Введение к работе
Актуальность проблемы. Энтеровирусы человека принадлежат к роду Enterovirus семейства Picomaviridae, порядок Picomavirales. В настоящее время известно более 100 различных генотипов энтеровирусов. В соответствии с современной классификацией, которая базируется на молекулярно-генетических характеристиках геномов вирусов, выделяют 4 вида энтеровирусов человека (А, В, С, D) (King, 2011).
Одними из наиболее изученных представителей рода Enterovirus являются полиовирусы, которые относятся к виду энтеровирусов человека С. Вирусы полиомиелита (I, II и III типов) в течение долгого времени являлись причиной высокой заболеваемости людей, приводящей к инвалидизации части заболевших и даже к смерти. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) в одном из 200 случаев инфицирования развивается необратимый паралич (обычно ног), 5-10% из числа таких парализованных людей умирают из-за наступающего паралича дыхательных мышц (). В результате проведенных научных исследований вирусов полиомиелита и разработки вакцин в борьбе с данной инфекцией достигнут значительный успех, ведущий к возможному искоренению этой инфекции. Так, по данным ВОЗ за период с 1988 по 2011 гг. число случаев заболевания полиомиелитом уменьшилось более чем на 99% -с 350000 случаев до 1349. В первой половине 2011 года лишь четыре страны -Афганистан, Индия, Нигерия и Пакистан - оставались эндемичными по полиомиелиту, в то время как в 1988 году число таких стран превышало 125 ().
Таким образом, всемирная программа ликвидации полиомиелита постепенно реализуется и в недалеком будущем может быть успешно завершена.
Однако в последние годы значительно возросла роль неполиомиелитных энтеровирусов в возникновении инфекционных заболеваний, что подтверждается результатами научных исследований. Например, вирус Коксаки А7 был первым из числа неполиомиелитных энтеровирусов, который уже в 50-е годы стал известен как возбудитель полномиелитоподобного паралитического заболевания. В 1952-1968 гг. вирус Коксаки А7 вызвал вспышки полиомиелитоподобной инфекции среди детского населения в Казахстане, Шотландии, Швеции, Швейцарии. В 80-х годах выявили новое заболевание глаз, которое вызвали вирулентные варианты вирусов ECHO 19 и ЕСНОП, в результате оно получило название «острый энтеровирусный увеит». В России в 1980-1989 гг. зарегистрировано пять вспышек энтеровирусной инфекции, осложненной увеитом, в трех крупных городах Сибири (Красноярск и край 1980-1981; 1982, 1986; Омск 1987-1988; Иркутск 1988-1989).
Современные научные исследования показали возможную роль энтеровирусов в возникновении заболеваний, которые, как считалось ранее, не имели отношения к вирусам. Например, острые и хронические миокардиты могут быть вызваны вирусами Коксаки В. При первично диагностированном инсулинзависимом сахарном диабете у пациентов в три раза чаще обнаруживают антитела IgM к вирусам Коксаки А9, В1, В2, ВЗ и В5, чем у контрольных лиц; кроме того, у таких больных, нередко выявляют энтеровирусы молекулярными методами.
В настоящее время наиболее важным широко наблюдаемым проявлением энтеровирусной инфекции является серозный менингит. Первый подъем заболеваемости серозным менингитом энтеровирусной этиологии был зарегистрирован в мире в конце 40-х годов XX века. После периода относительного
благополучия, на фоне снижения и отсутствия эпидемического полиомиелита, с начала 70-х годов во всем мире начался второй эпидемический подъем заболеваемости энтеровирусным серозным менингитом.
В Новосибирске и Новосибирской области за период с 1993 по 2004 гг. зафиксировано три значительных вспышки серозного менингита энтеровирусной этиологии, в которые были вовлечены 365 человек ().
Анализ архивных материалов санитарно-эпидемиологической службы показал, что энтеровирусные заболевания начали эпизодически регистрироваться в России в составе острых кишечных инфекций неясной этиологии только с 1960-х годов. При этом не было надежных и дешевых средств диагностики, и поэтому сведения об их встречаемости в России носили отрывочный характер. Элементы эпидемиологического надзора за энтеровирусными (неполно) инфекциями на территории Российской Федерации введены лишь с 2006 г., и поэтому исследования, посвященные выявлению эпидемиологического значения неполиомиелитных энтеровирусов, немногочисленны.
Таким образом, роль неполиомиелитных энтеровирусов в возникновении инфекционных заболеваний велика, что требует углубления научных исследований и совершенствования практической медицины в этой области.
В настоящее время самыми информативными являются молекулярно-эпидемиологические исследования энтеровирусных инфекций, поскольку их результаты позволят уточнить источники и пути передачи этих патогенов, предсказать возможные вспышки этих инфекций, а также наметить наиболее важные пути разработки вакцин против этих патогенов.
Цели исследования: изучение генетического разнообразия энтеровирусов человека в Западной Сибири и на Дальнем Востоке, а также молекулярно-генетический анализ геномов штаммов энтеровирусов Коксаки А7 и Коксаки В6 с потенциальными онколитическими свойствами.
Задачи исследования:
-
Сбор и создание коллекции образцов ликвора и фекалий от пациентов с подозрением на энтеровирусную инфекцию для вирусологического и молекулярно-биологического исследования.
-
Исследование указанных образцов на наличие РНК энтеровирусов.
-
Изучение возможности культивирования изолятов энтеровирусов на культурах клеток.
-
Генотипирование изолятов энтеровирусов человека, встречающихся в Западной Сибири и на Дальнем Востоке.
-
Выявление возможных связей между генотипами изолятов энтеровирусов человека и клиническими синдромами, которые они вызывают.
-
Определение и молекулярно-генетический анализ полных нуклеотидных последовательностей геномов потенциальных онколитических штаммов энтеровирусов Коксаки А7 и Коксаки В6.
-
Исследование инфекционных (цитолитических) свойств штаммов потенциально онколитических энтеровирусов Коксаки А7 и Коксаки В6.
Научно-практическая значимость. Впервые проведено исследование заболеваемости энтеровирусными инфекциями, в том числе одной из наиболее социально значимых ее форм - серозным менингитом - в Новосибирске и
Новосибирской области, а также исследование вспышки желудочно-кишечной инфекции в 2010 году в Сахалинской области.
Впервые установлены генотипы энтеровирусов, циркулирующих на территории Новосибирска, Новосибирской области и Сахалинской области.
Собрана коллекция биопроб от больных с энтеровируснои инфекцией, а также от больных с серозными менингитами различной этиологии: энтеровируснои, герпесвирусной и др.
Впервые проведен молекулярно-генетический анализ и исследование инфекционных (цитолитических) свойств геномов штаммов потенциально онколитических энтеровирусов Коксаки А7 и Коксаки В6.
Результаты проведенных исследований показывают несомненную необходимость молекулярно-эпидемиологического контроля над энтеровируснои инфекцией, в частности за серозным менингитом энтеровируснои этиологии и кишечными инфекциями.
Использованные в работе методики могут быть применены в практической медицине, в работе эпидемиологических служб при диагностике энтеровирусных инфекций.
Положения, выносимые на защиту:
-
Основным типом энтеровирусов, циркулирующих на территории Новосибирска и Новосибирской области и определяющим заболеваемость серозными менингитами в 2008 г., был ЕСНО30 (72%).
-
Случай энтеровируснои экзантемы полости рта и конечностей в г. Новосибирске, вызван вирусом Coxsackie А6.
-
Во время вспышки острой кишечной инфекции в августе 2010 г. в Сахалинской области основными возбудителями были энтеровирусы СохА2 (45%) и СохА4 (34%)). Выделенные в Сахалинской обл. изоляты имеют наиболее высокую гомологию по нуклеотидной последовательности с энтеровирусами, выявленными в Восточной Азии: Японии (Р-2346/CBl/Kanagawa/2003 (АВ162750), 1095-LPS1 (АВ550333)), Китае (SSM-CVB3 (GUI 09481)), Корее (2000/CSF/KOR (AY875692)) в 2000-2010 гг.
Вклад автора:
Сбор клинических образцов, анализ историй болезни пациентов с подозрением на энтеровирусную инфекцию на базе ГИКБ №1 г. Новосибирска, создание коллекции образцов РНК энтеровирусов, выделенных из различных биологических проб, собранных в Новосибирской и Сахалинской областях, тестирование олигонуклеотидных праймеров для генодиагностики и генотипирования РНК энтеровирусов выполнено лично автором. Выявление РНК энтеровирусов в поступивших образцах и определение нуклеотидньгх последовательностей выявленных вариантов, филогенетический анализ фрагментов геномов энтеровирусов, выявленных в Новосибирской и Сахалинской областях выполнено лично автором при участии В.А.Тернового. Определение полных нуклеотидньгх последовательностей и молекулярно-генетический анализ геномов штаммов LEV8 и LEVI5 - совместно с В.А.Терновым, В.А.Святченко и А.Ю.Тикуновым.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 177 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», главы «Результаты и обсуждение», выводов, списка литературы и приложения. Библиография включает 222 работы: 32 - отечественных авторов, 174 —
зарубежных и 16 ссылок на электронный ресурс. Работа иллюстрирована 27 рисунками, 3 фотографиями и включает 19 таблиц.
Апробация результатов диссертации и публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК для кандидатских диссертаций; а также подана заявка на патент РФ №2011125215, дата приоритета 17.06.2011 г. (решение о выдаче патента от 05.03.2012 г.).
Полученные результаты исследований были доложены на Российских и Международных конференциях: на XV Научно-практической конференции врачей (г. Новосибирск, 2005); на XI Международном Симпозиуме по респираторным вирусным инфекциям (г. Бангкок, Таиланд, 2009); на I Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (г. Москва, 2009); на 20-ом Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (г. Вена, Австрия, 2010); на VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика-2010» (г. Москва, 2010); на 21-ом Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (г. Милан, Италия, 2011); на 2-ой Международной конференции «Астана Биотех 2011» (г.Астана, Казахстан, 2011); на IV Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (г. Москва, 2012); на 22-ом Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (г. Лондон, Великобритания, 2012); на заседаниях Новосибирского областного общества эпидемиологов и инфекционистов в 2004-2011 гг.
