Введение к работе
Распространение ВИЧ-инфекции в мире носит характер пандемии В Российской Федерации и странах бывшего СССР в настоящее время наблюдаются одни из самых высоких в Восточной Европе темпы роста числа новых случаев ВИЧ-инфекции, что связано с началом крупномасштабной эпидемии в этом регионе только в середине 90-х годов (Российский комитет защиты мира, 2006). Общее число зарегистрированных случаев ВИЧ-инфекции в РФ на 31.08.07 г. составляет 390365 человек, из них 2642 ребенка. За 8 месяцев 2007 год выявлено 28974 новых случаев ВИЧ-инфекции, что на 12% больше, чем за аналогичный период 2006 года Большинство случаев ВИЧ-инфицирования связано с инъекционным употреблением наркотиков (70%), однако, отмечается четкая тенденция ежегодного увеличения числа случаев передачи вируса половым путем. В 2006 году он превысил 50% всех новых случаев заражения (Покровский В.В., Савченко И Г., Ладная Н.Н., 2006).
Необходимо отметить, что эпидемия ВИЧ-инфекции в России имеет неравномерный характер распространения. ВИЧ-инфицированные граждане зарегистрированы на всех 89 административных территориях страны, однако, согласно данным Российского Федерального научно-методического Центра по профилактике и борьбе со СПИД, около 60% от абсолютного числа всех зарегистрированных случаев ВИЧ-инфекции сконцентрированы в 10 субъектах РФ, где уровень инфицированности превышает 300 человек на 100 тыс жителей: Свердловская область, Московская область, г. Санкт-Петербург, Самарская область, г. Москва, Иркутская область, Челябинская область, Оренбургская область, Ханты-Мансийский АО, Ленинградская область Помимо территорий с высоким уровнем ВИЧ-инфекции в РФ отмечены регионы, где количество инфицированных менее 50 человек на 100 тыс населения, и таких регионов 38, в них проживает четвертая часть всего населения РФ (Липецкая, Курская, Воронежская, Астраханская обл. и др.) (данные приведены на 01 09 07 г.). Основная масса публикаций, касающаяся
изучения эпидпроцесса ВИЧ-инфекции и анализа распространенности субтипов ВИЧ-1 в регионах РФ, посвящена территориям с высоким и/или очень высоким уровнем превалентности этого заболевания (Покровский В.В. 1987, Козлов АЛ. 1990, Garaev М.М. 1993, Бобков А Ф. 1998, Набатов А.А 1999, Зверев С.Я, Машарский Э.В 2004), но, практически отсутствуют данные о районах с низким уровнем распространенности этого вируса.
В качестве такой модели был изучен регион, который в настоящее время по количеству ВИЧ-инфицированных находится на 84 месте из 89 субъектов Российской Федерации - Липецкая область, где уровень превалентности ВИЧ/СПИД составил 45 инфицированных на 100 тыс. жителей («СПИДометр» ЛОЦПБС и ИЗ от 01.09.07 г.).
Для характеристики вариантов вируса обычно используют подходы, основанные на методах молекулярно-биологического мониторинга вирусных популяций (Garaev, 1993) Изучение первичной структуры генома ВИЧ-1 позволяет установить направленность генетической изменчивости его гипервариабельных и консервативных областей и определить основные факторы, обуславливающие полиморфизм вирусных популяций. В качестве информационных областей при анализе нуклеотидной последовательности генома ВИЧ-1 особое внимание привлекает область env, основного белка оболочки gpl20, как представителя генетического разнообразия вариантов вируса, и область gag, кодирующая внутренние белки вируса, как один из консервативных участков вириона, который может быть использован для определения схожести и общности происхождения вирусов
Цели и задачи исследования.
Целью настоящей работы было изучение особенностей течения эпидемического процесса на территории с низким уровнем превалентности ВИЧ-1, а также, исследование молекулярно-генетических и молекулярно-эпидемиологических характеристик вариантов ВИЧ-1, получивших
распространение в Липецкой области Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
Провести анализ нуклеотидных последовательностей фрагмента гена gag (782-1318 но), гена env (6582-7782 но) и 5'-нетранслируемой области (662-788 но) генома вариантов ВИЧ-1, получивших распространение на территории с низким уровнем превалентности ВИЧ-инфекции (координаты указаны по иуклеотидной последовательности НХВ2 GeneBank Ас.№К03455)
Провести субтипирование полученных первичных последовательностей вариантов ВИЧ-1 от пациентов Липецкой области
На основании филогенетического анализа определить степень гомологии вариантов вируса в изучаемой популяции от пациентов с различным эпиданамнезом, а также сравнить уровень их генетической близости с известными штаммами ВИЧ-1 международной базы данных GeneBank
Изучить характер мутаций гипервариабельных участков исследуемых областей генома вариантов gagA/envA ВИЧ-1, получивших распространение на территории с низким уровнем превалентности ВИЧ-1 (Липецкой области)
Научная новизна работы.
1. Впервые показано, что эпидемия ВИЧ-инфекции на территориях с низким уровнем превалентности ВИЧ-1 это - вялотекущий эпидпроцесс среди местного населения в основном, связанный с половыми контактами, без широкого распространения среди наркоманов. Основной вклад в увеличение численности ВИЧ-инфицированных на таких территориях вносит, так называемый, «миграционный компонент», который формируется за счет временной миграции жителей данного региона на территории с взрывным характером распространения вируса, либо за счет иммиграции населения с территорий с высоким уровнем ВИЧ-инфекции (иммигранты, сезонные рабочие и т д.).
2. Получены молекулярно-эпидемиологические данные о вариантах вируса иммунодефицита человека 1-го типа, получивших распространение на территории Липецкой области в период с 1994 по 2006 годы. На территории области обнаружены 4 варианта ВИЧ-1 с генотипами gagA/envA (82%), gagB/envB (11%), gagC/envC (3,5%) и рекомбинант gagA/envB (3,5%). Установлена генетическая близость вариантов gagA/envA, циркулирующих на территории Липецкого региона, с изолятами, выделенными на территории Ближнего зарубежья (Украины, Молдовы) Данные филогенетического анализа образцов свидетельствуют о заносе вируса gagA/envA на территорию региона из очага ВИЧ-инфекции в Украине, который был осуществлен за счет «миграционного компонента» (сезонные рабочие, переселенцы) из этой страны.
При анализе генетического полиморфизма области env генома ВИЧ-1, было установлено, что кроме мутаций в виде трансзиций и трансверсий присутствуют дупликации 15-30 нуклеотидов в Р1-Р2 и Р4 областях В 28 исследованных образцах число дупликаций и количество повторяющихся нуклеотидов было различным.
При изучении S'-HeTpaHarapyeMoft области геномной РНК ВИЧ-1 в вариантах вируса субтипа А, выделенных от пациентов Липецкой области, было установлено, что область, охватывающая шпильки DIS, SD и Ч*, отличается высоким уровнем консервативности и встречающиеся в них замены не приводят к значительным изменениям их вторичной структуры
Основные положения, выносимые на защиту.
1 Изучен эпидпроцесс ВИЧ-инфекции на территории Липецкой области с низким уровнем превалентности этой инфекции. Полученные данные показывают, что динамика выявляемое ВИЧ-инфицированных в Липецкой области отражает общероссийскую ситуацию развития ВИЧ-инфекции, но эпидемический процесс имеет ряд особенностей Установлено, что основной вклад в число выявленных ВИЧ-инфицированных вносят лица, так называемый
«миграционный компонент» (сезонные работы, переселенцы из стран ближнего зарубежья, заключенные УИН) для которых основной путь инфицирования -потребление внутривенных наркотиков Среди местных жителей распространение ВИЧ инфекции идет преимущественно за счет полового пути передачи. Таким образом, эпидемия ВИЧ-инфекции на территории РФ носит неоднородный характер, на территориях с высоким уровнем превалентности ВИЧ - в виде вспышек при попадании вируса в популяцию наркоманов, а в регионах с низким уровнем распространенности - вялотекущий эпидпроцесс среди местного населения в основном, связанный с половыми контактами, без широкого распространения среди наркоманов
На основании молекулярно-эпидемиологических данных, установлено, что на территории области обнаружены 4 варианта ВИЧ-1 с генотипами gagA/envA, gagB/envB, gagC/envC и рекомбинант gagA/envB., Преобладающим является субтип gagA/envA , который был выявлен в 82% случаев от числа обследованных лиц.
Изучение первичной структуры нуклеотидной последовательности области гена env, кодирующего gpl20, вариантов ВИЧ-1 субтипа А у пациентов Липецкого региона, показало, что ранние этапы ВИЧ-инфекции характеризуются низким уровнем полиморфизма этого участка генома вируса
4 Шпилечные структуры 5'-концевой области геномной РНК ВИЧ-1 в вариантах субтипа А вируса, выделенных от пациентов Липецкой области, отличаются высоким уровнем консервативности их нуклеотидного состава и вторичных форм
5. Полиморфизм участка гена gag, кодирующего матриксный белок р17, вариантов субтипа А ВИЧ-1 у пациентов Липецкого региона в группе ПИН достоверно превышает этот показатель среди пациентов с половой трансмиссией вируса, и составляет соответственно 1,9% и 1,2% при (р<0,05) Апробация работы.
Основные материалы диссертационной работы опубликованы в 2 статьях, 2 тезисах
Объем я структура диссертации.
Материалы диссертации изложены на 123 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, содержит 9 таблиц и 25 рисунка В международной базе данных GeneBank зарегистрированы 47 нуклеотидных последовательностей области гена gag, кодирующей матриксный белок р17 и N-концевую часть бежа р24 (Ас№ EF 119574-199588, EF 121245-121272, EF 139232-129236), и 32 последовательности области генома env, кодирующей поверхностный гликопротеин gpl20 (Ac №.EF 121273-121304), вариантов ВИЧ-1 выделенных от пациентов Липецкого региона.
По результатам работы опубликовано 4 печатные работы
В работе были использованы образцы крови от 60 ВИЧ-инфицированных пациентов, собранных на территории Липецкой области за период с 1994-2006 г.г. У пациентов выясняли вероятные факторы риска заражения, предполагаемый путь инфицирования, место и время инфицирования
Специфические фрагменты ДНК, соответствующие области env, основного белка оболочки gpl20, области gag, кодирующая р17, и 5'-нетранслируемой области геномной РНК ВИЧ-1, амплифицировали с помощью двух пар праймеров в варианте "nested" ПЦР (таб.1).
Определение уровня изменчивости аминокислотной последовательности gpl20 рассчитывали с помощью программы ACCORD За величину вариабельности принимали коэффициент К, который вычисляли по формуле:
К= л/ (Х1(А-Ху#АГ+(Х|,с -Х^сГ+СХі.с-Х^оГ+^т-Ху.тГ
где Х1га, Х,_с, Х,,о, Х,д - нормированные координаты по осям А, С, G или Т в і-той позиции алаймента, соответственно,Ху,А, Xv_c, XViq, XV>T - нормированная координата максимальной вариабельности по осям А, С, G или Т в і-той
позиции алаймента, соответственно. Коэффициент К выражается в условных
единицах
Определение нуклеотидных последовательностей осуществляли на
автоматическом секвенаторе (ABI PRISM 3100, USA). Для компьютерной
обработки нуклеотидных последовательностей использовали пакет программ
DNAstar v 3.12 (Lasergene, USA).
Таблица 1. Праймеры, использованные для амплификации мишеневых
фрагментов ДНК.
