Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Полиморфные маркеры 9
1.1.1. Типы полиморфизмов и методы их исследования 9
1.1.2. Использование полиморфных маркеров в исследовании генетики многофакторных заболеваний 16
1.2. Ишемическая болезнь сердца: общая характеристика заболевания 19
1.2.1. Основные аспекты этиологии и патогенеза ИБС 19
1.2.2. Генетические факторы риска ИБС 22
1.3. Характеристика исследованных в работе генов и полиморфных маркеров 38
1.3.1. Рецептор, активируемый пролифератором пероксисом типа (PPARG3) 38
1.3.2. Коактиватор 1а рецептора, активируемого пролифератором пероксисом типа у (PPARGC1A) 39
1.3.3. Рецептор, активируемый пролифератором пероксисом типа 5 (PPARD) 40
1.3.4; Адренорецепторы pi, р2 {ADRB1, ADRB2) 41
1.3.5. Фермент, превращающий ангиотензин 1 {АСЕ) 43
1.3.6. (33-субъединица G-белка (GNB3) 45
1.3.7. Поли(АДФ-рибоза)-полимераза 1 (ADPRT1) 46
1.3.8. Поли(АДФ-рибоза)-гидролаза (PARG) 48
1.3.9. а-субъединица цитохрома b(-245) (CYBA) 48
2. Материалы и методы 50
2.1. Реактивы и ферменты 50
2.2. Буферные растворы 50
2.3. Формирование групп больных и здоровых индивидов 51
2.4. Выделение геномной ДНК человека методом фенол-хлороформной экстракции 51
2.5. Амплификация ДНК 52
2.6. Расщепление продуктов амплификации рестриктазами 54
2.7. Электрофоретическое разделение ДНК 55
2.8. Статистическая обработка результатов 56
2.8.1. Сравнение выборок по частотам аллелей и генотипов 56
2.8.2. Оценка относительного риска. Odds ratio. Доверительный интервал 58
2.8.3. Коррекция уровня значимости 58
3. Результаты и их обсуждение 60
3.1. Общая характеристика исследованных групп 60
3.2. Иследование ассоциации полиморфных маркеров генов-кандидатов с ИБС 61
3.2.1. Исследование ассоциации полиморфного маркера C(-681)G гена PPARG3cHEC 61
3.2.2. Исследование ассоциации полиморфного маркера Gly482Ser гена PPARGC1A с ИБС 62
3.2.3. Исследование ассоциации полиморфного маркера Т(—87)С гена PPARD с ИБС 64
3.2.4. Исследование ассоциации полиморфных маркеров Ser49Gly и Gly389Arg гена ADRB1 с ИБС 65
3.2.5. Исследование ассоциации полиморфных маркеров Glyl6Arg и GluHGln reuaADRB2 с ИБС 68
3.2.6. Исследование ассоциации полиморфного маркера G7831A гена АСЕ сИБС 70
3.2.7. Исследование ассоциации полиморфных маркеров Leu54Phe и Val762Ala гена ADPRT1 с ИБС 72
3.2.8. Исследование ассоциации полиморфного маркера A(~431)G гена PARGcUBC 75
3.2.9. Исследование ассоциации полиморфного маркера С242Тгена CYBA сИБС 76
3.2.10. Исследование ассоциации полиморфного маркера С825Тгена СЛШсИБС 77
3.3. Коррекция уровней значимости 79
Заключение 81
Выводы 82
Список литературы
- Использование полиморфных маркеров в исследовании генетики многофакторных заболеваний
- Формирование групп больных и здоровых индивидов
- Исследование ассоциации полиморфного маркера Gly482Ser гена PPARGC1A с ИБС
- Исследование ассоциации полиморфного маркера G7831A гена АСЕ сИБС
Введение к работе
В настоящее время сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной инвалидности и смертности в экономически развитых странах, при этом на долю ишемической болезни сердца (ИБС) и инфаркта миокарда приходится примерно две трети случаев смерти от сердечнососудистых заболеваний.
Известно, что данные сердечно-сосудистые патологии являются многофакторными заболеваниями с многочисленными звеньями патогенеза. Для таких заболеваний характерен сложный механизм формирования фенотипа, в основе которого лежит взаимодействие генетических факторов с факторами внешней среды. Исходя из современных представлений о механизмах развития ИБС, можно выделить группы так называемых генов-кандидатов, продукты которых могут быть прямо или косвенно вовлечены в развитие данной патологии.
Так как атеросклероз является основным этиологическим фактором ишемической болезни сердца, к генам-кандидатам, определяющим развитие ИБС и ее осложнений, можно отнести группу генов системы антиокислительной защиты, генов системы репарации ДНК и генов, кодирующих адренорецепторы и рецепторы, активируемые пролифераторами пероксисом. Современная стратегия исследования генетической составляющей многофакторных заболеваний включает в себя поиск полиморфных маркеров в генах-кандидатах и оценку их ассоциации с заболеванием.
Установление ассоциации гена с заболеванием и последующая оценка индивидуального генетического риска имеют важное значение для разработки дифференцированного подхода к профилактике и лечению данной патологии и ее осложнений в зависимости от наследственной предрасположенности конкретного пациента. Поэтому в настоящее время одним из наиболее прогрессивных подходов является разработка стратегии ранней диагностики, прогнозирования и превентивной терапии заболевания с использованием генетических маркеров.
Цели и задачи работы
Целью данной работы было изучение ассоциации полиморфных маркеров ряда генов-кандидатов с развитием ишемической болезни сердца.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Определить частоты аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов, кодирующих рецептор, активируемый пролифератором пероксисом типа уЗ (PPARG3), коактиватор 1а рецептора, активируемого пролифератором пероксисом типа у (PPARGC1A), рецептор, активируемый пролифератором пероксисом типа 5 (PPARD), адренорецепторы (31, (32 (ADRBI, ADRB2), фермент, превращающий ангиотензин I (АСЕ), (33 -субъединицу G-белка (GNB3), поли(АДФ-рибоза)-полимеразу 1 (ADPRT1), поли(АДФ-рибоза)-гидролазу (PARG) и а-субъединицу цитохрома Ь(—245) (CYBA) в группе больных ишемической болезнью сердца и группе здоровых индивидов среди русских г. Москвы.
2. Провести сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов полиморфных маркеров данных генов-кандидатов в исследованных выборках больных и здоровых индивидов для выявления ассоциации изученных маркеров с развитием болезни и определения вклада данных генов в наследственную предрасположенность к патологии.
Научная новизна и практическая значимость работы В данной работе впервые исследована ассоциация полиморфных маркеров C(-681)G гена PPARG3, Gly482Ser гена PPARGC1A, Т(-87)С гена PPARD, Ser49Gly и Gly389Arg гена ADRBI, Glyl6Arg и Glu27Gln гена ADRB2, G7831A гена АСЕ, С825Т гена GNB3, Leu64Phe и Val762Ala гена ADPRT1, A(-431)G гена PARG и Tyr72His гена CYBA с ишемической болезнью сердца (ИБС). Обнаружена ассоциация полиморфного маркера Tyr72His гена CYBA с развитием ИБС. Установлено, что носители генотипа Туг/Туг данного полиморфного маркера имеют повышенный риск развития ИБС, тогда как носители генотипа His/His имеют пониженный риск развития ИБС. Обнаружена ассоциация полиморфного маркера С825Т гена GNB3 с развитием ИБС. Установлено, что носители аллеля С и генотипа СС данного полиморфного маркера имеют повышенный риск развития ИБС. Обнаружена ассоциация полиморфного маркера Т(-87)С гена PPARD с развитием ИБС. Установлено, что носители аллеля С и генотипа СС данного полиморфного маркера имеют повышенный риск развития ИБС. Все вышеизложенные результаты получены впервые.
Показано, что исследованные полиморфные маркеры генов CYBA, GNB3 и PPARD могут использоваться для прогноза течения заболевания у больных с ИБС. Выявление ассоциации полиморфных маркеров генов CYBA, GNB3 и PPARD с развитием ИБС открывает новые перспективы в выделении групп пациентов с высоким риском развития патологии.
Использование полиморфных маркеров в исследовании генетики многофакторных заболеваний
Изучение наследственной предрасположенности к многофакторным заболеваниям крайне важно для их диагностики и терапии. Для оценки роли наследственных факторов в развитии многофакторного заболевания, как правило, используют анализ сцепления, анализ ассоциации или экспериментальные модели развития заболевания.на животных [1].
Большую практическую ценность представляет исследование полиморфных маркеров в генах-кандидатах, продукты которых вовлечены в патогенез многофакторного заболевания [1].
Анализ сцепления основан на определении вероятности совместного наследования фенотипического признака (заболевания) и исследуемого маркера в семье. При этом исследуют совместную сегрегацию генов при передаче от родителей к потомкам в ряду поколений [1].
При использовании метода идентичных по происхождению аллелей (IBD, identical by descent) информацию о сцеплении получают в результате анализа наследования маркеров в парах больных родственников без предварительного выбора типа наследования и других характеристик. Данный подход заключается в оценке того, насколько чаще по сравнению со случайной сегрегацией пара больных родственников (чаще всего для анализа используют сибсовые пары) наследует один и тот же аллель. Анализ сцепления может проводиться с исследованием как ядерных (оба сибса больны), так и простых (один сибс болен, а один здоров) семей. При этом оцениваются шансы (вероятности) за и против сцепления в данной семье. Количественным показателем сцепления является логарифм соотношения шансов (правдоподобия) за и против сцепления - лод-балл (от английского «logarithm of odds ratio»). Сцепление считается подтвержденным, если лод-балл превысит значение 3.0 (т.е. вероятность совместного наследования признака и маркера в 1000 раз больше, нежели вероятность их раздельного наследования). Если ни на одной из проанализированных семей не обнаруживается статистически значимое сцепление, лод-балл рассчитывают, используя суммарные данные для нескольких семей. При этом необходим тщательный отбор семей из общей группы по фенотипическим признакам, позволяющих объединить их в одну подгруппу [1].
В настоящее время активно используют мультилокусный анализ сцепления, при котором рассчитывается соотношение вероятностей для каждого интервала между двумя соседними из десятков и сотен полиморфных маркеров, распределенных по всему геному. Интервалы, для которых значения лод-балла превышают 3.0, считают наиболее вероятными областями локализации гена, ассоциированного с конкретной патологией [1].
Наряду с анализом сцепления, при использовании которого необходимы полные семьи с двумя сибсами, в методе неравновесной передачи аллелей (TDT, transmission disequilibrium test) могут использоваться семьи с единственным потомком. Этот метод основан на анализе частот передачи аллелей полиморфных маркеров, расположенных в интересующей исследователя области генома, от гетерозиготных по данному маркеру родителей к больному потомку. Для сравнения используют аналогичные гетерозиготные семьи, но со здоровым потомком [11].
Как правило, анализ ассоциации между генетическими маркерами и многофакторными заболеваниями проводятся с использованием метода «случай-контроль» (case-control). При этом проводят анализ распределения аллелей и генотипов-исследуемого генетического маркера в выборке из неродственных здоровых лиц. (популяционньтй контроль) и в группе больных (группа «случай») с тем, чтобы выявить значимые различия в частоте генетического маркера (аллеля). Генетический маркер считается ассоциированным с болезнью, если его частота среди больных значимо выше, нежели в контрольной выборке. Наличие ассоциации либо свидетельствует о прямой связи между исследованным локусом и наследственной патологией, либо в основе ассоциации может лежать неравновесное сцепление между маркерным локусом и локусом, обуславливающим развитие болезни, если эти локусы расположены достаточно близко друг от друга [1].
Ассоциация может оказаться мнимой за счет негомогенности популяции, малочисленности выборок и некорректности критериев отбора при формировании выборок больных и здоровых индивидов. Нежелательных эффектов, связанных с этнической неоднородностью популяции, можно избежать, проводя анализ ассоциации в гомогенных изолированных популяциях. Так же, для увеличения достоверности ассоциации желательно проводить исследование на достаточно большой панмиксной популяции. Группы сравнения должны быть правильно подобраны и хорошо охарактеризованы клинически и биохимически. Необходимо, чтобы они были гомогенны по негенетическим факторам риска [1].
Метод поиска ассоциации между полиморфизмом определенных локусов генов-кандидатов и клиническим проявлением заболевания - это единственно возможная стратегия генетического анализа при отсутствии семейного материала [1].
Формирование групп больных и здоровых индивидов
Изучение ассоциации полиморфных маркеров генов-кандидатов с ИБС проводили, используя две группы пациентов. В исследование включались пациенты с ИБС, поступившие в стационар Городской клинической больницы (ГКБ) № 51. Диагноз ставили на основании клинических и биохимических исследований и данных коронароангиографии. У части больных ИБС был диагностирован инфаркт миокарда (ИМ).
Контрольная группа представляла собой случайную выборку пациентов, имеющих аналогичный профиль основных факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний, у которых проведенная эхо- и электрокардиография не выявила достоверных признаков ИБС. Выборки были этнически однородны и составлены из русских (на основании паспортных данных), проживающих в г. Москве. 200 мкл венозной крови человека смешивали с равным объемом лизирующего буфера (10 мМ Трис-НСІ (рН = 8,0), 0,32 М сахароза, 10 мМ ЭДТА, 100 мМ NaCl, 0,1%-ный тритон Х-100), добавляли ДТТ, ДСН и протеиназу К в конечной концентрации 0,2%, 40 мМ и 20 мкг/мл соответственно и инкубировали либо при 37 С в течение ночи, либо 2 ч при 60С. Затем последовательно обрабатывали фенолом, смесью фенол/хлороформ (1:1) и хлороформом (дважды на каждой стадии). ДНК осаждали добавлением 1 мл 96%-ного этанола в присутствии 0,3 М ацетата натрия и дрожжевой тРНК (10 мкг/мл) с последующей инкубацией при -70С. Осадок ДНК промывали 80%-ным этанолом, сушили на воздухе и растворяли в 30 мкл бидистиллированной воды. Препараты ДНК хранили при -70С.
ПЦР проводили на амплификаторе РНС-2 ("Techne", Великобритания) или "Терцик" ("ДНК- Технология", Москва) в 50 мкл реакционной смеси, содержащей буфер 1 или 2, 0,2 мМ каждого dNTP, по 10 пикомолей каждого из праймеров, 10-100 нг геномной ДНК и 2,0 ед. ДНК-полимеразы Taq. Буфер 1 включал 67 мМ Трис-НС1 (рН = 8,8), 16,6 тМ сульфат аммония и 0,1%-ный твин-20. Концентрацию хлорида магния варьировали в зависимости от амлифицируемого локуса. Буфер 2 содержал 100 мМ Трис-HCl (рН 8,8), 500 мМ КС1 и 25 мМ MgCk При необходимости в реакционную смесь вносили ДМСО в конечной концентрации 10%.
На начальной стадии ПЦР денатурировали ДНК при 94С в течение 1 мин, на конечной - проводили синтез второй цепи при 72С в течение 2 мин. В промежутке между данными стадиями осуществляли 30-35 циклов ПЦР в зависимости от локуса и количества исходной ДНК по трехступенчатой программе, включающей денатурацию ДНК (94 С/10 с), отжиг праймеров в течение 30 с и синтез второй цепи (72С/30 с).
Температуру отжига праймеров варьировали в зависимости от амлифицируемого локуса. Условия ПЦР и последовательности праймеров для амплификации исследованных локусов приведены в таблице 1.
Анализ генотипов полиморфных маркеров ряда генов проводили, обрабатывая соответствующими рестриктазами продукты ПЦР, содержащие полиморфный участок. Условия рестрикции приведены в таблице 2. К 15 мкл амплифицированного фрагмента ДНК добавляли 2 мкл 10-кратного буфера, 2 мкл БСА (I мг/мл) и 2-3 ед. фермента.
Фрагменты ДНК после рестрикции разделяли в агарозном или полиакриламидном гелях (ПААГ). Электрофорез в 2%-ном агарозном геле проводили в горизонтальной камере с использованием в качестве электродного буфера IxTAE при напряженности поля 8 В/см. По окончании электрофореза гели окрашивали бромистым этидием (0,5 мкг/мл) и просматривали в ультрафиолетовом свете при длине волны 254 нм.
Разделение ДНК в ПААГ осуществляли в вертикальной камере с использованием в качестве электродного буфера ІхТВЕ при напряженности поля 15 В/см. В зависимости от размера разделяемых фрагментов использовали 8 и 12%-ные гели, содержащие 7%-ный глицерин, длиной 12, 18 и 20 см и толщиной 0,7см при соотношении акриламид/бисакриламид 29:1.
В лунки геля наносили по 10-15 мкл анализируемой ДНК и 0,4-0,5 мкг маркерной ДНК. В качестве последней использовали pBR322/Mspl, pBRmiAlu\ npUC\9IMsp\.
Условия электрофоретического разделения приведены в таблице 3. ПААГ окрашивали азотнокислым серебром. Гель выдерживали в течение 5 мин в 10%-ном этаноле, промывали дистиллированной водой, затем в течение 3 мин обрабатывали 1%-ной азотной кислотой и вновь ополаскивали водой. Далее гель инкубировали в течение 20 мин в 12мМ нитрате серебра (в темноте при непрерывном встряхивании), промывали водой и проявляли в растворе, содержащем 0,28М карбонат натрия и 0,02%-ный формальдегид (при непрерывном встряхивании). Реакцию останавливали, помещая гель на 5 мин в 10%-ную уксусную кислоту. После промывки водой гель сушили в течение 45-60 мин под вакуумом при 80С на приборе GelDryer Model 543 («Bio-Rad Laboratories», США).
Исследование ассоциации полиморфного маркера Gly482Ser гена PPARGC1A с ИБС
В результате амплификации участка ДИК, содержащего данный полиморфный участок, получали фрагмент размером 268 п.н. Аллели полиморфного маркера идентифицировали после расщепления амплифицированного фрагмента рестриктазой НраІІ. Фрагмент ДНК, содержащий аллель Ser остается нерасщепленным, а фрагмент, содержащий аллель Gly расщепляется с образованием фрагментов 151 и 117 п.н.
Ряд новых исследований показал ассоциацию этого полиморфизма с сердечно сосудистыми патологиями при сахарном диабете типа 2 [126] и гипертонией [127, 128]. Данные по изучению ассоциации этого полиморфного маркера с ИБС отсутствуют.
В нашей работе при исследовании распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера Gly482Ser гена PPARGC1A в группах "ИБС+" и "ИБС-" статистически достоверных различий получено не было (табл. 6). Таким образом, полиморфный маркер Gly482Ser гена PPARGC1A не ассоциирован с развитием ИБС у русских г. Москвы.
В гене PPARD обнаружен ряд полиморфизмов, для одного из которых, а именно Т(—87)С, показана ассоциация с сахарным диабетом типа 2 [130], инсулинорезистентностью [131], метаболическим синдромом [132] и уровнем липопротеинов высокой плотности [133].
Полиморфизм Т(—87)С (также известен под обозначением Т294С) находится в промоторной области гена PPARD на расстоянии 87 нуклеотидов от точки инициации трансляции. Было обнаружено, что этот полиморфизм оказывает влияние на связывание транскрипционного фактора Sp-І и аллель С ассоциирован с повышенной транскрипционной активностью [134]. В этом же исследовании было установлено, что аллель С полиморфного маркера Т(-87)С гена PPARD ассоциирован с пониженным уровнем липопротеинов низкой плотности, в то время как другие полиморфные маркеры (С(—409)Т, С73Т и A255G) не показали ассоциации с уровнями липопротеинов высокой и низкой плотности. В связи с этим в нашем исследовании мы анализировали полиморфный маркер Т(-87)С гена PPARD, как наиболее вероятный функционально значимый полиморфизм промоторной области.
В результате амплификации участка ДНК, содержащего данный полиморфный участок, получали фрагмент размером 216 п.н. Аллели полиморфного маркера идентифицировали после расщепления амплифицированного фрагмента рестриктазой Bsc4I. Фрагмент ДНК, содержащий аллель Т остается нерасщепленным, а фрагмент, содержащий аллель С расщепляется с образованием фрагментов 137 и 79 п.н.
При анализе распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера Т(-87)С гена PPARD (табл. 7) были обнаружены статистически достоверные различия. Было показано, что носители аллеля С и генотипа СС имеют повышенный риск развития ИБС (OR = 1,43 и 2,19, соотв.), в то время как носители аллеля Т и генотипа ТС - пониженный риск (OR = 0,28 и 0,70, соотв.).
Таким образом, полиморфный маркер Т(—87)С гена PPARD ассоциирован с развитием ИБС у русских г. Москвы.
Полиморфизмы в гене ADRBJ, который кодирует (31 -рецептор, были обнаружены в 1999 г. [136]. Наиболее изученными являются полиморфные маркеры Ser49Gly и GIy389Arg, так как они имеют удобные для исследований по схеме «случай-контроль» частоты минорных аллелей. Позже были найдены еще 12 однонуклеотидных полиморфизмов, пять из которых приводили к замене аминокислоты в аминокислотной последовательности белка, но так как все эти полиморфизмы обнаружены одной группой исследователей, требуется независимое подтверждение их существования [137].
Было показано, что полиморфизм Ser49Gly, который находится на N-концевом внеклеточном участке рецептора, не оказывает какого-либо эффекта ни на связывание лиганда с рецептором, ни на эффективность связывания с G-белком, но при длительном взаимодействии с агонистами плотность рецепторов с вариантом Ser49 оказывается на 25% выше плотности рецепторов с вариантом 49Gly. Дальнейшие исследования подтвердили, что вариант Ser49 имеет более высокий уровень экспрессии чем 49Gly [138], что безусловно оказывает влияние на степень активации симпатической нервной системы и течение заболеваний, связанных с этим.
В результате амплификации участка ДНК, содержащего данный полиморфный участок, получали фрагмент размером 114 п.н. Аллели полиморфного маркера идентифицировали после расщепления амплифицированного фрагмента рестриктазой НаеШ. Фрагмент ДНК, содержащий аллель Ser остается нерасщепленным, а фрагмент, содержащий аллель Gly расщепляется с образованием фрагментов 87 и 27 п.н.
Аналогичные исследования, проведенные для полиморфизма Gly389Arg, расположенного в области связывания рецептора с G-белком, показали что вариант 389Arg обладает повышенно способностью связываться с G-белками и уровень аденилатциклазы в два раза превышает таковой для варианта Gly389 [139].
Все эти данные позволяют предположить, что полиморфизмы Ser49Gly и Gly389Arg гена ADRB1 имеют функциональную значимость и могут влиять на процессы лиганд-рецепторных взаимодействий в клетке. Был проведен ряд исследований для изучения ассоциации этих полиморфных маркеров с гипертонией [140, 141] и сердечной недостаточностью [142, 143]. К сожалению, полученные данные противоречивы и скудны, что требует более широких исследований этих несомненно интересных полиморфизмов.
Исследование ассоциации полиморфного маркера G7831A гена АСЕ сИБС
Из-за ключевого положения G-белков в системе передачи сигналов, предполагается, что мутации, изменяющие экспрессию или структуру этих белков, вносят свой вклад в большое количество заболеваний. Было найдено большое количество полиморфизмов в генах, кодирующих различные субъединицы G-белков, но наиболее интересным оказался полиморфный маркер С825Т гена GNB3, который кодирует Gp3-субъединицу. Этот полиморфизм расположен в экзоне 10 и связан с альтернативным сплайсингом экзона 9, который приводит к укороченному варианту субъединицы G[33, называемому G33s [164]. Позже были найдены полиморфные маркеры A(—350)G, расположенный в промоторной области гена GNB3, и С1429Т, расположенный в З -нетраслируемой области гена GNB3, но оба они оказались функционально незначимыми [165].
Биохимические исследования доказали, что вариант G33s может образовывать димеры с различными у-субъединицами [166, 167]. Эти исследования таюке подтвердили, что аллель 825Т приводит к образованию варианта GP3s, обладающего повышенной биологической активностью, что значительно усиливает способности образуемых G-белков к передаче сигналов [168, 169]. Все это вместе дает основания рассматривать аллель 825Т полиморфного маркера С825Т гена GNB3 в качестве генетического маркера усиленной сигнальной трансдукции.
К настоящему времени проведено большое количество исследований, посвященных изучения ассоциации полиморфного маркера С825Т гена GNB3 с гипертонией [164, 170, 171], атеросклерозом [172-174] и ИБС [175, 176]. Данные этих исследований носят противоречивый характер и сравнение их затруднено в силу различных подходов к формированию выборок, этнических неоднородностей и методов обработки результатов, что безусловно потребовало проведения аналогичного исследования в России, которое для полиморфизма С825Т гена GNB3 было проведено впервые.
В результате амплификации участка ДНК, содержащего данный полиморфный участок, получали фрагмент размером 260 п.н. Аллели полиморфного маркера идентифицировали после расщепления амплифицированного фрагмента рестриктазой Rsal. Фрагмент ДНК, содержащий аллель Г остается нерасщепленным, а фрагмент, содержащий аллель С расщепляется с образованием фрагментов 163 и 97 п.н.
При анализе распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера С825Т гена GNB3 (табл. 17) были обнаружены статистически достоверные различия. Было показано, что носители аллеля С и генотипа СС имеют повышенный риск развития ИБС (OR = 1,55 и 1,63, соотв.), в то время как носители аллеля Т- пониженный риск (OR = 0,65).
Таким образом, полиморфный маркер С825Т гена GNB3 ассоциирован с развитием ИБС у русских г. Москвы.
Классическим взглядом на проблему множественных сравнений является необходимость корректировать рассчитанный уровень значимости для того, чтобы уменьшить вероятность обнаружения несуществующей статистически значимой ассоциации. Этот взгляд основан на мнении, что если проводить достаточно много статистических тестов, то рано или поздно будет обнаружен ложноположительный результат, даже если реальная ассоциация в этом случае отсутствует. Вероятность ошибочного обнаружения статистически значимых различий . называется ошибкой первого рода. Коррекция уровней значимости позволяет снизить вероятность совершения ошибки первого рода, но может увеличить вероятность совершения ошибки второго рода -ошибочного отвержения статистически значимых различий. С момента своего зарождения в 1920-х гг. (Нейман и Пирсон) методы коррекции результатов множественных сравнении интенсивно развивались и в настоящее время позволяют минимизировать риск ошибки второго рода. Тем не менее, остается немало вопросов практического применения этих методов. Неясно, что необходимо включать в набор тестов, требующих коррекции уровней значимости - должен ли набор включать выполненные, но неопубликованные данные или данные мета-анализа, должны ли будущие работы учитывать результаты предыдущих и т.д. Общепринятой точкой зрения в настоящее время является необходимость коррекции уровней значимости, полученных в рамках одного исследования.
