали, что на долю субтилизиноподобной протеиназы приходится около 80% от общего пула протеиназ, секретируемых B.intermedius в постэкспоненциальную фазу роста. Белок появляется в среде в фазе замедления роста, когда удельная скорость роста культуры падает. Установлено влияние различных компонентов питательной среды на образование субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius. Так, биосинтез белка повышался в присутствии 0,5% казеина или желатина и 0,3 г/л неорганического фосфата в среде (Ицкович с соавт., 1995). Максимальный выход протеиназы наблюдался при использовании 1,8-1,9% кукурузного экстракта, в этих условиях продуктивность культуры в отношении протеиназы увеличивалась вдвое. Показано, что синтез фермента регулируется системой углеродной катаболитной репрессии. Биосинтез протеиназы подавлялся экзогенной глюкозой и смесью аминокислот. Исследования антикоагулянтной и тромболитической активности субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius показали перспективность ее применения в медицине (Ицкович с соавт., 1998).
Бактерии B.intermedius продолжают активно секретировать сериновую протеиназу в стационарной фазе роста. Исследования показали, что максимум накопления «позднего» фермента в культуралыюй жидкости наблюдается на 46-48 часы роста и соответствует стадии созревания эндоспор и их освобождения в среду (Шарипова с соавт., 2002). Показателем целостности клеток может служить фермент Р-галактозидаза, который имеет строго внутриклеточную локализацию и используется как биохимический маркер целостности цитоплазматической мембраны (Балабан с соавт., 2003). Исследования (3-галактозидазной активности в культуральной жидкости и клеточных лизатах позволили установить, что в поздней стационарной фазе субтилизиноподобная протеиназа секретируется бактериальными клетками, а не накапливается в среде в результате лизиса клеток.
Подобран состав питательной среды для максимальной продукции поздней субтилизиноподобной протеиназы (Балабан с соавт., 2004). Поздний фермент был выделен и очищен из культуральной жидкости на 48 ч культивирования В. intermedius. Определение N-концевых аминокислотных последовательностей раннего и позднего фермента показало их полную идентичность (AQTVPYGIPQIKAPA) (Балабан с соавт., 1994, 2004). В то же время, изучение каталитических и физико-химических свойств позднего фермента позволило выявить ряд отличий от протеиназы этого микроорганизма. Вторая протеиназа имела константу Михаэлиса равную 0,0054 мМ (для ранней протеиназы Кт=1,25 мМ), т.е. поздний фермент более эффективно связывает субстрат (Ицкович с соавт., 1997; Балабан с соавт., 2004). Максимум активности при гидролизе казеина наблюдался при рН 8,5, в отличие от раннего фермента. Оптимальная температура была выше на 5 и составила 55С. Фермент ингибировался PMSF и стабилизировался ионами Са2+ (Балабан с соавт., 2004). Интересно, что внесение неорганических (хлорида) органических (цитрата) солей аммония в количестве 3-5 мМ подавляло биосинтез ранней и поздней протеиназ (Балабан с соавт., 2003, 2004). Внесение активаторов синтеза раннего фермента - дрожжевого экстракта и желатина - не стимулировали синтез поздней протеиназы, а присутствие 0,1% казеина в среде приводило к повышению продуктивности культуры в 1,4 раза.
Картирование фрагмента хромосомы B.intermedius и определение последовательности гена субтилизиноподобной протеиназы
Было проведено картирование плазмиды pCS9 (рис. 7). Использовали набор из пяти рестриктаз и получили 10 вариантов рестрикции. Их анализ и сопоставление позволили построить рестрикционную карту фрагмента хромосомы B.intermedius. Мы показали, что ген протеиназы находится внутри 3,0-kb последовательности, фланкированной сайтами рестрикции Hindlll и EcoRV (рис. 7).
Для определения нуклеотидной последовательности была использована мультикопийная плазмида pCS9, производная вектора рСВ22 (Sorokin et al., 1990), содержащая клонированный фрагмент ДНК хромосомы B.intermedius с геном aprBi. Его последовательность была определена методом праймерной прогулки. Стартовый олигонуклеотид для секвенирования был комплементарен плазмиде pCS9 на расстоянии 60 пар оснований от начала вставки. Последовательность гена aprBi зарегистрирована в базе данных ГенБанка (AN AY754946).
После определения нуклеотидной последовательности гена проводили поиск открытой рамки считывания - нуклеотидной последовательности, которая начинается со стартового кодона и заканчивается стоп-кодоном.
В 6,06-kb вставке участка хромосомной ДНК B.intermedius 3-19 с помощью программы ORF Finder была идентифицированы три открытые рамки считывания (рис. 9). Первая рамка считывания кодирует белок, результаты сравнительного анализа которого позволяют предположить его участие в транспорте аминокислот в клетку и их метаболизме. Белок имеет низкую гомологию (46%) с продуктом гена yhfW из клеток B.subtilis. Вторая рамка сичтывания состоит их 1179 нуклеотидов, что соответствует 392 аминокислотным остаткам. Кодируемый ею полипептид имеет структурную гомологию (87%) с метил-связывающими белками Bacillus halodurans, Bacillus weihenstephanensis и Bacillus cereus, участвующими в хемотаксисе. Белок имеет 2 функциональных домена. Глобиновый домен воспринимает изменения внутриклеточной концентрации кислорода, монооксида углерода и оксида азота, и участвует в процессах аэротаксиса. Метил-связывающий домен, по всей видимости, метилируется в ответ на присутствие репеллентов и аттрактантов, и передает сигнал на регуляторный белок системы хемотаксиса CheA.
Третья открытая рамка считывания состоит из 1146 нуклеотидных остатков, и кодирует белок, имеющий структурную гомологию с сериновыми протеиназами. Программный анализ данной последовательности позволил выявить 3 потенциальных сайта инициации синтеза белка: TTG (1), GTG (2) и ATG (3) (рис. 9). Чтобы установить, с какого из этих сайтов происходит инициация трансляции, был использован алгоритм SignalP (Bendtsen et al., 2004), который основан на статистическом анализе последовательности, следуемой после предполагаемого инициирующего кодона. Такая последовательность должна с максимальной вероятностью соответствовать всем характеристикам сигнального пептида. Результаты анализа представлены в таблице 4.
Полученные значения вероятности свидетельствуют, что функционально активному сигнальному пептиду могут соответствовать последовательности, синтез которых начинается с TTG (1) или GTG (2) кодонов.
Чтобы выяснить, какой из этих кодонов является стартовым, были сконструированы мутантные гены субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius, в которых проведена замена нуклеотидов в одном или нескольких из предполагаемых сайтов инициации трансляции (рис. 9). В результате были получены плазмиды рКА, рКТ, pKG и pKTG, в которых имеются мутации в сайтах: A(C)TG(A), TT(C)G(C), GT(C)G(T), TT(C)G(C) и GT(C)G(T), соответственно.
Плазмиды рКА, рКТ, pKG, pKTG были трансформированы в лабораторный штамм AJ73, дефицитный по собственым внеклеточным протеиназам. В качестве контроля использовали штамм, в который трансформировали плазмиду pCS9 с исходным геном аргВі. Полученные рекомбинантные штаммы выращивали на среде LB. Протеолитическую активность по расщеплению хромогенного субстрата Z-Ala-Ala-pNa замеряли в течение 48 часов роста рекомбинантных штаммов.
Динамика накопления протеолитической активности штаммом B.subtilis AJ73 (рКА), несущим ген протеиназы с мутацией в сайте ATG, не отличалась от контрольного штамма B.subtilis AJ73 (pCS9) (рис. 10а). Эти данные позволили заключить, что кодон ATG, по-видимому, не является стартовым в гене аргВі. Одновременная мутация сайтов GTG и TTG привела
Рис. 10. Экспрессия генов субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius, несущих нуклеотидные замены в предполагаемых сайтах инициации трансляции, рекомбинантными штаммами B.subtilis. 1 -B.subtilis AJ73 (pCS9); 2 - B.subtilis AJ73 (рКА); 3 - B.subtilis AJ73 (pKTG); 4 -B.subtilis AJ73 (pKT); 5 - B.subtilis AJ73 (pKG).
