Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1. Генетическое разнообразие природных штаммов возбудителя холеры Эль Тор с атипичной структурой генов, связанных с вирулентностью и эпидемическим потенциалом. 14
1.2. Происхождение природных высокопатогенных геновариантов возбудителя холеры Эль Тор. 25
ГЛАВА 2. Материалы и методы 30
2.1. Бактериальные штаммы, используемые в работе. 30
2.2. Питательные среды и реактивы. 32
2.3. Микробиологические методы: 32
2.3.1. Культивирование штаммов. 32
2.3.2. Определение продукции термолабильного гемолизина на плотной среде. 32
2.3.3. Определение подвижности, продукции растворимой гемагглютинин/ протеазы и фосфолипазы . 32
2.3.4. Конъюгационные скрещивания донорных и реципиентных штаммов. 33
2.3.5. Определение вирулентности штаммов V. cholerae. 33
2.4. Биохимические методы: 34
2.4.1. Оценка продукции холерного токсина иммуноферментным методом GM1ELISA. 34
2.4.2. Двумерный электрофорез, изофокусирование, трипсинолиз белков, масс-спектрометрия и идентификация белков. 34
2.5. Молекулярно-генетические методы: 35
2.5.1. Выделение ДНК, ДНК гибридизация по Саузерну с молекулярным СТ-зондом. 35
2.5.2. Полимеразная цепная реакция с использованием специфичных олигонуклеотидных праймеров. з
2.5.3. Определение нуклеотидной последовательности различных генов. 39
ГЛАВА 3. Выявление и молекулярно-генетический анализ природных геновариантов vibrio cholerae биовара эльтор с измененной структурой генов пандемичности и патогенности, выделенных на территории российской федерации 40
3.1. Сравнительный анализ генетической организации острова пандемичности VSP-II у типичных и генетически измененных штаммов
возбудителя текущей пандемии холеры, изолированных на территории РФ. 41
3.2. Изучение структуры острова патогенности VPI-1 у геновариантов с делецией ряда генов острова пандемичности VSP-II . 46
ГЛАВА 4. Конструирование диагностической пцр тест системы для дифференциации геновариантов с различным эпидемическим потенциалом на основе различий в структуре их острова пандемичности VSP-II 55
4.1. Выбор генов-мишеней и расчет праймеров. 55
4.2. Подбор оптимальных условий проведения мультиплексной полимеразной цепной реакции. 58
4.3. Разработка набора реагентов для проведения мультилокусной ПЦР с электрофоретическим учетом результатов для определения эпидемического потенциала генетически измененных штаммов на основе структуры VSP-II . 59
4.4. Изучение специфичности и эффективности разработанной мультиплексной ПЦР тест-системы. 64
4.5. Лабораторные испытания разработанной мультилокусной ПЦР тест системы. 68
ГЛАВА 5. Алгоритм расширенной идентификации генетически измененных штаммов vibrio cholerae биовара эль ТОР 73
5.1. Разработка алгоритма расширенной идентификации генетически измененных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор. 75
5.2. Оценка эффективности разработанного алгоритма расширенной идентификации генетически измененных штаммов V. cholerae биовара Эль
Тор. 80
ГЛАВА 6. Экспериментальное моделирование образования геновариантов в процессе конъюгации и изучение их фенотипических и молекулярно-генетических свойств 90
6.1. Экспериментальное получение геновариантов возбудителя холеры Эль Тор, несущих ген ctxB1 холерных классических вибрионов. 91
6.2. Сравнительный анализ вирулентных свойств реципиентного штамма V. cholerae М818 биовара Эль Тор и рекомбинантов с повышенной экспрессией ключевых и дополнительных факторов вирулентности. 98
6.3. Молекулярно-генетический анализ экспериментально полученных геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор с повышенной продукцией СТ. 99
6.4. Сравнительный протеомный анализ реципиентного штамма V. cholerae М818 и экспериментально полученного геноварианта с гиперпродукцией СТ. 102
Заключение 109
Выводы 115
Список использованных источников 11
- Происхождение природных высокопатогенных геновариантов возбудителя холеры Эль Тор.
- Определение подвижности, продукции растворимой гемагглютинин/ протеазы и фосфолипазы
- Изучение структуры острова патогенности VPI-1 у геновариантов с делецией ряда генов острова пандемичности VSP-II
- Разработка набора реагентов для проведения мультилокусной ПЦР с электрофоретическим учетом результатов для определения эпидемического потенциала генетически измененных штаммов на основе структуры VSP-II
Введение к работе
Актуальность проблемы. Эпидемии и вспышки холеры продолжают регистрироваться во многих странах Юго-Восточной Азии, Центральной Африки и Южной Америки. По данным Всемирной организации здравоохранения холерой ежегодно заболевает 3-5 млн. человек, из которых около 100-120 тыс. умирают (Информационный бюллетень ВОЗ, N107, 2014). Широкое распространение возбудителя холеры и активная миграция населения определяют реальную возможность ее завоза на территорию Российской Федерации (РФ). Недавние эпидемические вспышки и спорадические случаи холеры в РФ свидетельствуют о том, что эпидемиологическая обстановка по этой инфекции в стране остается напряженной (Онищенко Г.Г. и др., 1995, 2001; Москвитина Э.А. и др., 2008, 2006; Назаретян А.А., Москвитина Э.А., 2013). Для возбудителя холеры характерно внутривидовое разнообразие. Семь известных пандемий холеры были вызваны вирулентными штаммами Vibrio cholerae О1 серогруппы, относящимися к двум разным биоварам – классическому и Эль Тор, которые отличаются друг от друга по фено- и генотипическим свойствам (Бароян О.В., 1971; Kaper J.B. et al., 1995; Longini I.M.Jr. et al., 2002; Bhattacharya T. et al., 2006). Основные генетические различия между ними состоят в разной структуре острова патогенности (ОП) VPI-1 и генома профага CTX, детерминирующих, соответственно, продукцию токсин-корегулируемых пилей адгезии (TCP, от toxin-coregulated pilus) и холерного токсина (СТ, от cholera toxin) – ключевых факторов патогенности. Различия в структуре профага CTX выражаются в разной нуклеотидной последовательности двух фаговых генов – rstR и ctxB, последний из которых определяет продукцию В-субъединицы СТ. Вследствие этого различают СТ 1-го или классического типа и СТ 2-го или Эль Тор типа, присущего V. cholerae биовара Эль Тор (Waldor M.K. et al., 1996, 1997). Кроме того, в хромосоме вибрионов Эль Тор присутствуют два дополнительных мобильных элемента – острова пандемичности VSP-I и VSP-II, отсутствующие у холерных вибрионов классического биовара (Dziejman M. et al., 2002; O’Shea Y.A. et al., 2004; Pradhan S. et al., 2010).
Токсигенные штаммы V. cholerae биовара Эль Тор, вытеснив V. cholerae классического биовара на эндемичных по холере территориях, стали возбудителем 7-ой пандемии холеры, начавшейся в 1961 г. и продолжающейся до сих пор (Бароян О.В., 1971; Waldor M.K.et. al., 1996). Штаммы, вызвавшие текущую пандемию, несли геном профага СТХEltor и продуцировали СТ второго типа. Однако, в 1991 г. появились новые патогенные варианты этого биовара, несущие, в отличие от типичных, профаг CTX классического типа (Nair G.B. et. al., 2002; Safa A. et. al., 2010). К настоящему времени эти генетически измененные штаммы или геноварианты возбудителя холеры Эль Тор, вытеснив типичные штаммы в эндемичных по холере регионах, стали причиной многочисленных эпидемий холеры на территории многих стран Юго-Восточной Азии, Африки и Южной Америки. Что касается РФ, то совсем недавно стало известно о заносе штаммов геновариантов и на ее территорию. Оказалось, что с начала 90-х эпидемические вспышки и локальные случаи холеры в России были вызваны именно геновариантами, несущими ген ctxB1 классического типа (Смирнова Н.И. и др., 2008; Монахова Е.В. и др., 2005, 2009; Миронова Л.В. и др., 2012, 2014; Савельев В.Н. и др., 2012). Кроме того, один штамм геноварианта был выделен из морской воды Таганрогского залива в 2011 г. (Мазрухо А.Б. и др., 2013).
Возникшие геноварианты отличаются от типичных штаммов повышенной вирулентностью и высоким эпидемическим потенциалом, что связано с измененной структурой их генома. Особую эпидемическую опасность представляют недавно выявленные геноварианты, имеющие остров пандемичности VSP-II с протяженной делецией, поскольку такие штаммы вытесняют ранее появившиеся геноварианты с интактным геномом этого мобильного элемента. Между тем, несмотря на повышенный интерес многих исследователей к возбудителю холеры с новыми генетическими свойствами, многие вопросы, касающиеся структуры и функции его генома, остаются до сих пор малоизученными. Так, недостаточно сведений об особенностях структуры генома их острова патогенности VPI-1, в состав которого входят ключевые гены вирулентности. Нет данных о распространенности измененного острова пандемичности VSP-II среди штаммов геновариантов, выделенных в России. Отсутствуют генодиагностические тест-системы для дифференциации геновариантов с разным эпидемическим потенциалом. Открытым остается вопрос о роли нового профага CTXClass в повышенной вирулентности геновариантов, а также в их высоком эпидемическом потенциале. В этой связи очевидна актуальность исследований, направленных на выяснение особенностей молекулярно-генетической организации геновариантов, изолированных в разные периоды текущей пандемии холеры на территории России, а также на изучение возможности их образования при экспериментальном моделировании этого процесса. Полученные результаты необходимы для оценки биологического разнообразия геновариантов, а также для понимания динамики изменения их свойств, и выяснения механизмов их образования. Кроме того, полученные данные могут служить основой для поиска новых ДНК-мишеней при разработке новых тест-систем, повышающих качество генодиагностики возбудителя холеры.
Цель работы – выявление и молекулярно-генетический анализ штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор с измененной структурой генов пандемичности и вирулентности, выделенных на территории Российской Федерации; экспериментальное моделирование возникновения геновариантов в процессе конъюгации.
Задачи исследования:
1. Провести молекулярно-генетический анализ острова пандемичности VSP-II у геновариантов, выделенных в разные периоды текущей пандемии холеры в РФ, и изучить распространенность штаммов с измененной структурой этого мобильного элемента.
2. Изучить структуру острова патогенности VPI-1 у геновариантов с измененным островом пандемичности VSP-II.
3. Разработать способ дифференциации генетически измененных штаммов с разным эпидемическим потенциалом на основе оценки структуры их острова пандемичности VSP-II методом мультилокусной ПЦР.
4. Разработать алгоритм расширенной идентификации генетически измененных штаммов Vibrio cholerae биовара Эль Тор.
5. Провести экспериментальное моделирование образования геновариантов в процессе конъюгации; изучить их фенотипические и молекулярно-биологические свойства.
Научная новизна работы. Впервые на основе изучения структуры острова пандемичности VSP-II определена распространенность геновариантов с высоким эпидемическим потенциалом среди штаммов возбудителя холеры Эль Тор, выделенных на территории РФ. Получены новые данные об изменении структуры острова патогенности VPI-1 геновариантов, изолированных в последние два десятилетия текущей пандемии холеры. Установлено, что появление мутаций (однонуклеотидные замены и вставка) в кодирующем и регулирующем регионах гена tcpA из VPI-1, как правило, сопровождается возникновением делеции в острове пандемичности VSP-II.
Предложен способ дифференциации геновариантов с разным эпидемическим потенциалом на основе выявления различий в структуре их острова пандемичности VSP-II методом мультилокусной ПЦР. Подана заявка №2014100736 на изобретение; приоритет от 09.01.2014 г.
Впервые с помощью генетического моделирования получены экспериментальные доказательства возникновения геновариантов при переносе участка ДНК с геном ctxB1 V. cholerae классического биовара в клетки типичного штамма V. cholerae биовара Эль Тор в процессе конъюгации. Высокий уровень вирулентности экспериментально полученных геновариантов обусловлен повышенной продукцией ими холерного токсина, а также измененной экспрессией ряда дополнительных факторов патогенности (подвижности, продукции растворимой гемагглютинин/протеазы и фосфолипазы). Впервые проведен сравнительный протеомный анализ сконструированных изогенных штаммов, различающихся между собой типом профага СТХ. Получены новые сведения о том, что внедрение в хромосому типичного штамма V. cholerae биовара Эль Тор генома профага СТХClass классического типа приводит к изменению экспрессии ряда генов жизнеобеспечения.
Практическая значимость работы. На основе изучения структуры острова пандемичности VSP-II у различных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор, выделенных на территории России, разработана мультилокусная ПЦР тест-система для дифференциации геновариантов с разным эпидемическим потенциалом.
По результатам изучения фенотипических и молекулярно-биологических свойств геновариантов возбудителя холеры Эль Тор составлены методические рекомендации “Алгоритм идентификации штаммов геновариантов возбудителя холеры Эль Тор”, одобренные Ученым Советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 5 от 09.10.2012 г.) и утвержденные директором института 10 октября 2012 г.
В Государственной коллекции патогенных бактерий при РосНИПЧИ «Микроб» депонированы четыре штамма геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор (М-1264 ctxB1 rstREltor trp4 tcpAEltor VSP-II; P-17647 ctxB1 rstREltor trp3 tcpAEltor VSP-II4; Л-4150 ctxB7 rstREltor rstRClass trp5 tcpETCIRS VSP-II21; 301 ctxB1 rstREltor trp4 tcpETCIRS VSP-II21) с разной структурой острова пандемичности VSP-II. Депонированные штаммы могут быть использованы в качестве контрольных при определении типа VSP-II у исследуемых природных штаммов.
Полученные в ходе выполнения данные о молекулярно-биологических особенностях геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор используются при паспортизации штаммов, хранящихся в ГКПБ при РосНИПЧИ «Микроб», а также при чтении лекций «Микробиология и генетика возбудителя холеры» на курсах первичной специализации по особо опасным инфекциям по специальности «бактериология» при РосНИПЧИ «Микроб».
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Различные штаммы геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор, выделенные на территории РФ в разные периоды текущей пандемии холеры, содержат в геноме три разных типа острова пандемичности VSP-II: интактный, имеющий короткую делецию и содержащий протяженную делецию. Присутствие в геноме всех штаммов геновариантов, занесенных на территорию РФ в последнее десятилетие, VSP-II с протяженной делецией подтверждает их высокий эпидемический потенциал.
2. Все изученные штаммы геновариантов, несущие остров пандемичности VSP-II с делецией ряда генов, имели различные мутации (однонуклеотидные замены, инсерция) в гене tcpA, кодирующим основной белок токсин-корегулируемых пилей и локализованом на острове патогенности VPI-1.
3. Сконструирована мультилокусная ПЦР тест-система для дифференциации штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор с разным эпидемическим потенциалом на основе определения структуры их острова пандемичности VSP-II. Разработан алгоритм расширенной идентификации штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор, основанный на комплексной оценке их фенотипических и молекулярно-генетических свойств.
4. В модельном эксперименте показана возможность конъюгационного переноса гена ctxB1 классического типа в клетки типичного штамма V. cholerae биовара Эль Тор. Включение в геном типичного штамма V. cholerae биовара Эль Тор гена ctxB1 холерных классических вибрионов приводит к формированию клонов с повышенной продукцией холерного токсина и измененным уровнем экспрессии других генов, связанных с вирулентностью и/или жизнеобеспечением.
Апробация работы. Материалы диссертации представлены на заседании проблемной комиссии «Холера и патогенные для человека вибрионы» (Ростов-на-Дону, 2012-2013 гг.), Международной конференции «Молекулярная эпидемиология актуальных инфекций» (Санкт-Петербург, 2013 г.), на 8-й Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика 2014» (Москва, 2014 г.), на научно-практических конференциях РосНИПЧИ «Микроб» «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб» (Саратов 2013-2014 гг.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, их них 6 статей в изданиях, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы, включающего 181 цитируемую работу, из них 42 отечественных и 139 зарубежных. Общий объем диссертации составляет 136 страниц. Текст иллюстрирован 16 таблицами и 26 рисунками.
Происхождение природных высокопатогенных геновариантов возбудителя холеры Эль Тор.
Токсигенные штаммы V. cholerae биовара Эль Тор, вытеснив V. cholerae классического биовара на эндемичных по холере территориях, стали возбудителем 7-ой пандемии холеры, начавшейся в 1961 г. и продолжающейся до сих пор (Бароян О.В., 1971; Waldor M.K.et. al., 1996). Штаммы, вызвавшие текущую пандемию несли геном профага СТХEltor и продуцировали СТ второго типа. Однако, в 1991 г. появились новые патогенные варианты этого биовара, несущие, в отличие от типичных, профаг CTX классического типа (Nair G.B. et. al., 2002; Safa A. et. al., 2010). К настоящему времени эти генетически измененные штаммы или геноварианты возбудителя холеры Эль Тор, вытеснив типичные штаммы в эндемичных по холере регионах, стали причиной многочисленных эпидемий холеры на территории многих стран Юго-Восточной Азии, Африки и Южной Америки. Что касается РФ, то совсем недавно стало известно о заносе штаммов геновариантов и на ее территорию. Оказалось, что с начала 90-х эпидемические вспышки и локальные случаи холеры в России были вызваны именно геновариантами, несущими ген ctxB1 классического типа (Смирнова Н.И. и др., 2008; Монахова Е.В. и др., 2005, 2009; Миронова Л.В. и др., 2012, 2014; Савельев В.Н. и др., 2012). Кроме того, один штамм геноварианта был выделен из морской воды Таганрогского залива в 2011 г. (Мазрухо А.Б. и др., 2013).
Возникшие геноварианты отличаются от типичных штаммов повышенной вирулентностью и высоким эпидемическим потенциалом, что связано с измененной структурой их генома. Особую эпидемическую опасность представляют недавно выявленные геноварианты, имеющие остров пандемичности VSP-II с протяженной делецией, поскольку такие штаммы вытесняют ранее появившиеся геноварианты с интактным геномом этого мобильного элемента. Между тем, несмотря на повышенный интерес исследователей к возбудителю холеры с новыми генетическими свойствами, многие вопросы, касающиеся структуры и функции его генома, остаются до сих пор малоизученными. Так, недостаточно сведений об особенностях структуры генома их острова патогенности VPI-1, в состав которого входят ключевые гены вирулентности. Нет данных о распространенности измененного острова пандемичности VSP-II среди штаммов геновариантов, выделенных в России. Отсутствуют генодиагностические тест-системы для дифференциации геновариантов с разным эпидемическим потенциалом. Открытым остается вопрос о роли нового профага CTXClass в повышенной вирулентности геновариантов, а также в их высоком эпидемическом потенциале. В этой связи очевидна актуальность исследований, направленных на выяснение особенностей молекулярно-генетической организации геновариантов, изолированных в разные периоды текущей пандемии холеры на территории России, а также на изучение возможности их образования при экспериментальном моделировании этого процесса. Полученные результаты необходимы для оценки биологического разнообразия геновариантов, а также для понимания динамики изменения их свойств и выяснения механизмов их образования. Кроме того, полученные данные могут служить основой для поиска новых ДНК-мишеней при разработки новых тест-систем, повышающих качество генодиагностики возбудителя холеры.
Цель работы – выявление и молекулярно-генетический анализ штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор с измененной структурой генов пандемичности и вирулентности, выделенных на территории Российской Федерации; экспериментальное моделирование возникновения геновариантов в процессе конъюгации. . Провести молекулярно-генетический анализ острова пандемичности VSP II у геновариантов, выделенных в разные периоды текущей пандемии холеры в РФ, и изучить распространенность штаммов с измененной структурой этого мобильного элемента. 2. Изучить структуру острова патогенности VPI-1 у геновариантов с измененным островом пандемичности VSP-II. 3. Разработать способ дифференциации генетически измененных штаммов с разным эпидемическим потенциалом на основе оценки структуры их острова пандемичности VSP-II методом мультилокусной ПЦР. 4. Разработать алгоритм расширенной идентификации генетически измененных штаммов Vibrio cholerae биовара Эль Тор. 5. Провести экспериментальное моделирование образования геновариантов в процессе конъюгации и изучить их фенотипические и молекулярно-биологические свойства. НАУЧНАЯ НОВИЗНА: Впервые на основе изучения структуры острова пандемичности VSP-II определена распространенность геновариантов с высоким эпидемическим потенциалом среди штаммов возбудителя холеры Эль Тор, выделенных на территории РФ. Получены новые данные об изменении структуры острова патогенности VPI-1 геновариантов, изолированных в последние два десятилетия текущей пандемии холеры. Установлено, что появление мутаций (однонуклеотидные замены и вставка) в кодирующем и регулирующем регионах гена tcpA из VPI-1, как правило, сопровождается возникновением делеции в острове пандемичности VSP-II.
Предложен способ дифференциации геновариантов с разным эпидемическим потенциалом на основе выявления различий в структуре их острова пандемичности VSP-II методом мультилокусной ПЦР. Подана заявка №2014100736 на изобретение; приоритет от 09.01.2014 г. Впервые с помощью генетического моделирования получены экспериментальные доказательства возникновения геновариантов при переносе участка ДНК с геном ctxB1 V. cholerae классического биовара в клетки типичного штамма V. cholerae биовара Эль Тор в процессе конъюгации. Высокий уровень вирулентности экспериментально полученных геновариантов обусловлен повышенной продукцией ими холерного токсина, а также измененной экспрессией ряда дополнительных факторов патогенности (подвижности, продукции растворимой гемагглютинин/протеазы и фосфолипазы). Впервые проведен сравнительный протеомный анализ сконструированных изогенных штаммов, различающихся между собой типом профага СТХ. Получены новые сведения о том, что внедрение в хромосому типичного штамма V. cholerae биовара Эль Тор генома профага СТХClass классического типа приводит к изменению экспрессии ряда генов жизнеобеспечения.
Определение подвижности, продукции растворимой гемагглютинин/ протеазы и фосфолипазы
Для выяснения этого вопроса прежде всего необходимо определить, что является источником генов rstRClass и ctxB1, входящих в состав классического профага СТХClass атипичных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор. После смены возбудителя в 1961 г. в результате постепенного вытеснения V. cholerae классического биовара вирулентными штаммами V. cholerae биовара Эль Тор, оба клона совместно сосуществовали на протяжении более 30 лет в Бангладеш – эндемичном по холере районе (Longini I.M. et al., 2002). После 1992 г. возбудитель азиатской холеры перестал выделяться на эндемичных территориях и стал считаться элиминированным (Смирнова Н.И. и др., 2010; Chun J. et al., 2009; Longini I.M. et al., 2002; Safa A. et al., 2010). Однако, принимая во внимание тот факт, что в 1990-1991 гг. были обнаружены первые атипичные штаммы биовара Эль Тор, содержащие ген ctxB1, то вполне вероятно, что вибрионы Эль Тор приобрели гены CТ 1-го типа от классических холерных вибрионов, находящихся на грани исчезновения, в результате горизонтального переноса генов вирулентности (Safa A. et al., 2006). Кроме того, существует мнение, что некоторые штаммы классического биовара все еще присутствуют в окружающей среде на территории Бангладеш, и они могли бы быть донорами генов rstRClass и ctxB1. Обнаружить эти штаммы не удается, возможно, по причине их низкой численности или нахождении в некультивируемой форме (Safa A. et al., 2010). Совсем недавно были опубликованы данные об обнаружении штамма V. cholerae классического биовара среди клинических изолятов, выделенных во время эпидемии в Иране (Bakhshi B. et al., 2014). Этот факт также свидетельствует в пользу того, что возможным источником генов rstRClass и ctxB1 были штаммы холерного вибриона классического биовара.
Существует другое предположение, согласно которому донором генов rstRClass и ctxB1 могли быть штаммы V. cholerae О141-серогруппы, обитающие в окружающей среде и содержащие геном классического профага СТХClass. Эти штаммы рассматриваются в настоящее время как альтернативный природный резервуар генов классического CТ (Смирнова Н.И. и др., 2010; Udden S.M.N. et al., 2008).
Известно, что классические холерные вибрионы, а также токсигенные штаммы V. cholerae О141-серогруппы из-за присутствия в геноме профага СТХ гена-репрессора rstR, не способны формировать зрелые фаговые частицы. Это делает маловероятным приобретение вибрионами Эль Тор профага СТХClass в результате фаговой конверсии. В настоящее время более вероятным механизмом получения генов классического биовара вибрионами Эль Тор считается процесс трансформации. Известно, что холерные вибрионы находятся в окружающей среде в составе биопленки, образуемой на хитиновых субстратах (Meibom K.L. et al., 2005). В присутствии хитина индуцируется естественная восприимчивость холерных вибрионов к трансформации (Udden S.M.N. e t a l., 2 0 0 8 ; Rawlings T.K. e t a l., 2 0 0 7 ) . Была продемонстрирована возможность конвертирования О1 серогруппы в О139 или О37 посредством хитин-индуцированной трансформации (Blokesch M. et al., 2008). Более того, экспериментально показана возможность передачи профага СТХClass от природного штамма V. cholerae О141 серогруппы в штамм биовара Эль Тор путем хитин-индуцированной трансформации (Udden S.M.N. et al., 2008).
Механизм происхождения генетических вариантов возбудителя холеры Эль Тор от вирулентного штамма V. cholerae биовар Эль Тор был предложен недавно S. Faruque с соавт. на примере мозамбикских вариантов, выделенных в 2004 году во время вспышки, и определялся как многоступенчатый процесс (Faruque S.M. et al., 2007). Вначале произошла делеция на большой хромосоме участка ДНК с профагом CTXEltor и сайтом его внедрения dif-1 (Ильина Т.С. и др., 2003; Das B. et al., 2010). Образовавшийся нетоксигенный штамм мог приобрести профаг CTXClass, в результате горизонтального переноса генов, при этом профаг мог встроиться только в сайт dif-2, оставшийся на малой хромосоме. Затем произошла дупликация классического профага CTX при попадании клеток этого штамма в организм хозяина, что привело к появлению двух его копий на малой хромосоме (Faruque S.M. et al., 2007). В результате возник новый вариант V. cholerae биовара Эль Тор – продуцент CТ классического типа. При этом генотип мозамбикского варианта на 99% соответствует генотипам типичных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор, что подтверждает его происхождение в результате рекомбинационных событий и последующего приобретения нового генетического материала.
Кроме приведенной выше гипотезы существуют и иные варианты происхождения атипичных штаммов. В 1992 г., на 12 лет раньше мозамбикских вариантов, в Индии появились атипичные штаммы V. cholerae биовара Эль Тор (Halder K. et al., 2010). Как и мозамбикские, индийские варианты несли на малой хромосоме две тандемные копии классического профага CTXClass (Halder K. et al., 2010). Отличительной же особенностью этих штаммов было наличие на большой хромосоме 2 тандемных копий дефектного профага CTX, встроенных в сайте dif-1 большой хромосомы и лишенных генов ctxAB и обозначенных как pre-CTX (RS1+, pre-CTX+) (Das B. et al., 2010) . Существование таких вариантов свидетельствует об ином механизме образования атипичных штаммов. Путем горизонтального переноса генов образовался предшественник мозамбикских вариантов, несущий несколько тандемно расположенных копий классического профага CTX на обеих хромосомах. Далее, вероятно, произошла делеция генов ctxAB в геноме фагов CTX, внедренных в большую хромосому. Таким образом, появились штаммы с генотипом RS1+pre-CTX+. Дальнейшая утрата профагов pre-CTX из этого штамма привела к возникновению RS1+-варианта, который является, видимо, непосредственным предшественником мозамбикских вариантов, образованных в результате делеции RS1-элемента (Смирнова Н.И. и др., 2010).
По еще одной гипотезе, предложенной Safa A. с соавт. (2010), атипичные варианты возбудителя холеры Эль Тор произошли от предковой нетоксигенной формы, широко распространившейся в окружающей среде, в результате приобретения профага CTXClass через горизонтальный перенос.
Изучение структуры острова патогенности VPI-1 у геновариантов с делецией ряда генов острова пандемичности VSP-II
Для оценки эффективности ПЦР тест-системы использовали две группы пандемических штаммов V. cholerae биовара Эль Тор: 16 типичных, выделенных от больных на территории РФ во время эпидосложнений по холере в 1970–1990 гг., и 31 генетически измененный штамм, каждый из кторых содержал в геноме профаг CTX с геном ctxB классического типа и были также изолированы в РФ, но в более поздний период пандемии – с 1993 по 2011 гг. (табл. 9).
При определении структуры их острова пандемичности с помощью разработанной тест-системы было установлено, что у всех типичных штаммов имеется интактный VSP-II. Об этом свидетельствует образование в ПЦР трех ампликонов размером 761 п.н., 604 п.н. и 320 п.н. (табл. 9, рис. 7, дорожка 1, 2), как и у референс-штамма М818. В то же время измененные штаммы образуют три группы. В первую входят изоляты, содержащие в геноме прототипный VSP-II. Профиль их ампликонов такой же, как и у референс штамма М818 (табл. 9, рис. 7, дорожки 3–7). Из этого следует, что данные генетически измененные штаммы, изолированные в 1993–2001 гг., относятся к геновариантам возбудителя холеры с низким эпидемическим потенциалом. Вторая группа представлена двумя изолятами, Р17645, Р17647, выделенными в тот же временной период (1997 г.), что и штаммы первой группы, но несущим VSP-II с небольшой делецией, как и референс штамм Р17644 (табл. 9, рис. 7, дорожки 13, 14). Этот штамм следует отнести также к геновариантам с низким эпидемическим потенциалом, VSP-II которых находится на начальном этапе его реорганизации. Третья группа состоит из штаммов, VSP-II которых имеет протяженную делецию, поскольку для них характерно образование в ПЦР только одного фрагмента размером 604 п.н., соответствующего гену vc0514, общему для всех вариантов VSP-II (табл. 9, рис. 7, дорожки 8–12). Эти штаммы, изолированные в последние годы (2004–2012 гг.), являются новыми геновариантами, которые заменили генетически измененные изоляты с интактным VSP-II во многих регионах мира, эндемичных по холере. Представленные результаты, полученные с помощью разработанной на основе мультилокусной ПЦР тест-системы, полностью совпадают с данными монолокусного ПЦР анализа с использованием указанных выше (гл. 3, раздел 3.1.) 12 пар праймеров, а также в ряде случаев подтверждены секвенированием (Черкасов А.В. и др., 2014).
Таким образом, доказано, что разработанная нами мультилокусная ПЦР тест-система для дифференциации геновариантов возбудителя холеры Эль Тор с различным эпидемическим потенциалом специфична и эффективна.
4.5. Лабораторные испытания разработанной мультилокусной ПЦР тест-системы .
Цель этого раздела работы – проведение лабораторных испытаний разработанной мультилокусной тест-системы для определения ее диагностической ценности. Для решения поставленной задачи были использованы штаммы, служащие в качестве отрицательного или положительного контролей, а также исследуемые штаммы V. cholerae биовара Эль Тор, являющиеся генетически измененными вариантами, выделенными на территории РФ в разные временные периоды (табл. 10).
Отрицательная контрольная группа состояла из 6 различных штаммов, являющихся возбудителями кишечных инфекций, у которых VSP-II отсутствует.
В положительную контрольную группу входили указанные выше 3 штамма V. cholerae биовара Эль Тор, содержащие разные типы VSP-II (интактный, утративший четыре гена и имеющий протяженную делецию, захватывающую 7 генов).
Процедура проведенных испытаний включала в себя следующие этапы: а) выделение ДНК из контрольных и изучаемых штаммов; б) амплификацию тестируемых фрагментов генов, входящих в состав VSP-II; в) детекцию продуктов амплификации.
Подготовка проб бактериальных суспензий и их последующее
обеззараживание выполняли в соответствии с требованиями СП 13.1285-03, выделение ДНК проводили в соответствии с инструкцией к указанному набору. Проведение мультиплексной ПЦР и детекция результатов амплификации описана выше (п. 4.3.).
При исследовании 6 образцов ДНК, полученных из гетерологичных и близкородственных штаммов, не содержащих VSP-II и входящих в отрицательную контрольную группу, были получены отрицательные результаты (табл. 10). Таким образом, специфичность тест-системы составляет 100%.
Возможность использования мультилокусной ПЦР тест-системы для дифференциации штаммов возбудителя холеры по эпидемическому потенциалу была продемонстрирована на 21 генетически измененном штамме V. cholerae биовара Эль Тор. В результате комиссионного учета полученных данных было установлено, что среди исследуемых 12 штаммов относились к вариантам с низким эпидемическим потенциалом, поскольку содержали интактный VSP-II или VSP-II с короткой делецией (табл. 10). Профиль их ампликонов был идентичен таковому контрольных штаммов М818 или Р17644 (рис. 9, дорожки 7-18, рис. 10, дорожки 1,2,10-13). В то же время было обнаружено 7 штаммов, имеющих высокий эпидемический потенциал, поскольку в их геноме присутствовал VSP-II, имеющий протяженную делецию. Такой вывод был сделан на основе образования в ПЦР только одного фрагмента размером 604 п.н., соответствующего общему для всех типов VSP-II гену vc0514, при отсутствии амплификации фрагментов двух других генов (vc0502 и vc0497), имеющихся лишь в геновариантах с низким эпидемическим потенциалом (рис. 10, дорожки 3-9).
Таким образом, проведенные лабораторные испытания сконструированной нами мультилокусной ПЦР тест-системы и результаты комиссионного учета полученных данных подтвердили ее специфичность и эффективность. Показанная возможность быстрого обнаружения недавно сформированных высокопатогенных вариантов возбудителя холеры с высоким эпидемическим потенциалом, стремительное распространение которых во многих странах мира стало реальным фактом, позволяет рекомендовать эту ПЦР тест-систему для использования в качестве дополнительного метода при проведении эпидемиологических расследований.
Глобальное распространение в мире генетически измененных штаммов или геновариантов Vibrio cholerae биовара Эль Тор О1-серогруппы, серовара Огава или Инаба с повышенной вирулентностью и разным эпидемическим потенциалом, а также высокой изменчивостью структуры из генома указывает на необходимость разработки алгоритма расширенной идентификации генетически измененных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор. Как показано выше, геноварианты возбудителя холеры генетически неоднородны. До недавнего времени их разнообразие связывали главным образом с вариациями в нуклеотидной последовательности двух фаговых генов ctxB и rstR (Смирнова Н.И. и др., 2011; Nair G.B. et al., 2002; Morita M. et al., 2008; Safa A. et al., 2010). Подавляющее большинство изолированных вариантов имеют в гене ctxB две нуклеотидные замены в положениях 115 (T/C) и 203 (T/C), характерные для холерных классических вибрионов. Между тем в последние годы появились штаммы, в нуклеотидной последовательности гена которых, помимо двух указанных выше замен, присутствует новая мутация, а именно в положении 58 цитозин заменен на аденин (C/A). Новый аллель был обозначен как ctxB7 (Kumar P. et al., 2009). Однако позже, за счет высокой скорости микроэволюционных изменений появились новые геноварианты, отличающиеся от известных протяженной делецией в VSP-II и имеющие высокий эпидемический потенциал (Tawiani E. et al., 2010). Более того, согласно нашим и литературным данным (Grim C.J. et al., 2010), у новых геновариантов обнаружена вариабельность гена tcpA, кодирующего основную субъединицу токсин-корегулируемых пилей и локализованного на острове патогенности VPI-I. Новые аллели гена tcpA (tcpA3, tcpA4), обнаружены у всех геновариантов, изолированных в странах Южной Азии (Шри-Ланка, Пакистан, Индия, Непал, Афганистан), Африки (Камерун, Нигерия, Южная Африка) и Америки (Гаити) в последнее десятилетие (Talkington D. et al., 2011).
Все типы геновариантов вызывают более тяжелое клиническое течение инфекции по сравнению с типичными изолятами, что связано с повышенной продукцией ими холерного токсина классического типа (Choi S.Y. et al., 2010). Кроме того, не исключено, что изменения аминокислотных последовательностей B-субъединицы СТ, а также основной белок ТСР (вследствие замен в нуклеотидных последовательностях генов ctxB и tcpA), непосредственно взаимодействующих с определенными рецепторами чувствительных эукариотических клеток, также могут влиять на вирулентность холерных вибрионов. Следовательно, выявление полиморфизма генов, обусловленного нуклеотидными заменами и приводящего к изменению структуры функционально значимых факторов патогенности, может иметь прогностическое значение, позволяющее определять риск развития тяжелого течения инфекции. Более того, выявленные ранее неизвестные аллели гена tcpA, характернаые для новых геновариантов, могут быть использованы в качестве дополнительных генетических маркеров таких штаммов.
Появление и широкое распространение разных высокопатогенных вариантов возбудителя в эндемичных по холере регионах мира определяет реальную возможность их заноса на территорию России. Об этом свидетельствуют полученные нами экспериментальные данные о заносе на территории РФ в течение двух последних десятилетий штаммов геновариантов, отличающихся друг от друга по структуре и функции генов вирулентности и пандемичности. Такая ситуация требует совершенствования молекулярно-генетического мониторинга возбудителя холеры, поскольку новые биологические свойства циркулирующих штаммов могут влиять на развитие эпидемического и тяжесть инфекционного процесса.
Разработка набора реагентов для проведения мультилокусной ПЦР с электрофоретическим учетом результатов для определения эпидемического потенциала генетически измененных штаммов на основе структуры VSP-II
Основным итогом исследований, представленным в первом разделе экспериментальной части данной работы, является обнаружение различий в структуре двух важнейших для жизнеобеспечения и вирулентности участков ДНК (острова пандемичности VSP-II и острова патогенности VPI-1) между штаммами V. cholerae биовара Эль Тор, занесенными на территорию Российской Федерации в разные периоды текущей пандемии холеры. Было установлено, что разные штаммы содержат три разных типа VSP-II: интактный, содержащий короткую делецию и VSP-II с протяженной делецией. Интактный VSP-II присутствовал в хромосоме всех исследованных типичных штаммов возбудителя, изолированных в начальный период пандемии (1970), а также в 1990 г. Что касается геновариантов, то они отличались друг от друга по структуре VSP-II и входили в состав двух основных групп. Первая группа (63% от числа исследованных) включала измененные штаммы, выделенные в ранний период их возникновения (1993-1994, 1998-2001 гг.) и содержащие, как типичные изоляты, интактный VSP-II. Вторая группа (27% от числа исследованных) состояла из изолятов, занесенных в различные регионы РФ лишь в последнее десятилетие (2004-2012 гг.), и отличалась от изолятов первой группы присутствием VSP-II, с протяженной делецией. Потеря значительной части VSP-II явилась, видимо, следствием адаптивных изменений возбудителя в естественных популяциях в ответ на различные климатические и антропогенные воздействия и которые обеспечили селективные преимущества таким клонам, что отразилось на их эпидемическом потенциале. Об этом свидетельствует тот факт, что в современный период пандемии именно такие геноваринты за счет высокого эпидемического потенциала широко распространились в эндемичных по холере регионах. Ввиду таких событий, протяженная делеция в VSP-II может служить в качестве генетического маркера штаммов геновариантов с высоким Ill эпидемическим потенциалом. Обнаружение таких штаммов на территории Российской Федерации в последнее десятилетие может служить дополнительным подтверждением их глобального распространения в мире. Второй значимый, на наш взгляд, результат – обнаружение у геновариантов изменений нуклеотидной последовательности гена tcpA, входящего в состав острова патогенности VPI-1 и кодирующего основной белок токсин-корегулируемых пилей адгезии, являющихся одним из ключевых факторов вирулентности. Наши исследования показали, что мутации в гене tcpA (однонуклеотидные замены и инсерция) были найдены лишь у геновариантов, изолированных в более поздний период их формирования (1997-2012 гг.). При этом возникновение точковых мутаций в гене tcpA геновариантов в большинстве случаев сопровождалось делецией генов их острова пандемичности VSP-II. Возникшие мутации как в регулирующем (промоторная область) так и в кодирующем регионе гена tcpA могут быть причиной повышенной транскрипции гена tcpA, хотя однозначной оценки их роли в этом процессе пока нет (Grim C.J. et al., 2010b; Son M.S. et al., 2011). Вместе с тем, принимая во внимание тот факт, что такие изменения в гене tcpA несут все исследованные штаммы, выделенные от больных с тяжелой формой холеры во время эпидемий в Бангладеш (2001-2005 гг.) и Гаити (2010 гг.), следует полагать, что указанные мутации действительно играют существенную роль в обеспечении высокого уровня вирулентности штаммов.
Сравнительный анализ молекулярно-биологических свойств геновариантов, выделенных в разные временные периоды, позволяет представить следующую динамику изменения генетических свойств возбудителя холеры Эль Тор в современный период. После приобретения типичными штаммами нового генетического материала (гена ctxB1 V. cholerae классического биовара) через горизонтальный перенос последующие этапы микроэволюции могли быть связаны с изменением генома уже возникших высокопатогенных геновариантов. Сначала появляются точковые мутации в регуляторной области гена tcpA из острова патогенности VPI-1. При этом в ряде случаев возникновение указанных мутаций сопровождается утратой 112 небольшого участка ДНК (4 гена) острова пандемичности VSP-II. Следующий этап – изменение у этих вариантов кодирующей области гена tcpA и потеря большого сегмента ДНК, в состав которого входит почти 70% генов VSP-II. Такие геномные перестройки могли обусловить функциональные изменения, важные для проявления вирулентных свойств и обеспечения высокого уровня адаптации к окружающей среде. Эти результаты могут свидетельствовать о том, что недавно возникшие геноварианты, несущие дополнительные мутации в указанных участках ДНК, приобрели новые селективные преимущества, за счет которых произошло вытеснение ими ранее сформированных геновариантов, несущих лишь измененный профаг СТХ с геном ctxB1. Это подтверждается преимущественным выделением таких штаммов от больных холерой во многих регионах мира в современный период пандемии (Salim A. et al., 2005; Faruque S.M. et al., 2007; Safa A. et al., 2008; Kumar P. et al., 2009; Taneja N. et al., 2009; Safa A. et al., 2010).
Вместе с тем, следует подчеркнуть, что, несмотря на генетическое
разнообразие вирулентных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор, текущая пандемия холеры вызвана штаммами, принадлежащими к одному монофилетическому кладу, обозначенному как клад 7-ой пандемии (7Р клад). Такой вывод сделан при сравнении нуклеотидных последовательностей полных геномов около 30 штаммов V. cholerae, принадлежащих к разным серогруппам и изолированным в последние 100 лет из разных источников и географических регионов (Кулешов К.В. и др., 2013; Chun J. et al., 2009; Banerjee R. et al., 2014).
Выявление штаммов, несущих различные мутации в VSP-II и VPI-1, открывает перспективу более точного определения их роли в патогенезе холеры, а также в повышении эпидемического потенциала. В частности, перспективным является дальнейшее изучение экспрессии не только измененных структурных генов, но и определение активности регуляторных генов методом обратной транскрипции с использованием ПЦР в режиме реального времени.
Полученная нами новая информация о структуре участков генома штаммов геновариантов, связанных с вирулентностью и эпидемическим потенциалом, может быть использована в решении ряда прикладных вопросов. Во-первых, выявленные генетические различия между занесенными на территорию России штаммами могут служить в качестве генетических маркеров при расследовании вспышек холеры и определение происхождения занесенного штамма. Во-вторых, обнаруженные молекулярно-генетические особенности исследованных штаммов геновариантов были использованы нами при разработке новой мультилокусной диагностической ПЦР тест-системы, позволяющей дифференцировать выделяемые штаммы геновариантов с разным эпидемическим потенциалом на основе выявления структуры их острова пандемичности VSP-II. Эта ПЦР тест-система прошла лабораторные испытания, и результаты комиссионного учета результатов подтвердили ее высокую (100%) специфичность и эффективность.
Второе направление нашей работы было связано с разработкой алгоритма расширенной идентификации токсигенных генетически измененных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор, основанного на комплексном использовании диагностически значимых фенотипических и молекулярно-биологических свойств возбудителя. Алгоритм включает четыре этапа: 1) определение серогруппы, серовара и биовара выделяемых изолятов на основе его фенотипических свойств; 2) подтверждение серогруппы и биовара изолята и определение его принадлежности к генетически измененным штаммам возбудителя холеры Эль Тор методом мультиплексной ПЦР; 3) дифференциация геновариантов возбудителя с разным эпидемическим потенциалом на основе анализа структуры их острова VSP-II с помощью мультилокусной ПЦР; 4) выявление полиморфизма генов ctxB и tcpA методом секвенирования. Разработанный алгоритм, предназначеный для специалистов Национальных центров верификации диагностической деятельности, а также государственных коллекций Роспотребнадзора, может обеспечить получение стандартизированных расширенных молекулярно-биологических свойств штаммов холерных вибрионов, выделенных от больных холерой или из разных объектов окружающей среды на территории России, которые необходимо учитывать при проведении противоэпидемических мероприятий.
